Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Eric Ubil werd deels gefinancierd door de American Cancer Society postdoctorale Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Het werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (R01-CA205398) en een borstkanker Research Foundation Award (BCRF-18-041) aan HSE.

Alle procedures met betrekking tot de oogst en het gebruik van Murine peritoneale macrofagen werden uitgevoerd aan de Universiteit van North Carolina op Chapel Hill (UNC) en werden goedgekeurd door het UNC-Comité voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC).
1. macrofaag cultuur
Opmerking: deze procedure kan primaire peritoneale macrofagen gebruiken (in detail hieronder beschreven), macrofagen uit het beenmerg of macrofaag cellijnen zoals J774 (ATCC) of RAW264 (ATCC).</p...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors.">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li><li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages:+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth.">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li><li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

De co-cultuur assay hier gepresenteerd is een modificatie van eerder vastgestelde assays die het mogelijk maakt voor de studie van tumor-uitgescheiden factoren op immuun celactivering. Terwijl cel-cel contact is bekend voor het induceren van veranderingen in de immuunactiviteit, het vermogen van tumor-uitgescheiden liganden te moduleren immuun activering is minder goed begrepen. We beschrijven een methode die, in tegenstelling tot directe co-cultuur, kan worden gebruikt om te ondervragen hoe tumor afkomstige afgescheiden...

Recente studies hebben gericht op het vermogen van kankercellen om detectie door immuuncellen te voorkomen, lokale immuunactivering onderdrukken, of om een tolerogenic tumor-permissieve milieu te produceren in de tumor micro omgeving. Twee brede klassen van tumor en immuuncelinteracties zijn beschreven die deze effecten vergemakkelijken: contact-gemedieerde interacties of tumor-uitgescheiden liganden. Een van de meest goed bestudeerde en klinisch Tractable mechanismen van contact-gemedieerde immuun remming gebruikt door tumoren is de uitdrukking van PD-L1, die samenwerkt met PD-1 op T-cellen voor de remming van hun activering en functie1,2. Als reactie op interferon-gamma (IFNγ), dat wordt uitgedrukt door een aantal geactiveerde immuuncellen, kunnen tumorcellen de expressie van PD-L1 verhogen om de uitputting van PD-1 te induceren-uitdrukken van geactiveerde T-cellen, waardoor ze de tumorcellen effectief uitroeien3. Het gebruik van antilichamen om de interactie tussen PD-L1 en PD-1 te blokkeren wordt momenteel gebruikt voor de behandeling van meerdere soorten kanker bij mensen4. In het licht van dit klinisch succes en anderen, de identificatie en targeting van tumor-afgeleide immunosuppressieve mechanismen heeft steeds meer aandacht gekregen.
Naast onderdrukking van adaptieve immuniteit, tumoren zijn ook bekend om te scheiden van factoren die de pro-inflammatoire reacties van aangeboren immuuncellen onderdrukken. Tumor-afgeleide of tumor-geïnduceerde afscheidingen, met inbegrip van Il-6, Il-10, VEGF, Il-23, en kolonie stimulerende factor (CSF-1), is aangetoond dat de remming van antitumorale reacties van Natural Killer (NK) cellen, Granulocyten, en dendritische cellen in de tumor micro omgeving5,6,7. Tumor cellen kunnen ook het afscheiden van factoren die de werving en differentiatie van myeloïde-afgeleide cellen in de tumor micro omgeving scheeftrekken ter bevordering van de onderdrukking van T-cel activering8,9.
Eén type aangeboren immuuncel die een diepgaand effect heeft op de progressie van de tumor is de macrofaag. Gedurende vele jaren is de aanwezigheid van tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) gebruikt als een negatieve prognose van patiënt overleving10. Het concept dat immunosuppressieve TAMs bevochtigen immuun cel-gemedieerde klaring van tumoren werd geïntroduceerd meer dan 40 jaar geleden11. Meer recentelijk, het is aangetoond dat de macrofaag pro-inflammatoire reactie kan worden gedowngereguleerd terwijl een Pro-tumor fenotype kan worden geïnduceerd in de tumor micro omgeving. Deze immunosuppressieve macrofagen kunnen bijdragen aan een tolerogene respons, het stimuleren van tumorprogressie en resistentie tegen chemo-en immunotherapie12. Gezien het feit dat macrofagen vaak een van de meest voorkomende leukocyten met de tumor, herstel van hun tumor-specifieke immuunactiviteit vertegenwoordigt een potentieel doelwit voor antikanker Therapeutics13.
Terwijl contact-gemedieerde interacties tussen tumorcellen en macrofagen kunnen worden gemodelleerd via directe cocultuur, het gebruik van permeabele membraan ondersteunt kan verhelderen welke tumor-uitgescheiden factoren zijn immunomodulerende zonder de potentieel verstorende invloed van tumor-immune cel-celcontact. Met behulp van enigszins vergelijkbare methoden, anderen hebben aangetoond dat het potentieel van het identificeren van afgescheiden factoren in Microglia/neuronale interacties14 evenals tumorcellen met mesotheliale cellen15. We hebben ook met succes deze co-cultuurtechniek gebruikt om de rol van een tumor-uitgescheiden eiwit, Pros1, te karakteriseren als een suppressor van pro-inflammatoire genexpressie na de stimulatie van peritoneale macrofagen met LPS en interferon-gamma16. Hier beschrijven we een eenvoudige methodologie die kan worden gebruikt om te interromen hoe tumor-uitgescheiden factoren kunnen invloed hebben op macrofaag activering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

Door tumor afgeleide paracrine-signalering is een over het hoofd gezien onderdeel van lokale immunosuppressie en kan leiden tot een permissieve omgeving voor aanhoudende kanker groei en metastase. Paracrine signalen kunnen cel-celcontact tussen verschillende celtypen, zoals PD-L1 uitgedrukt op het oppervlak van tumoren rechtstreeks interactie met PD-1 op het oppervlak van T-cellen, of de secretie van liganden door een tumor cel invloed op een immuuncel. Hier beschrijven we een co-cultuur methode voor het ondervragen van de effecten van tumor-uitgescheiden liganden op immune cel (macrophage) activering. Deze eenvoudige procedure maakt gebruik van commercieel verkrijgbare 0,4 μm polycarbonaat membraan permeabele ondersteunt en standaard weefselcultuur platen. In het beschreven proces worden macrofagen gekweekt in de bovenste kamer en tumorcellen in de onderste kamer. De aanwezigheid van de 0,4 μm-barrière zorgt voor de studie van intercellulaire signalering zonder de verstorende variabele van fysiek contact, omdat de twee celtypen hetzelfde medium en de blootstelling aan paracrine liganden delen. Deze aanpak kan worden gecombineerd met anderen, zoals genetische veranderingen van het macrofaag (bijvoorbeeld isolatie van genetische knock-out muizen) of tumor (bijv. CRISPR-gemedieerde veranderingen) om de rol van specifieke afgescheiden factoren en receptoren te bestuderen. De aanpak leent zich ook voor standaard moleculaire biologische analyses zoals kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase kettingreactie (qRT-PCR) of Western Blot-analyse, zonder dat stroom sortering nodig is om de twee celpopulaties te scheiden. Enzym-gebonden immunosorbent assays (elisa's) kan op dezelfde manier worden gebruikt voor het meten van uitgescheiden liganden om beter te begrijpen van de dynamische interactie van cel signalering in de context van het type meerdere cellen. De duur van de co-cultuur kan ook worden gevarieerd voor de studie van tijdelijk gereguleerde gebeurtenissen. Deze co-cultuur methode is een robuuste tool die de studie van tumor-uitgescheiden signalen in de immuuncontext vergemakkelijkt.

Om het effect van tumor-uitgescheiden liganden op macrofaag polarisatie te bepalen, werd de beschreven procedure gebruikt. Peritoneale macrofagen gekweekt in de afwezigheid van tumorcellen werden gebruikt als negatief (onbehandeld = uiterst links) en positief (IFNγ en LPS gestimuleerd = 2ND van links) controles (Figuur 2a). Als alternatief werden peritoneale macrofagen samen met B16F10 melanoom tumorcellen (ATCC) (Figuur 1a). Onmiddellijk na het bekl...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Hier presenteren we een methode met behulp van permeabele membraan ondersteuningen om de studie van contactloze paracrine signalering die door tumorcellen wordt gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken te vergemakkelijken. Het systeem is vatbaar voor het bestuderen van de rol van tumor-uitgescheiden factoren bij het demping van macrofaag activering.

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Deze Transwell co-cultuur methode wordt gebruikt om paracrine signalering gebruikt door tumorcellen om de immuunrespons te onderdrukken bestuderen. Deze methode kan worden gebruikt om nieuwe afgescheiden liganden te ontdekken, evenals de mechanistische onderbouwing van hun immuunonderdrukkende effecten. We hebben deze methode eerder gebruikt om te laten zien hoe tumor-gesecreteerde factoren macrofaag pro-inflammatoire gentranscriptie kunnen dempen.Wij geloven dat deze tool heeft brede implicaties in de studie van tumor-afgeleide immuun onderdrukking. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om paracrine signalering tussen tumorcellen en immuuncellen te bestuderen zonder de potentieel verwarrende variabele van cel-naar-cel contact. Dit platform is ook vatbaar voor een verscheidenheid aan moleculaire biologische technieken voor downstream analyse.Na het oogsten van buikvliesmacrofagen, plaat ze direct in de bovenste kamers van een 0,4 micrometer polyester membraan insert co-cultuur zes-put plaat. Vervolgens toegevoegd aangevuld DMEM aan de put zodanig dat de bovenste kamer bevat een milliliter en de onderste kamer bevat 1,5 milliliter. Incubeer gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.Ten eerste, cultuur commercieel beschikbare tumorcellen in hun respectieve medium, volgens ATCC aanbevolen weefsel cultuur methoden. Was vervolgens de aanhangende tumorcellen eenmaal met PBS. Voeg 0,05% trypsine in EDTA toe en broed op 37 graden Celsius totdat de cellen loskomen.Stel vervolgens de cellen opnieuw op in media die FBS bevatten. Gebruik een hemocytometer of celteller om het totale aantal cellen te kwantificeren en centrifuge op 220 keer G gedurende vijf minuten te pelleteren. Tijdens centrifugatie, aspirate het medium uit de bovenste en onderste kamers van de macrofaag met permeabele membraan steunplaten en vervangen door vers medium.Voor de onderste kamers waar tumorcellen zullen worden verguld, vul met een milliliter medium in plaats van 1,5 milliliter om voldoende volume te verlaten voor celtoevoeg. Wanneer de centrifugatie is voltooid, het medium uit de pelleted tumorcellen aanzuigen en de cellen in de aangevulde DMEM opnieuw opschorten bij een concentratie van 300.000 cellen per milliliter. Voeg 0,5 milliliter van deze celsuspensie toe aan de onderste kamer van de gewenste putten.Om macrofaag pro-inflammatoire genexpressie te induceren, behandelt u afzonderlijk of co-gekweekte macrofagen door interferonmama toe te voegen bij een concentratie van 100 nanogram per milliliter en LPS bij een concentratie van 50 nanogram per milliliter. Varieer de duur van de behandeltijden in de cultuur als dat nodig is. Macrofaag activering vindt plaats binnen twee uur, en sommige tumor-gemedieerde onderdrukking optreedt door acht uur.Co-cultuur gedurende 24 uur levert robuuste en consistente tumor-afgeleide onderdrukking. Als een negatieve controle, cultuur macrofagen afzonderlijk en laat onbehandeld. Behandel als een positieve controle afzonderlijk gekweekte macrofagen met interferon gamma en LPS in dezelfde concentraties die voor de monsters worden gebruikt.Nadat de gewenste incubatietijd is verstreken, isoleer het cellysaat of conditiecultuurmedium naar wens, afhankelijk van de testbehoeften. Om het cellysaat te isoleren voor kwantitatieve polymerase kettingreactieanalyse, het medium uit beide kamers van de put aan tezuilen en eenmaal te wassen met twee milliliter PBS. Breng RNA lysis buffer aan op de bovenste kamer met de macrofagen.Schraap hierna voorzichtig het membraan om het cellysaat vrij te geven en breng het over naar een opvangbuis voor verdere verwerking volgens het protocol van de fabrikant van de RNA-isolatiekit. De hier beschreven co-cultuurmethode omvat de cultuur van macrofagen en tumorcellen zonder fysiek contact. Peritoneale macrofagen gekweekt in afwezigheid van tumorcellen worden gebruikt als negatieve en positieve controles.Peritoneale macrofagen co-gekweekt in aanwezigheid van B16F10 tumorcellen, maar zonder activerende stimuli niet verhogen expressie van pro-inflammatoire geassocieerde genen. Dit impliceert dat tumor-uitgescheiden liganden ofwel niet voldoende zijn om pro-inflammatoire genexpressie zelf te induceren, of als er immuunactivering door tumorafscheidingen is, paracrine liganden voldoende zijn om het tot zijn oorspronkelijke niveaus te onderdrukken. Deze co-cultuur methode illustreert dat wanneer macrofagen gepolariseerd door interferon gamma en LPS worden gekweekt in de aanwezigheid van tumorcellen, onderdrukking van ontsteking-geassocieerde genexpressie werd verminderd met maar liefst 60%Een vergelijkbaar niveau van macrofaag pro-inflammatoire genonderdrukking wordt waargenomen wanneer de murine macrofaag cel lijn J774 wordt vervangen door peritonealphages.Eerder werk heeft eiwit S geïdentificeerd als een tumor-uitgescheiden factor die macrofaagactivering kan remmen, dus het permeabele membraanondersteuning co-cultuurmodel wordt gebruikt in combinatie met een lysA om de concentratie van eiwit S in geconditioneerde media na 24 uur te testen. In geconditioneerde media van interferon gamma en LPS-behandelde B16F10 melanoomcellen, wordt eiwit S uitgedrukt in een concentratie van ongeveer 475 nanogram per milliliter. Peritoneale macrofagen behandeld in dezelfde omstandigheden uitgedrukt eiwit S op ongeveer 61 nanogram per milliliter.Interessant is dat toen co-gekweekt, de concentratie van eiwit S in de interferon gamma en de LPS-behandelde put was ongeveer 86 nanogram per milliliter. Dit suggereert dat ofwel macrofagen tumor-gedecretde eiwit S innemen of dat de hoeveelheid eiwit S afgescheiden door B16F10 cellen aanzienlijk is afgenomen wanneer in aanwezigheid van macrofagen. Deze resultaten benadrukken diepgaande veranderingen van macrofaagactivering en paracrinesignalering wanneer macrofagen worden co-gekweekt met tumorcellen.De Transwell co-cultuur methode kan een verscheidenheid aan vragen met betrekking tot paracrine signalering te beantwoorden. Westerse vlekanalyse kan worden uitgevoerd om te bepalen hoe tumor-gesecreteerde eiwitten verschillende signaleringstrajecten in macrofagen veranderen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Dual effecten van melanoom cel-afgeleide factoren op het beenmerg Adipocytes differentiatie

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Het meten van bot remodelleren en recreëren van de Tumor-Bone Microenvironment Met behulp van Calvaria Co-cultuur en Histomorphometrie

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Het bestuderen van normale weefsel straling effecten met behulp van extracellulaire matrix hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...