Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Eric Ubil blev delvist finansieret af American Cancer Society postdoc Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Arbejdet blev støttet af et stipendium fra NIH (R01-CA205398) og en fond for forskning i bryst cancer (BCRF-18-041) til HSE.

Alle procedurer i forbindelse med høst og brug af murine peritonealdialyse makrofager blev udført på University of North Carolina på Chapel Hill (UNC) og blev godkendt af UNC institutionel Animal Care og use Committee (IACUC).
1. makrofag kultur
Bemærk: denne procedure kan udnytte primære peritoneale makrofager (beskrevet i detaljer nedenfor), knoglemarv-afledte makrofager, eller makrofag cellelinjer såsom J774 (ATCC) eller RAW264 (ATCC).
<ol><li>Høst peri...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors.">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li><li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages:+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth.">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li><li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

Co-kultur assay præsenteret her er en ændring af tidligere etablerede assays, der giver mulighed for studiet af tumor-udskilt faktorer på immuncelle aktivering. Mens celle-celle kontakt er kendt for at fremkalde ændringer i immunaktivitet, evnen af tumor-udskilt ligander at moduere immun aktivering er mindre godt forstået. Vi beskriver en metode, der i modsætning til direkte Co-kultur, kan bruges til at afhøre hvordan tumor-afledte udskilt faktorer påvirker immuncelle aktivering uden forstyrrende karakter af kont...

Nylige undersøgelser har fokuseret på kræftcellernes evne til at undgå påvisning af immunceller, undertrykke lokal immun aktivering eller til at producere en tolerogenic tumor-eftergivende Milieu i Tumorens mikromiljø. To brede klasser af tumor og immuncelle interaktioner er blevet beskrevet, at lette disse virkninger: kontakt-medierede interaktioner eller tumor-udskilt ligands. En af de mest velunder søgt og klinisk Tractable mekanismer af kontakt-medieret immunhæmning udnyttet af tumorer er udtryk for PD-L1, som interagerer med PD-1 på T-celler til at hæmme deres aktivering og funktion1,2. Som respons på interferon-gamma (IFNγ), som udtrykkes af en række aktiverede immunceller, kan tumorceller øge ekspression af PD-L1 for at fremkalde udmattelse af PD-1-udtrykte aktiverede T-celler og derved forhindre dem i effektivt at udrydde tumorceller3. Brugen af antistoffer til at blokere interaktionen mellem PD-L1 og PD-1 anvendes i øjeblikket til at behandle flere kræfttyper hos mennesker4. I lyset af denne kliniske succes og andre, identifikation og målretning af tumor-afledte Immunsuppressive mekanismer har fået stigende opmærksomhed.
Ud over undertrykkelse af adaptive immunitet, tumorer er også kendt for at udskilte faktorer, der undertrykker den pro-inflammatoriske respons af medfødte immunceller. Tumor-afledte eller tumor-induceret sekreter, herunder Il-6, IL-10, VEGF, Il-23, og kolonistimulerende faktor (CSF-1), har vist sig at hæmme antitumor respons af naturlige Killer (NK) celler, granulocytter, og dendritiske celler i tumor mikromiljø5,6,7. Tumorceller kan også udskiller faktorer, der skæv rekruttering og differentiering af myeloid-afledte celler i tumor mikromiljø til at fremme undertrykkelse af T-celle aktivering8,9.
En type af medfødte immunceller, der har en dybtgående effekt på tumorprogression er makrofag. I mange år, tilstedeværelsen af tumor-associerede makrofager (TAMs) er blevet brugt som en negativ prognose af patientens overlevelse10. Konceptet om, at Immunsuppressive TAMs dæmper immuncelle-medieret clearance af tumorer blev introduceret mere end 40 år siden11. For nylig har det vist sig, at makrofag Pro-inflammatorisk respons kan nedreguleres, mens en Pro-tumor fænotype kan induceres i tumor mikromiljø. Disse Immunsuppressive makrofager kan bidrage til en tolerogenic respons, kørsel tumorprogression og resistens over for kemo-og immunterapi12. I betragtning af at makrofager er ofte en af de mest rigelige leukocytter med tumoren, restaurering af deres tumor-specifikke immunaktivitet repræsenterer et potentielt mål for anticancer Therapeutics13.
Mens kontakt medierede interaktioner mellem tumorceller og makrofager kan modelleret gennem direkte coculture, kan brugen af gennemtrængelig membran understøtninger belyse, hvilke tumor-udskilt faktorer er immunmodulerende uden potentielt forstyrrende indflydelse af tumor-immuncelle-celle kontakt. Ved hjælp af noget lignende metoder, andre har demonstreret potentialet for at identificere udskillede faktorer i microglia/neuronal interaktioner14 samt tumorceller med mesotheliale celler15. Vi har også med held brugt denne Co-kultur teknik til at karakterisere rollen som en tumor-udskillet protein, Pros1, som en suppressor af Pro-inflammatorisk genekspression efter stimulering af peritonealdialyse makrofager med LPS og interferon-gamma16. Her beskriver vi en enkel metode, der kan bruges til at afhøre hvordan tumor-udskillede faktorer kan påvirke makrofag aktivering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

Tumor-afledte paracrine signalering er en overset komponent af lokale immunsuppression og kan føre til en eftergivende miljø for fortsat kræft vækst og metastase. Paracrine signaler kan involvere celle-celle kontakt mellem forskellige celletyper, såsom PD-L1 udtrykt på overfladen af tumorer interagere direkte med PD-1 på overfladen af T-celler, eller sekretionen af ligander af en tumor celle til at påvirke en immuncelle. Her beskriver vi en co-kultur metode til at afhøre virkningerne af tumor-udskilt ligander på immuncelle (macrophage) aktivering. Denne enkle procedure udnytter kommercielt tilgængelige 0,4 μm polycarbonat membran gennemtrængelig understøtninger og standard vævskultur plader. I den beskrevne proces dyrkes makrofager i det øvre kammer og tumorcellerne i det nedre kammer. Tilstedeværelsen af 0,4 μm barrieren giver mulighed for studiet af intercellulære signalering uden den forstyrrende variabel af fysisk kontakt, fordi de to celletyper deler det samme medium og eksponering for paracrine ligands. Denne tilgang kan kombineres med andre, såsom genetiske ændringer af makrofag (f. eks isolation fra genetiske knock-out mus) eller tumor (f. eks, CRISPR-medierede ændringer) for at studere rollen af specifikke udskillede faktorer og receptorer. Tilgangen egner sig også til standard molekylære biologiske analyser, såsom kvantitativ reverse transkriptionspolymerasekæde reaktion (qRT-PCR) eller Western blot-analyse, uden behov for flow sortering for at adskille de to cellepopulationer. Enzym-sammenkædede immunosorbent assays (Elisas) kan ligeledes udnyttes til at måle udskillede ligander for bedre at forstå den dynamiske interaktion af celle signalering i flere celletype kontekst. Samkulturens varighed kan også varieres for studiet af tids regulerede begivenheder. Denne Co-kultur metode er et robust værktøj, der letter studiet af tumor-udskilt signaler i immun sammenhæng.

For at bestemme effekten af tumor-udskillede ligander på makrofag polarisering, den beskrevne procedure blev udnyttet. Peritoneal makrofager, der dyrkes i fravær af tumorceller, blev anvendt som negative (ubehandlet = længst til venstre) og positiv (IFNγ og LPS stimuleret = 2nd fra venstre) Kontroller (figur 2a). Alternativt blev peritonealdialyse makrofager Co-dyrket med B16F10 melanom tumorceller (ATCC) (figur 1a). Umiddelbart efter plating blev...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Her præsenterer vi en metode ved hjælp af gennemtrængelig membran understøtninger til at lette studiet af ikke-kontakt paracrine signalering anvendes af tumorceller til at undertrykke immunresponset. Systemet er modtagelig for at studere rollen som tumor-udskillede faktorer i dæmpning makrofag aktivering.

Undersøgelse af virkningerne af tumor-Udskillede paracrine Ligands på makrofag aktivering ved hjælp af co-kultur med permeable membran støtter

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Denne Transwell co-kultur metode bruges til at studere parakrine signalering bruges af tumorceller til at undertrykke immunrespons. Denne metode kan bruges til at opdage nye hemmelige ligander, samt den mekanistiske grundlag for deres immun undertrykkende virkninger. Vi har tidligere brugt denne metode til at vise, hvordan tumor-udskilles faktorer kan dæmpe makrofag pro-inflammatorisk gen transskription.Vi mener, at dette værktøj har vidtrækkende konsekvenser i studiet af tumor-afledt immun undertrykkelse. En af de vigtigste fordele ved denne teknik er, at det kan bruges til at studere parakrine signalering mellem tumorceller og immunceller uden potentielt confounding variabel af celle-til-celle kontakt. Denne platform er også modtagelig for en række molekylære biologiske teknikker til downstream analyse.Efter høst peritoneal makrofager, plade dem direkte ind i de øverste kamre i en 0,4 mikrometer polyester membran indsætte co-kultur seks-godt plade. Derefter tilsættes suppleret DMEM til brønden, således at det øverste kammer indeholder en milliliter og det nederste kammer indeholder 1,5 milliliter. Inkuberes i tre dage ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Første, kultur kommercielt tilgængelige tumorceller i deres respektive medium, efter ATCC anbefalede væv kultur metoder. Vask derefter de klæbende tumorceller én gang med PBS. Tilføj 0,05% trypsin i EDTA og inkubere ved 37 grader Celsius, indtil cellerne løsne.Derefter re-suspendere cellerne i medier, der indeholder FBS. Brug et hæmocytometer eller celletæller til at kvantgøre det samlede antal celler og centrifuge ved 220 gange G i fem minutter for at pelletere. Under centrifugering, aspirere mediet fra de øvre og nedre kamre i makrofaget indeholder permeable membran støtte plader og erstatte med frisk medium.For de nederste kamre, hvor tumorceller vil blive belagt, fyldes med en milliliter medium i stedet for 1,5 milliliter til at forlade tilstrækkelig volumen til celletilsætning. Når centrifugering er færdig, aspirere mediet fra de pelleterede tumorceller og re-suspendere cellerne i suppleret DMEM i en koncentration på 300, 000 celler pr. milliliter. Tilsæt 0,5 milliliter af denne celle suspension til det nederste kammer af de ønskede brønde.At fremkalde makrofag proinflammatoriske genekspression, behandles singly eller co-kultiverede makrofager ved at tilsætte interferon gamma ved en koncentration på 100 nanogram pr. milliliter og LPS i en koncentration på 50 nanogram pr. milliliter. Varier varigheden af behandlingstider i kulturen efter behov. Makrofag aktivering sker inden for to timer, og nogle tumor-medieret undertrykkelse sker ved otte timer.Co-kultur i 24 timer giver robust og konsekvent tumor-afledt undertrykkelse. Som en negativ kontrol, kultur makrofager singly og lad ubehandlet. Som en positiv kontrol behandles enkeltkulturerede makrofager med interferongamma og LPS i de samme koncentrationer, der anvendes til prøverne.Når den ønskede inkubationstid er gået, isoleres cellelysatet eller tilstandskulturmedium som ønsket afhængigt af testbehovene. For at isolere cellen lysatet til kvantitativ polymerase kædereaktion analyse, aspirere mediet fra begge kamre i brønden og vask én gang med to milliliter PBS. Anvend RNA lysis buffer på det øverste kammer, der indeholder makrofagerne.Derefter skrabes membranen forsigtigt for at frigive cellen lysate og overføre den til et opsamlingsrør til videre behandling i henhold til RNA-isolationskitproducentens protokol. Den co-kultur metode, der er beskrevet her indebærer kultur makrofager og tumorceller uden fysisk kontakt. Peritoneal makrofager dyrket i mangel af tumorceller anvendes som negative og positive kontroller.Peritoneal makrofag co-dyrket i overværelse af B16F10 tumorceller, men uden at aktivere stimuli ikke øge udtryk for pro-inflammatoriske associerede gener. Dette indebærer, at tumor-udskilles ligander er enten ikke tilstrækkelige til at fremkalde pro-inflammatoriske genekspression af sig selv, eller hvis der er immun aktivering af tumor sekreter, parakrine ligands er tilstrækkelige til at undertrykke det til sit oprindelige niveau. Denne co-kultur metode illustrerer, at når makrofager polariseret af interferon gamma og LPS er dyrket i nærvær af tumorceller, undertrykkelse af inflammation-associerede genekspression blev reduceret med så meget som 60% En sammenlignelig niveau af makrofag pro-inflammatorisk genundertrykkelse er observeret, når murine makrofag celle linje J774 er erstattet af peritoneal makrofager.Tidligere arbejde har identificeret protein S som en tumor-udskilles faktor, der kan hæmme makrofag aktivering, så den gennemtrængelige membran støtte co-kultur model bruges sammen med en lysA at analysere koncentrationen af protein S i konditionerede medier efter 24 timer. I betinget medier fra interferongamma og LPS-behandlede B16F10 melanomceller udtrykkes protein S i en koncentration på ca. 475 nanogram pr. milliliter. Peritoneale makrofager behandlet under de samme betingelser udtrykt protein S på ca 61 nanogram per milliliter.Interessant, når co-kulturperler, koncentrationen af protein S i interferon gamma og LPS-behandlede godt var ca 86 nanogram per milliliter. Dette tyder på, at enten makrofager indtage tumor-udskilles protein S eller at mængden af protein S udskilles af B16F10 celler er væsentligt faldet, når i nærvær af makrofager. Disse resultater fremhæver dybtgående ændringer af makrofag aktivering og parakrine signalering, når makrofager er co-kulturperler med tumorceller.Transwells co-culture-metode kan besvare en række spørgsmål vedrørende parakritiske signalering. Western blot analyse kunne udføres for at bestemme, hvordan tumor-udskilles proteiner ændre forskellige signalering veje i makrofager.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktiske overvejelser i studere metastatisk lunge kolonisering i Osteosarcoma ved hjælp af pulmonale metastaser Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Karakterisering af cellemembranen udvidelser og studere deres roller i kræft celle vedhæftning Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging tilgange til vurderinger af toksikologiske oxidativt Stress ved hjælp af genetisk kodet Fluorogenic sensorer

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Dobbelt virkningerne af melanom celle-afledte faktorer på knoglemarv adipocytter differentiering

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Måling Bone Remodeling og genskabe Tumor-Bone Microenvironment Brug Calvaria Co-kultur og Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studere normale vævs stråling effekter ved hjælp af ekstracellulære matrix Hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering af virkningerne af Migrastatiske hæmmere på 3D tumor Spheroid invasion af høj opløsning Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-kultur af Glioblastoma Stamceller på mønstrede neuroner til at studere migration og cellulære interaktioner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...