Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Eric Ubil a été financé, en partie, par l'American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Les travaux ont été appuyés par une subvention des NIH (R01-CA205398) et un prix de la Fondation de recherche sur le cancer du sein (BCRF-18-041) à HSE.

Toutes les procédures liées à la récolte et à l'utilisation de macrophages péritonés murine ont été menées à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (UNC) et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'UNC.
1. Culture Macrophage
REMARQUE : Cette procédure peut utiliser des macrophages péritonéaux primaires (décrits en détail ci-dessous), des macrophages dérivés de la moelle osseuse o...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors.">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li><li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages:+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth.">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li><li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

L'analyse de co-culture présentée ici est une modification des essais précédemment établis qui permet l'étude des facteurs tumoraux-sécrétés sur l'activation de cellules immunitaires. Tandis que le contact de cellule-cellule est connu pour induire des changements dans l'activité immunisée, la capacité des ligands tumeur-sécrétés pour moduler l'activation immunisée est moins bien comprise. Nous décrivons une méthode qui, contrairement à la co-culture directe, peut être employée pour interroger comment...

Des études récentes ont porté sur la capacité des cellules cancéreuses à éviter la détection par les cellules immunitaires, à supprimer l'activation immunitaire locale ou à produire un milieu tolérogène de tumeur-permissive dans le microenvironnement de tumeur. Deux grandes classes d'interactions de tumeur et de cellules immunitaires ont été décrites qui facilitent ces effets : interactions contact-négociées ou ligands tumeur-scrétés. L'un des mécanismes les plus bien étudiés et cliniquement traitables de l'inhibition immunitaire par contact-négociée utilisée par les tumeurs est l'expression de PD-L1, qui interagit avec PD-1 sur les lymphocytes T pour inhiber leur activation et leur fonction1,2. En réponse à l'interféron-gamma (IFN), qui est exprimé par un certain nombre de cellules immunitaires activées, les cellules tumorales peuvent augmenter l'expression de PD-L1 pour induire l'épuisement des lymphocytes T activés PD-1-exprimant, les empêchant ainsi d'éradiquer efficacement les cellules tumorales3. L'utilisation d'anticorps pour bloquer l'interaction entre PD-L1 et PD-1 est actuellement utilisée pour traiter plusieurs types de cancer chez l'homme4. À la lumière de ce succès clinique et d'autres, l'identification et le ciblage des mécanismes immunosuppresseurs tumeur-dérivés a reçu l'attention croissante.
Au-delà de la suppression de l'immunité adaptative, les tumeurs sont également connues pour sécrétiser des facteurs qui suppriment les réponses pro-inflammatoires des cellules immunitaires innées. Les sécrétions tumorales ou induites par la tumeur, y compris IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, et le facteur stimulant de colonie (CSF-1), ont été montrées pour inhiber des réponses antitumorales des cellules de tueur naturel (NK), des granulocytes, et des cellules dendritiques dans le microenvironnement de tumeur5,6,7. Les cellules tumorales peuvent également sécréte des facteurs qui faussent le recrutement et la différenciation des cellules dérivées du myéloïde dans le microenvironnement tumoral pour favoriser la suppression de l'activation des lymphocytes T8,9.
Un type de cellule immunitaire innée qui a un effet profond sur la progression tumorale est le macrophage. Pendant de nombreuses années, la présence de macrophages tumeur-associés (TAMs) a été employé comme pronostic négatif de la surviepatiente 10. Le concept que les TAM immunosuppresseurs amortissent le dégagement immuno-négocié des tumeurs de cellules a été présenté il y a plus de 40 ans11. Plus récemment, il a été démontré que la réponse macrophage pro-inflammatoire peut être régulée tandis qu'un phénotype pro-tumoral peut être induit dans le microenvironnement tumoral. Ces macrophages immunosuppresseurs peuvent contribuer à une réponse tolérogène, conduisant la progression de tumeur et la résistance à la chimio- et à l'immunothérapie12. Étant donné que les macrophages sont souvent l'un des leucocytes les plus abondants avec la tumeur, la restauration de leur activité immunitaire tumeur-spécifique représente une cible potentielle pour les thérapies anticancéreuses13.
Tandis que les interactions contact-négociées entre les cellules de tumeur et les macrophages peuvent être modélisées par la coculture directe, l'utilisation des supports perméables de membrane peut élucider quels facteurs tumeur-sécrétés sont immunomodulatifs sans l'influence potentiellement confondante du contact tumeur-cellule-cellule immun. En utilisant des méthodes quelque peu similaires, d'autres ont démontré le potentiel d'identifier les facteurs sécrétés dans les microglies / interactions neuronales14 ainsi que les cellules tumorales avec des cellules méthéliales15. Nous avons également utilisé avec succès cette technique de co-culture pour caractériser le rôle d'une protéine tumeur-sécrétée, Pros1, comme un suppresseur de l'expression pro-inflammatoire de gène après la stimulation des macrophages péritonéaux avec LPS et interféron-gamma16. Ici nous décrivons une méthodologie simple qui peut être employée pour interroger comment les facteurs tumeur-sécrétés peuvent affecter l'activation de macrophage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

La signalisation paracrine dérivée de tumeur est un composant négligé de l'immunosuppression locale et peut mener à un environnement permissif pour la croissance continue de cancer et la métatasie. Les signaux paracrines peuvent impliquer le contact cellule-cellule entre différents types de cellules, tels que PD-L1 exprimé sur la surface des tumeurs interagissant directement avec PD-1 sur la surface des cellules T, ou la sécrétion de ligands par une cellule tumorale pour affecter une cellule immunitaire. Ici nous décrivons une méthode de co-culture pour interroger les effets des ligands tumeur-sécrétés sur l'activation de cellules immunitaires (macrophage). Cette procédure simple utilise des supports perméables de la membrane de polycarbonate de 0,4 m disponible dans le commerce et des plaques de culture tissulaires standard. Dans le processus décrit, les macrophages sont cultivés dans la chambre supérieure et les cellules tumorales dans la chambre inférieure. La présence de la barrière de 0,4 m permet d'étudier la signalisation intercellulaire sans la variable confondante de contact physique, car les deux types de cellules partagent le même milieu et l'exposition aux ligands paracènes. Cette approche peut être combinée à d'autres, comme les altérations génétiques du macrophage (p. ex., l'isolement des souris génétiques knock-out) ou la tumeur (p. ex., les altérations négociées par CRISPR) pour étudier le rôle de facteurs et de récepteurs sécrétés spécifiques. L'approche se prête également à des analyses biologiques moléculaires standard telles que la réaction quantitative en chaîne de polymérase de transcription inversée (qRT-PCR) ou l'analyse occidentale de tache, sans la nécessité de trier le flux pour séparer les deux populations cellulaires. Les essais immunosorbent enzymatiques (ELISA) peuvent également être utilisés pour mesurer les ligands sécrétés afin de mieux comprendre l'interaction dynamique de la signalisation cellulaire dans le contexte du type de cellules multiples. La durée de la co-culture peut également être modifiée pour l'étude des événements temporels. Cette méthode de co-culture est un outil robuste qui facilite l'étude des signaux sécrétés par la tumeur dans le contexte immunitaire.

Pour déterminer l'effet des ligands tumeur-sécrétés sur la polarisation de macrophage, la procédure décrite a été employée. Les macrophages péritonéaux cultivés en l'absence de cellules tumorales ont été utilisés comme témoins négatifs (non traités à l'extrême gauche) et positifs (IFNet et LPS stimulés àpartir de la gauche) (Figure 2A). Alternativement, les macrophages péritonéaux ont été co-cultivés avec les cellules de tumeur de mélanome b16F10 (ATCC)...

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Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Ici, nous présentons une méthode utilisant des supports perméables de membrane pour faciliter l'étude de la signalisation de paracrine de non-contact employée par des cellules de tumeur pour supprimer la réponse immunitaire. Le système est disposé à étudier le rôle des facteurs tumeur-sécrétés en amortissant l'activation de macrophage.

Étudier les effets des ligands paracriné sécrétés par les tumeurs sur l'activation du macrophage à l'aide de la co-culture avec des supports membranaires perméables

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Cette méthode de co-culture Transwell est utilisée pour étudier la signalisation paracrine utilisée par les cellules tumorales pour supprimer la réponse immunitaire. Cette méthode peut être utilisée pour découvrir de nouveaux ligands sécrétés, ainsi que les fondements mécanistes de leurs effets immunosuppresseurs. Nous avons précédemment employé cette méthode pour montrer comment les facteurs tumeur-sécrètent peuvent amortir la transcription pro-inflammatoire de gène de macrophage.Nous croyons que cet outil a des implications étendues dans l’étude de la suppression immunisée tumeur-dérivée. Un des principaux avantages de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour étudier la signalisation paracrine entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires sans la variable potentiellement confusionnante du contact cellule à cellule. Cette plate-forme est également accessible à une variété de techniques biologiques moléculaires pour l’analyse en aval.Après la récolte des macrophages péritonéaux, plaquez-les directement dans les chambres supérieures d’une membrane polyester de 0,4 micromètre insérant une plaque de six puits de co-culture. Puis ajouté complété DMEM au puits de sorte que la chambre supérieure contient un millilitre et la chambre inférieure contient 1,5 millilitres. Incuber pendant trois jours à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Tout d’abord, la culture des cellules tumorales disponibles dans le commerce dans leur milieu respectif, suivant les méthodes de culture des tissus recommandées par l’ATCC. Ensuite, lavez les cellules tumorales adhérentes une fois avec PBS. Ajouter 0,05% trypsine dans EDTA et incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se détachent.Puis re-suspendre les cellules dans les médias contenant FBS. Utilisez un hémocytomètre ou un compteur cellulaire pour quantifier le nombre total de cellules et de centrifugeuses à 220 fois G pendant cinq minutes pour pelleter. Pendant la centrifugation, aspirer le milieu des chambres supérieures et inférieures du macrophage contenant des plaques de support membranaires perméables et remplacer par un milieu frais.Pour les chambres inférieures où les cellules tumorales seront plaquées, remplir d’un millilitre de milieu au lieu de 1,5 millilitres pour laisser un volume suffisant pour l’ajout cellulaire. Quand la centrifugation est complète, aspirez le milieu des cellules tumorales granulées et suspendez les cellules dans le DMEM complété à une concentration de 300.000 cellules par millilitre. Ajouter 0,5 millilitres de cette suspension cellulaire à la chambre basse des puits désirés.Pour induire l’expression pro-inflammatoire des gènes macrophages, traitez les macrophages sings ou co-cultivés en ajoutant des gamma d’interféron à une concentration de 100 nanogrammes par millilitre et de LPS à une concentration de 50 nanogrammes par millilitre. Varier la durée des temps de traitement en culture au besoin. L’activation de macrophage se produit dans les deux heures, et une certaine suppression tumeur-médiatisée se produit par huit heures.La co-culture pendant 24 heures donne la suppression tumeur-dérivée robuste et cohérente. En tant que contrôle négatif, les macrophages de culture chantent et ne sont pas traités. Comme un contrôle positif, traiter les macrophages cultivés ment avec interféron gamma et LPS aux mêmes concentrations utilisées pour les échantillons.Une fois le temps d’incubation désiré écoulé, isoler le lysate cellulaire ou le milieu de culture de l’état selon les besoins d’essai. Pour isoler le lysate cellulaire pour l’analyse quantitative de la réaction en chaîne de polymésase, aspirez le milieu des deux chambres du puits et lavez-le une fois avec deux millilitres de PBS. Appliquez le tampon de lyse d’ARN à la chambre supérieure contenant les macrophages.Après cela, grattez doucement la membrane pour libérer la cellule lysate et transférez-la dans un tube de collecte pour un traitement ultérieur selon le protocole du fabricant du kit d’isolation arn. La méthode de co-culture décrite ici implique la culture des macrophages et des cellules tumorales sans contact physique. Les macrophages péritonéaux cultivés en l’absence de cellules tumorales sont utilisés comme témoins négatifs et positifs.Les macrophages péritonéaux co-cultivés en présence de cellules tumorales B16F10 mais sans activer les stimuli n’augmentent pas l’expression des gènes associés pro-inflammatoires. Ceci implique que les ligands tumeur-sécrètent ne sont pas suffisants pour induire l’expression pro-inflammatoire de gène par eux-mêmes, ou s’il y a activation immunisée par des sécrétions de tumeur, ligands paracrines sont suffisants pour la supprimer à ses niveaux indigènes. Cette méthode de co-culture illustre que lorsque les macrophages polarisés par interféron gamma et LPS sont cultivés en présence de cellules tumorales, la suppression de l’expression des gènes associée à l’inflammation a été réduite jusqu’à 60%Un niveau comparable de suppression des gènes pro-inflammatoires macrophages est observé lorsque la lignée cellulaire macrophage murine J774 est remplacée par des macrophages péritonéaux.Les travaux précédents ont identifié la protéine S comme un facteur sécrètement de tumeur qui peut empêcher l’activation de macrophage, ainsi le modèle perméable de co-culture de support de membrane est employé en conjonction avec un lysA pour apaiser la concentration de protéine S dans le support conditionné après 24 heures. Dans les médias conditionnés provenant des cellules de mélanome B16F10 traitées par interféron gamma et LPS, la protéine S est exprimée en une concentration d’environ 475 nanogrammes par millilitre. Les macrophages péritonéaux traités dans les mêmes conditions exprimaient la protéine S à environ 61 nanogrammes par millilitre.Fait intéressant, lorsqu’elle est co-cultivé, la concentration de protéines S dans l’interféron gamma et le puits traité par LPS était d’environ 86 nanogrammes par millilitre. Ceci suggère que les macrophages ingèrent la protéine S tumeur-sécrétée ou que la quantité de protéine S sécrétée par les cellules de B16F10 soit sensiblement diminuée quand en présence des macrophages. Ces résultats mettent en évidence des changements profonds de l’activation des macrophages et de la signalisation paracrine lorsque les macrophages sont co-cultivés avec les cellules tumorales.La méthode de co-culture Transwell peut répondre à une variété de questions relatives à la signalisation paracrine. L’analyse occidentale de tache pourrait être conduite pour déterminer comment les protéines tumeur-sécrètent modifient diverses voies de signalisation dans les macrophages.

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Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Étudier les effets normaux du rayonnement tissulaire à l'aide d'hydrogels de matrice extracellulaire

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur l'invasion sphéroïde de tumeur 3D par microscopie confocale de haute résolution

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-culture de cellules souches de glioblastome sur des neurones à motifs pour étudier la migration et les interactions cellulaires

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...