Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

אריק Ubil היה ממומן, בין השאר, על ידי האגודה האמריקנית לסרטן החברה פוסט דוקטורט (128770-PF-15-216-01-LIB). העבודה נתמכה על ידי מענק NIH (R01-CA205398) ו סרטן השד מחקר הקרן פרס (BCRF 18-041) ל HSE.

כל ההליכים הקשורים הקציר והשימוש של מקרופאגים הצפק מוריין נערכו באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ היל (UNC) ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים UNC והשתמש הוועדה (IACUC).
1. תרבות מקרופאג
הערה: הליך זה יכול לנצל את מקרופאגים הצפק הראשי (המתואר בפירוט להלן), מח עצם הנגזר מ?...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors.">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li><li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages:+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth.">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li><li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

השינוי בתרבות שיתוף הציג כאן הוא שינוי של בחני שנקבעו בעבר, המאפשר לימוד של גורמים מופרש הגידול על הפעלת התא החיסונית. בעוד המגע תא התא ידוע כדי לגרום לשינויים בפעילות החיסונית, היכולת של הגידול המופרש גידולים לווסת את ההפעלה החיסונית הוא מובן פחות טוב. אנו מתארים שיטה אשר, שלא כמו שיתוף הת...

מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו ביכולת של תאים סרטניים כדי למנוע זיהוי על ידי תאים חיסוניים, לדכא את ההפעלה החיסונית המקומית, או לייצר הגידול tolerogenic מתירני הגידול מיקרוסביבה. שתי שיעורים רחבים של גידול ואינטראקציות תאים החיסונית תוארו כי להקל על ההשפעות הללו: קשר-מתווך אינטראקציות או ליגניות המופרשים. אחד הטוב ביותר לחקור מנגנוני צייתן קלינית של קשר-תיווך החיסונית עיכוב מנוצל על ידי גידולים היא הביטוי של pd-L1, אשר אינטראקציה עם PD-1 על התאים T לעכב את ההפעלה שלהם פונקציה1,2. בתגובה אינטרפרון-גמא (IFNγ), אשר מתבטא על ידי מספר תאים חיסוניים מופעלים, תאים סרטניים יכולים להגביר את הביטוי של PD-L1 כדי לגרום לתשישות של PD-1 – הבעת הפעלת תאי T, ובכך למנוע מהם ביעילות להשמיד תאים סרטניים3. השימוש נוגדנים לחסום את האינטראקציה בין PD-L1 ו-PD-1 משמש כיום לטיפול בסוגי סרטן מרובים בבני אדם4. לאור ההצלחה הקלינית הזאת ואחרים, הזיהוי והמיקוד של מנגנוני הדיכוי האנטי-סרטניים, קיבל את תשומת הלב הגוברת.
מעבר דיכוי של חסינות אדפטיבית, גידולים ידועים גם להפריש גורמים לדכא את התגובות הפרו דלקתיות של תאים חיסוניים מולדים. גידול נגזר או הפרשות הגידול המושרה, כולל il-6, il-10, וגרה, il-23, ואת המושבה גורם ממריץ (שדרתי-1), הוכחו לעכב את תגובות הגידול של הרוצח הטבעי (NK) תאים, גרנולוציטים, ותאים דנדריטים ב מיקרוסביבה הגידול5,6,7. תאים סרטניים יכולים גם להפריש גורמים הטיית הגיוס והבידול של תאים מיאלואידית-נגזר במיקרו הסביבה הגידול כדי לקדם את הדיכוי של ההפעלה תא T8,9.
סוג אחד של תא מולדים החיסון כי יש השפעה עמוקה על התקדמות הגידול הוא מקרופאג. במשך שנים רבות, הנוכחות של מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) השתמשו כתחזיות שליליות של הישרדות החולה10. המושג כי מדכאים TAMs לצנן את התא החיסונית מתווכת הסיווג של גידולים הוצג לפני יותר מ 40 שנים11. לאחרונה, זה הוכח כי התגובה מקרופאג pro-דלקתיות יכול להיות מוסדר בעוד פנוטיפ הגידול pro יכול להיגרם מיקרוסביבה הגידול. אלה מקרופאגים מדכאים יכול לתרום לתגובה tolerogenic, נהיגה התקדמות הגידול ועמידות לכימותרפיה-טיפול חיסוני12. בהינתן כי מקרופאגים הם לעתים קרובות אחד לוקיציטים הנפוץ ביותר עם הגידול, שחזור של פעילות החיסון הספציפי שלהם לגידול מייצג יעד פוטנציאלי עבור תרופות נגד סרטן therapeutics13.
בעוד קשר-מתווך אינטראקציה בין תאים סרטניים מקרופאגים ניתן להקים באמצעות התרבות coculture ישירה, השימוש של ממברנה חדיר תומך יכול להבהיר איזה גורם הגידול מופרש הם החיסונית ללא השפעה הפוטנציאל של הגידול-תא החיסונית החיסון המגע. באמצעות שיטות דומות במקצת, אחרים הוכיחו את הפוטנציאל של זיהוי גורמים מופרש ב microglia/האינטראקציות נוירואליות14 , כמו גם תאים סרטניים עם תאים mesothelial15. יש לנו גם בהצלחה את הטכניקה שיתוף התרבות הזאת כדי לאפיין את התפקיד של חלבון מופרש הגידול, Pros1, כמו מדכא של ביטוי גנים פרו דלקתית לאחר גירוי של מקרופאגים הצפק עם LPS ו אינטרפרון-גמא16. כאן אנו מתארים מתודולוגיה ישירה כי ניתן להשתמש כדי לחקור כיצד גורמים מופרש הגידול יכול להשפיע על מקרופאג הפעלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

הגידול הנגזר הקרנף איתות הוא רכיב מתעלמים של דיכוי חיסוני מקומי והוא יכול להוביל לסביבה מתירני עבור גידול בסרטן המתמשך גרורות. אותות הפרדרין יכול לכלול מגע תא תא בין סוגי תאים שונים, כגון PD-L1 ביטא על פני השטח של גידולים הקשורים ישירות עם PD-1 על פני השטח של תאי T, או הפרשת ליגולים על ידי תא הגידול כדי להשפיע על תא החיסון. כאן אנו מתארים שיטה שיתוף תרבות כדי לחקור את ההשפעות של הגידול מופרש ליגנדס תא החיסונית (מקרופאג) הפעלה. הליך זה פשוט מנצל מסחרית זמין 0.4 יקרומטר ממברנה פוליקרבונט חדירות תומך ולוחות התרבות רקמה סטנדרטית. בתהליך המתואר, מקרופאגים הם מתורבתים בחדר העליון תאים סרטניים בחדר התחתון. הנוכחות של מכשול 0.4 יקרומטר מאפשר לימוד של איתות התרבות ללא משתנה מייסד של מגע פיזי, כי שני סוגי התא לחלוק את אותו בינונית וחשיפה לליפות הקרנף. גישה זו יכולה להיות משולבת עם אחרים, כגון שינויים גנטיים של המקרופאג (למשל, בידוד מן העכברים לנקוש החוצה גנטית) או גידול (למשל, CRISPR-בתיווך שינויים) כדי ללמוד את התפקיד של גורמים מופרשים ספציפיים וקולטנים. הגישה גם משאיל את עצמה לניתוחים ביולוגיים מולקולריים סטנדרטיים כגון שעתוק הפוכה כמותית תגובת שרשרת (רביעיית-PCR) או ניתוח כתמי אבן מערבי, ללא צורך במיון זרימה כדי להפריד בין שתי אוכלוסיות תאים. חיסוני מקושרים אנזים בחני (אליאס) יכול להיות באופן דומה להיות מנוצל כדי למדוד מופרש ליגנדס כדי להבין טוב יותר את האינטראקציה הדינמית של איתות התא בהקשר סוג תא מרובים. משך התרבות המשותף יכול להיות מגוון גם לחקר האירועים המווסתים באופן זמני. שיטה זו שיתוף תרבות היא כלי חזק המקל על חקר אותות הגידול מופרש בהקשר החיסונית.

כדי לקבוע את ההשפעה של ליגניות מופרש בגידולים על מקרופאג polarization, ההליך המתואר היה מנוצל. מקרופאגים הצפק תרבותי בהעדר תאים סרטניים שימשו שלילית (מטופל = רחוק משמאל) וחיובי (IFNγ ו-LPS מגורה = 2nd משמאל) פקדים (איור 2a). לחילופין, מקרופאגים הצפק היו שיתוף תרבותי עם תאים סרטניים B...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות ממברנה חדיר תומך כדי להקל על המחקר של אי-מגע הפרדרין איתות בשימוש על ידי תאים סרטניים כדי לדכא את התגובה החיסונית. המערכת היא קלה ללמוד את התפקיד של גורמים מופרש הגידול בהפעלת לחות מקרופאג.

לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

שיטה זו Transwell שיתוף תרבות משמש לחקר איתות פרצרין בשימוש על ידי תאים סרטניים כדי לדכא את התגובה החיסונית. שיטה זו יכולה לשמש לגילוי ליגנדים מופרשים חדשניים, כמו גם את ביסודות המקניסטיים של ההשפעות המדכאות שלהם. השתמשנו בעבר בשיטה זו כדי להראות כיצד גורמים המופרשים על ידי גידולים יכולים לעמעם את שעתוק הגנים התומכים במאקרופאג'.אנו מאמינים שלאיל זה יש השלכות נרחבות בחקר דיכוי חיסוני שמקורו בגידולים. אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא שניתן להשתמש בה כדי ללמוד איתות פרצרין בין תאים סרטניים לתאי החיסון ללא המשתנה המבלבל של מגע בין תא לתא. פלטפורמה זו נוחה גם למגוון טכניקות ביולוגיות מולקולריות לניתוח במורד הזרם.לאחר קצירת מקרופאגים צפי, צלחת אותם ישירות לתוך התאים העליונים של קרום פוליאסטר מיקרומטר 0.4 מיקרומטר להוסיף שיתוף תרבות שישה באר צלחת. לאחר מכן הוסיף DMEM בתוספת לגם כך התא העליון מכיל מיליליטר אחד ואת התא התחתון מכיל 1.5 מיליליטר. דגירה במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.ראשית, תאים סרטניים זמינים מסחרית במדיום שלהם, בעקבות ATCC מומלץ שיטות תרבות רקמות. לאחר מכן, לשטוף את התאים הגידול חסיד פעם אחת עם PBS. הוסיפו 0.05% טריפסין ב-EDTA ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתנתקים.לאחר מכן השהה מחדש את התאים במדיה המכילה FBS. השתמש hemocytometer או מונה התא לכמת את המספר הכולל של תאים צנטריפוגה ב 220 פעמים G במשך חמש דקות כדי גלולה. במהלך הצנטריפוגה, שאף את המדיום מהתאיים העליונים והתחתונים של המקרופאג' המכילים לוחות תמיכה בממברנה חדירים והחלף במדיום טרי.עבור התאים התחתונים שבהם תאים סרטניים יהיו מצופים, למלא עם מיליליטר אחד של בינוני במקום 1.5 מיליליטר להשאיר נפח מספיק לתוספת תאים. כאשר הצנטריפוגה הושלמה, שאפו את המדיום מהתאים הגידוליים המוגלתיים והשעו מחדש את התאים ב- DMEM בתוספת ריכוז של 300, 000 תאים למיליליטר. הוסף 0.5 מיליליטר של השעיית תא זה לתא התחתון של הבארות הרצויות.כדי לגרום לביטוי גנים פרו דלקתיים מקרופאגים, לטפל מקרופאגים יחיד או במשותף על ידי הוספת גמא אינטרפרון בריכוז של 100 ננוגרם למיליליטר ו LPS בריכוז של 50 ננוגרם למיליליטר. לשנות את משך זמני הטיפול בתרבות לפי הצורך. הפעלת מקרופאג' מתרחשת תוך שעתיים, ודיכוי מסוים מתווך בגידולים מתרחש בשמונה שעות.תרבות שותף במשך 24 שעות מניבה דיכוי חזק ועקבי שמקורו בגידולים. כשליטה שלילית, מקרופאגים תרבותיים בנפרד ומשאירים ללא טיפול. כשליטה חיובית, התייחסו למאקרופאגים בעלי תרבות יחידה עם אינטרפרון גמא ו-LPS באותם ריכוזים המשמשים לדגימות.לאחר שחלף זמן הדגירה הרצוי, יש לבודד את התא או למצב את מדיום תרבות בהתאם לרצוי בהתאם לצרכי הבדיקה. כדי לבודד את ליסנט התא לניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית, שאפו את המדיום משני תאי הבאר ושטפו פעם אחת עם שני מיליליטר של PBS. החל מאגר תות RNA על התא העליון המכיל את המקרופאגים.לאחר מכן, בעדינות לגרד את הממברנה כדי לשחרר את התא lysate ולהעביר אותו צינור איסוף לעיבוד נוסף על פי הפרוטוקול של יצרן ערכת בידוד RNA. שיטת השיתוף המתוארת כאן כוללת תרבות של מקרופאגים ותאי גידול ללא מגע פיזי. מקרופאגים צפי מתורבתים בהיעדר תאים סרטניים משמשים בקרות שליליות וחיוביות.מקרופאגים פריטון במשותף מתורבתים בנוכחות תאים סרטניים B16F10 אבל בלי להפעיל גירויים אינם מגבירים את הביטוי של גנים הקשורים פרו דלקתיות. משמעות הדבר היא כי ליגנדים המופרשים על ידי הגידול אינם מספיקים כדי לגרום לביטוי גנים פרו דלקתיים בעצמם, או אם יש הפעלה חיסונית על ידי הפרשות גידול, ליגנדים פרצרין מספיקים כדי לדכא אותו לרמות המקומיות שלה. שיטת שיתוף זו ממחישה כי כאשר מקרופאגים מקוטבים על ידי אינטרפרון גמא ו- LPS מתורבתים בנוכחות תאים סרטניים, דיכוי ביטוי גנים הקשורים לדלקת הופחת בשיעור של עד 60%A רמה דומה של דיכוי גנים מקרופאגים פרו דלקתיים נצפתה כאשר קו תא המקרופג' המורין J774 מוחלף במקרופאגים הצפקים.עבודה קודמת זיהתה חלבון S כגורם מופרש בגידול שיכול לעכב הפעלת מקרופאג', כך מודל התמיכה בממברנה חדירה שיתוף תרבות משמש בשילוב עם lysA כדי להתוות את הריכוז של חלבון S במדיה מותנה לאחר 24 שעות. במדיה מותנה של אינטרפרון גמא ו LPS שטופלו B16F10 מלנומה תאים, חלבון S מתבטא בריכוז של כ 475 ננוגרם למיליליטר. מקרופאגים צפי שטופלו באותם תנאים הביעו חלבון S בכ 61 ננוגרם למיליליטר.מעניין, כאשר מתורבתים במשותף, הריכוז של חלבון S בגמא אינטרפרון ואת LPS מטופלים היטב היה כ 86 ננוגרם למיליליטר. הדבר מצביע על כך שמאקרופאגים בולעים חלבון S המופרש בגידולים או שכמות החלבון S המופרשת על ידי תאי B16F10 יורדת באופן משמעותי כאשר הם נמצאים בנוכחות מקרופאגים. תוצאות אלה מדגישות שינויים עמוקים של הפעלת מקרופג ואיתות פרצרין כאשר מקרופאגים מתורבתים במשותף עם תאים סרטניים.שיטת השיתוף של טרנסוול יכולה לענות על מגוון שאלות הנוגעות לאיתות פרצרין. ניתוח כתם מערבי יכול להתבצע כדי לקבוע כיצד חלבונים המופרשים על ידי הגידול משנים מסלולי איתות שונים במקרופאגים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

אפיון של קרום התא הרחבות ולימוד תפקידיהם סרטן התא אדהזיה דינמיקה

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

השפעות כפול של מלנומה נגזר תא גורמים על בידול Adipocytes מח עצם

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

לימוד השפעות קרינת העור נורמלי באמצעות מטריקס הידרותאי הידרו

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...