Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
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Eric Ubil wurde zum Teil vom American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB) finanziert. Die Arbeit wurde durch ein Stipendium des NIH (R01-CA205398) und einen Breast Cancer Research Foundation Award (BCRF-18-041) an DIE HSE unterstützt.

Alle Verfahren im Zusammenhang mit der Ernte und Verwendung von murinen Peritonealmakrophagen wurden an der University of North Carolina at Chapel Hill (UNC) durchgeführt und vom UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
1. Makrophagenkultur
HINWEIS: Bei diesem Verfahren können primäre peritoneale Makrophagen (siehe unten im Detail), knochenmarkabgeleitete Makrophagen oder Makrophagenzelllinien wie J774 (ATCC) oder RAW264 (ATCC) verwendet w...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

Der hier vorgestellte Co-Kultur-Assay ist eine Modifikation von zuvor etablierten Assays, die die Untersuchung von tumorsekretierten Faktoren bei der Aktivierung von Immunzellen ermöglicht. Während Zell-Zell-Kontakt bekannt ist, Veränderungen in der Immunaktivität zu induzieren, ist die Fähigkeit von tumor-sezertierten Liganden, die Immunaktivierung zu modulieren, weniger gut verstanden. Wir beschreiben eine Methode, die im Gegensatz zur direkten Co-Kultur verwendet werden kann, um zu hinterfragt, wie tumorabgeleite...

Jüngste Studien haben sich auf die Fähigkeit von Krebszellen konzentriert, den Nachweis durch Immunzellen zu vermeiden, die lokale Immunaktivierung zu unterdrücken oder ein tolerogenes tumorpermissives Milieu in der Tumormikroumgebung zu produzieren. Es wurden zwei große Klassen von Tumor- und Immunzellinteraktionen beschrieben, die diese Effekte erleichtern: kontaktvermittelte Wechselwirkungen oder tumorsekrete Liganden. Einer der am besten untersuchten und klinisch traktierbaren Mechanismen der kontaktvermittelten Immunhemmung, die von Tumoren genutzt werden, ist die Expression von PD-L1, die mit PD-1 auf T-Zellen interagiert, um ihre Aktivierung und Funktion zu hemmen1,2. Als Reaktion auf Interferon-Gamma (IFN), das durch eine Reihe von aktivierten Immunzellen exprimiert wird, können Tumorzellen die Expression von PD-L1 erhöhen, um die Erschöpfung von PD-1-exprimierenden aktivierten T-Zellen zu induzieren, wodurch sie daran gehindert werden, Tumorzellen effektiv auszurotten3. Die Verwendung von Antikörpern, um die Wechselwirkung zwischen PD-L1 und PD-1 zu blockieren, wird derzeit zur Behandlung mehrerer Krebsarten beim Menschen verwendet4. Angesichts dieses klinischen Erfolgs und anderer, die Identifizierung und Ausrichtung von Tumor-abgeleiteten immunsuppressiven Mechanismen hat zunehmende Aufmerksamkeit erhalten.
Über die Unterdrückung der adaptiven Immunität hinaus sind Tumore auch dafür bekannt, Faktoren zu sezernieren, die die entzündungshemmenden Reaktionen angeborener Immunzellen unterdrücken. Tumor-abgeleitete oder tumorinduzierte Sekrete, einschließlich IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, und Kolonie stimulierende Faktor (CSF-1), haben gezeigt, antitumor-Antworten von natürlichen Killer (NK) Zellen, Granulozyten, und dendritischen Zellen in der Tumor-Mikroumgebung5,6,7hemmen. Tumorzellen können auch Faktoren absondern, die die Rekrutierung und Differenzierung von myeloiden Zellen in der Tumormikroumgebung verzerren, um die Unterdrückung der T-Zellaktivierung zu fördern8,9.
Eine Art von angeborenen Immunzelle, die eine tiefgreifende Wirkung auf die Tumorprogression hat, ist die Makrophagen. Seit vielen Jahren wird das Vorhandensein von tumorassoziierten Makrophagen (TAMs) als negative Prognose für das Überleben des Patienten10verwendet. Das Konzept, dass immunsuppressive TAMs die immunzellvermittelte Clearance von Tumoren dämpfen, wurde vor mehr als 40 Jahren eingeführt11. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass die Makrophagen-Pro-Entzündungsreaktion herunterreguliert werden kann, während ein Pro-Tumor-Phänotyp in der Tumormikroumgebung induziert werden kann. Diese immunsuppressiven Makrophagen können zu einer tolerogenen Reaktion beitragen, die die Tumorprogression und Die Resistenz gegen Chemo- und Immuntherapie12antreibt. Angesichts der Tatsache, dass Makrophagen oft eine der häufigsten Leukozyten mit dem Tumor sind, stellt die Wiederherstellung ihrer tumorspezifischen Immunaktivität ein potenzielles Ziel für Krebstherapeutikadar 13.
Während kontaktvermittelte Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Makrophagen durch direkte Kokultur modelliert werden können, kann der Einsatz durchlässiger Membranstützen aufklären, welche tumorsekretierten Faktoren immunmodulatorisch sind, ohne den potenziell verwirrenden Einfluss des Tumor-Immunzell-Zellkontakts. Mit etwas ähnlichen Methoden haben andere das Potenzial der Identifizierung von sezernierten Faktoren in Mikroglia/neuronalen Wechselwirkungen14 sowie Tumorzellen mit Mesothelzellen15gezeigt. Wir haben diese Co-Kultur-Technik auch erfolgreich eingesetzt, um die Rolle eines tumorsekretierten Proteins, Pros1, als Unterdrücker der pro-inflammatorischen Genexpression nach der Stimulation von peritonealen Makrophagen mit LPS und Interferon-gamma16zu charakterisieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die verwendet werden kann, um zu hinterfragt, wie tumorsekrete Faktoren die Makrophagenaktivierung beeinflussen können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

Die tumorabgeleitete Parakrinsignalisierung ist eine übersehene Komponente der lokalen Immunsuppression und kann zu einer freizügigen Umgebung für anhaltendes Krebswachstum und Metastasierung führen. Parakrine Signale können Zell-Zell-Kontakt zwischen verschiedenen Zelltypen beinhalten, wie PD-L1 auf der Oberfläche von Tumoren, die direkt mit PD-1 auf der Oberfläche von T-Zellen interagieren, oder die Sekretion von Liganden durch eine Tumorzelle, um eine Immunzelle zu beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur-Methode, um die Auswirkungen von tumorsezerseligierten Liganden auf die Aktivierung von Immunzellen (Makrophagen) abzufragen. Dieses einfache Verfahren verwendet handelsübliche 0,4 m Polycarbonat-Membran-permeable Stützen und Standard-Gewebekulturplatten. Dabei werden Makrophagen in der oberen Kammer und Tumorzellen in der unteren Kammer kultiviert. Das Vorhandensein der 0,4-mm-Barriere ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Signalisierung ohne die verwirrende Variable des physikalischen Kontakts, da die beiden Zelltypen das gleiche Medium und die Exposition gegenüber parakrinen Liganden aufweisen. Dieser Ansatz kann mit anderen kombiniert werden, wie genetische Veränderungen der Makrophagen (z. B. Isolierung von genetischen Knock-out-Mäusen) oder Tumor (z. B. CRISPR-vermittelte Veränderungen), um die Rolle bestimmter abgesonderter Faktoren und Rezeptoren zu untersuchen. Der Ansatz eignet sich auch für molekularbiologische Standardanalysen wie quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Western Blot-Analyse, ohne dass eine Flusssortierung erforderlich ist, um die beiden Zellpopulationen zu trennen. Enzymgebundene Immunsorbent-Assays (ELISAs) können ebenfalls verwendet werden, um abgesonderte Liganden zu messen, um die dynamische Wechselwirkung der Zellsignalisierung im Kontext des Multiple-Zell-Typs besser zu verstehen. Die Dauer der Kokultur kann auch für das Studium zeitlich regulierter Ereignisse variiert werden. Diese Co-Kultur-Methode ist ein robustes Werkzeug, das das Studium von tumorseften Signalen im Immunkontext erleichtert.

Um die Wirkung von tumorsezerseten Liganden auf die Makrophagenpolarisation zu bestimmen, wurde das beschriebene Verfahren verwendet. Peritoneale Makrophagen, die in Abwesenheit von Tumorzellen kultiviert wurden, wurden als negative (unbehandelt = ganz links) und positive (IFN- und LPS-stimulierte =2. von links) Kontrollen verwendet (Abbildung 2A). Alternativ wurden peritoneale Makrophagen mit B16F10 Melanom-Tumorzellen (ATCC) kokultiviert (Abbildung 1A</stron...

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Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Hier präsentieren wir eine Methode mit durchlässigen Membranstützen, um die Untersuchung der berührungslosen Parakrinsignalisierung zu erleichtern, die von Tumorzellen verwendet wird, um die Immunantwort zu unterdrücken. Das System ist für die Untersuchung der Rolle von tumorsezerseten Faktoren bei der Dämpfung der Makrophagenaktivierung geeignet.

Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Diese Transwell-Co-Kultur-Methode wird verwendet, um Parakrin-Signalisierung von Tumorzellen verwendet, um die Immunantwort zu unterdrücken. Diese Methode kann verwendet werden, um neue sezernierte Liganden zu entdecken, sowie die mechanistischen Grundlagen ihrer immunsuppressiven Wirkung. Wir haben diese Methode bereits verwendet, um zu zeigen, wie tumorsekretierte Faktoren die makrophagenpro-inflammatorische Gentranskription dämpfen können.Wir glauben, dass dieses Tool weitreichende Implikationen in der Studie der tumorabgeleiteten Immunsuppression hat. Einer der Hauptvorteile dieser Technik ist, dass es verwendet werden kann, um parakrine Signalisierung zwischen Tumorzellen und Immunzellen zu studieren, ohne die potenziell verwirrende Variable des Zell-zu-Zell-Kontakts. Diese Plattform ist auch für eine Vielzahl molekularbiologischer Verfahren für nachgelagerte Analysen zugänglich.Nach der Ernte peritonealmakrophagen, platte sie direkt in die oberen Kammern einer 0,4 Mikrometer Polyestermembran einfügen Co-Kultur Sechs-Well-Platte. Dann hinzugefügt dmEM hinzugefügt, um den Brunnen so, dass die obere Kammer enthält einen Milliliter und die untere Kammer enthält 1,5 Milliliter. Drei Tage bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren.Erstens, Kultur kommerziell erhältlich Tumorzellen in ihrem jeweiligen Medium, nach ATCC empfohlen Gewebekultur Methoden. Als nächstes waschen Sie die anhaftenden Tumorzellen einmal mit PBS. Fügen Sie 0,05% Trypsin in EDTA hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen lösen.Setzen Sie dann die Zellen in Medien, die FBS enthalten, erneut aus. Verwenden Sie ein Hämozytometer oder einen Zellzähler, um die Gesamtzahl der Zellen und Zentrifugen bei 220 mal G für fünf Minuten zu quantifizieren. Während der Zentrifugation das Medium aus den oberen und unteren Kammern des Makrophagens ansaugen, das durchlässige Membranträgerplatten enthält, und durch frisches Medium ersetzen.Für die unteren Kammern, in denen Tumorzellen plattiert werden, füllen Sie mit einem Milliliter Medium statt 1,5 Milliliter, um genügend Volumen für die Zellzugabe zu hinterlassen. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, saugen Sie das Medium aus den pelletierten Tumorzellen und setzen Sie die Zellen in ergänztem DMEM mit einer Konzentration von 300.000 Zellen pro Milliliter wieder auf. Fügen Sie 0,5 Milliliter dieser Zellsuspension in die untere Kammer der gewünschten Brunnen.Um die pro-inflammatorische Genexpression von Makrophagen zu induzieren, behandeln Sie singly oder co-cultured Makrophagen, indem Sie Interferon-Gamma in einer Konzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter und LPS in einer Konzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter hinzufügen. Variieren Sie die Dauer der Behandlungszeiten in der Kultur nach Bedarf. Die Makrophagenaktivierung erfolgt innerhalb von zwei Stunden, und einige tumorvermittelte Unterdrückung erfolgt um acht Stunden.Die Co-Kultur für 24 Stunden führt zu einer robusten und konsistenten Tumorunterdrückung. Als negativer Kontrolle, Kultur Makrophagen singly und lassen unbehandelt. Behandeln Sie als positiv zu behandelnde, singly-cultured Makrophagen mit Interferon-Gamma und LPS in den gleichen Konzentrationen, die für die Proben verwendet werden.Nachdem die gewünschte Inkubationszeit abgelaufen ist, isolieren Sie je nach Testbedarf das Zelllysat- oder Konditionskulturmedium nach Belieben. Um das Zelllysat für die quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse zu isolieren, saugen Sie das Medium aus beiden Kammern des Brunnens an und waschen Sie einmal mit zwei MilliliterPBS. Tragen Sie den RNA-Lysepuffer auf die obere Kammer auf, die die Makrophagen enthält.Danach kratzen Sie die Membran vorsichtig, um das Zelllysat freizusetzen, und übertragen Sie es zur Weiterverarbeitung gemäß dem Herstellerprotokoll des RNA-Isolationskits in ein Sammelrohr. Die hier beschriebene Co-Kultur-Methode beinhaltet die Kultur von Makrophagen und Tumorzellen ohne physischen Kontakt. Peritoneale Makrophagen, die in Abwesenheit von Tumorzellen kultiviert werden, werden als negative und positive Kontrollen verwendet.Peritoneale Makrophagen, die in Gegenwart von B16F10-Tumorzellen mitkultiviert werden, aber ohne aktivierungsstarke Reize die Expression von pro-inflammatorischen assoziierten Genen nicht erhöhen. Dies impliziert, dass tumorsekrete Liganden entweder nicht ausreichen, um die pro-inflammatorische Genexpression selbst zu induzieren, oder wenn es eine Immunaktivierung durch Tumorsekrete gibt, sind parakrine Liganden ausreichend, um sie auf ihre nativen Ebenen zu unterdrücken. Diese Co-Kultur-Methode veranschaulicht, dass, wenn Makrophagen, die durch Interferon-Gamma und LPS polarisiert werden, in Gegenwart von Tumorzellen kultiviert werden, die Unterdrückung der entzündungsassoziierten Genexpression um bis zu 60% reduziert wurde Ein vergleichbares Niveau der Makrophagen-Pro-Entzündlichen Gensuppression wird beobachtet, wenn die murine Makrophagenzelllinie J774 durch peritoneale Makrophagen ersetzt wird.Frühere Arbeiten haben Protein S als tumorsekretierten Faktor identifiziert, der die Makrophagenaktivierung hemmen kann, so dass das durchlässige Membranunterstützungs-Cokulturmodell in Verbindung mit einem LysA verwendet wird, um die Konzentration von Protein S in konditionierten Medien nach 24 Stunden zu assieren. In konditionierten Medien aus Interferongamma- und LPS-behandelten B16F10-Melanomzellen wird Protein S in einer Konzentration von etwa 475 Nanogramm pro Milliliter exprimiert. Peritoneale Makrophagen, die unter den gleichen Bedingungen behandelt wurden, exprimierte das Protein S mit etwa 61 Nanogramm pro Milliliter.Interessanterweise betrug die Konzentration von Protein S im Interferon-Gamma und im LPS-behandelten Brunnen bei einer Kokulturierung etwa 86 Nanogramm pro Milliliter. Dies deutet darauf hin, dass entweder Makrophagen tumorsekretiertes Protein S aufnehmen oder dass die Menge an Protein S, das von B16F10-Zellen abgesondert wird, in Gegenwart von Makrophagen erheblich verringert wird. Diese Ergebnisse zeigen tiefgreifende Veränderungen der Makrophagenaktivierung und parakrinen Signalisierung, wenn Makrophagen mit Tumorzellen kokultiviert werden.Die Transwell Co-Culture-Methode kann eine Vielzahl von Fragen im Zusammenhang mit Parakrin-Signalisierung beantworten. Western Blot Analyse könnte durchgeführt werden, um zu bestimmen, wie tumor-sezernierte Proteine verschiedene Signalwege in Makrophagen verändern.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

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Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

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While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

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Mesenchymale Stammzellen isoliert von Pulpagewebe und Kokultur mit Krebszellen ihre Interaktionen zu untersuchen

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Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

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Charakterisierung der Auswirkungen von Migrastatischen Inhibitoren auf die 3D-Tumorsphäroid-Invasion durch hochauflösende Konfokalmikroskopie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...