Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

एरिक उबिल को अमेरिकन कैंसर सोसायटी पोस्टडॉक्टोरल फेलोशिप (128770-पीएफ-15-216-01-LIB) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। इस काम को एचएसई को एनआईएच (R01-CA205398) और ब्रेस्ट कैंसर रिसर्च फाउंडेशन अवार्ड (बीसीआरएफ-18-041) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

फसल और मूत्र पेरिटोनियल मैक्रोफेज के उपयोग से संबंधित सभी प्रक्रियाओं चैपल हिल (यूएनसी) में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में आयोजित किया गया था और यूएनसी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वा?...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors.">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li><li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages:+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth.">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li><li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

सह संस्कृति यहां प्रस्तुत परख पहले से स्थापित परख का एक संशोधन है कि ट्यूमर के अध्ययन के लिए अनुमति देता है प्रतिरक्षा सेल सक्रियण पर गुप्त कारकों । जबकि सेल सेल संपर्क प्रतिरक्षा गतिविधि में परिवर्त?...

हाल के अध्ययनों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा पता लगाने से बचने के लिए कैंसर कोशिकाओं की क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया है, स्थानीय प्रतिरक्षा सक्रियण को दबाने, या ट्यूमर माइक्रोवातावरण में एक सहरोगी ट्यूमर-स्वतंत्र परिवेश का उत्पादन करने के लिए । ट्यूमर और प्रतिरक्षा कोशिका बातचीत के दो व्यापक वर्गों का वर्णन किया गया है कि इन प्रभावों की सुविधा: संपर्क मध्यस्थता बातचीत या ट्यूमर स्रावित ligands । ट्यूमर द्वारा उपयोग किए जाने वाले संपर्क-मध्यस्थता प्रतिरक्षा अवरोध के सबसे अच्छी तरह से अध्ययन और चिकित्सकीय पथन्तर तंत्रमें से एक पीडी-एल 1 की अभिव्यक्ति है, जो टी कोशिकाओं पर पीडी-1 के साथ उनकी सक्रियता और कार्य1,2को बाधित करने के लिए बातचीत करता है। इंटरफेरॉन-गामा (IFNο) के जवाब में, जो कई सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है, ट्यूमर कोशिकाएं पीडी-एल1 की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकती हैं ताकि पीडी-1 की थकावट को प्रेरित किया जा सके-सक्रिय टी कोशिकाओं को व्यक्त करना, जिससे उन्हें ट्यूमर कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से समाप्त करने से रोका जा सके3। पीडी-एल1 और पीडी-1 के बीच बातचीत को अवरुद्ध करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग वर्तमान में मनुष्यों में कई कैंसर प्रकारों के इलाज के लिए किया जाता है4। इस नैदानिक सफलता और दूसरों के प्रकाश में, ट्यूमर-व्युत्पन्न इम्यूनोसप्रेसिव तंत्र की पहचान और लक्ष्यीकरण पर ध्यान दिया गया है।
अनुकूली प्रतिरक्षा के दमन से परे, ट्यूमर भी कारकों है कि सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को दबाने स्राव करने के लिए जाना जाता है । ट्यूमर-6, आईएल-10, VEGF, आईएल-23, और कॉलोनी उत्तेजक कारक (सीएसएफ-1) सहित ट्यूमर-व्युत्पन्न या ट्यूमर प्रेरित स्राव, प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं, ग्रैन्युलोसाइट्स, और ट्यूमर माइक्रोएनवातावरण5,6,7में डेंग्ड्रिटिक कोशिकाओं के एंटीट्यूमर प्रतिक्रियाओं को बाधित करने के लिए दिखाया गया है । ट्यूमर कोशिकाएं उन कारकों को भी स्रावित कर सकती हैं जो टी सेल सक्रियण8,9के दमन को बढ़ावा देने के लिए ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में माइलॉयड-व्युत्पन्न कोशिकाओं की भर्ती और भेदभाव को तिरछा करते हैं।
जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका का एक प्रकार है कि ट्यूमर प्रगति पर गहरा प्रभाव पड़ता है मैक्रोफेज है । कई वर्षों के लिए, ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs) की उपस्थिति रोगी अस्तित्व10के एक नकारात्मक शकुन के रूप में इस्तेमाल किया गया है । यह अवधारणा जो इम्यूनोसप्रेसिव टीएएमएस ट्यूमर की प्रतिरक्षा कोशिका-मध्यस्थता निकासी को गीला करती है, उसे 40 साल पहले11से अधिक समय पहले पेश किया गया था। हाल ही में, यह दिखाया गया है कि मैक्रोफेज समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया को डाउनरेकेश किया जा सकता है जबकि ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में ट्यूमर फेनोटाइप समर्थक को प्रेरित किया जा सकता है। ये इम्यूनोप्रेसिव मैक्रोफेज एक सहरोग्य प्रतिक्रिया में योगदान कर सकते हैं, ट्यूमर प्रगति और कीमो के प्रतिरोध ड्राइविंग-और इम्यूनोथेरेपी12। यह देखते हुए कि मैक्रोफेज अक्सर ट्यूमर के साथ सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स में से एक होते हैं, उनके ट्यूमर-विशिष्ट प्रतिरक्षा गतिविधि की बहाली कैंसर विरोधी चिकित्साविज्ञान 13के लिए संभावित लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करती है।
जबकि ट्यूमर कोशिकाओं और मैक्रोफेज के बीच संपर्क-मध्यस्थता बातचीत प्रत्यक्ष सहसंस्कृति के माध्यम से मॉडलिंग की जा सकती है, permeable झिल्ली का उपयोग करता है स्पष्ट कर सकते है जो ट्यूमर स्रावित कारक ट्यूमर के संभावित भ्रामक प्रभाव के बिना इम्यूनोमोडुलेटरी-प्रतिरक्षा सेल सेल संपर्क कर रहे हैं । कुछ इसी तरह के तरीकों का उपयोग करना, दूसरों माइक्रोग्लिया में स्रावित कारकों की पहचान करने की क्षमताका प्रदर्शन किया है/ हमने एलपीएस और इंटरफेरॉन-गामा16के साथ पेरिटोनियल मैक्रोफेज की उत्तेजना के बाद एक ट्यूमर-स्रावित प्रोटीन, प्रो1 की भूमिका को चित्रित करने के लिए इस सह-संस्कृति तकनीक का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। यहां हम एक सीधी पद्धति का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग यह पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है कि ट्यूमर-स्रावित कारक मैक्रोफेज सक्रियण को कैसे प्रभावित कर सकते हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

ट्यूमर-व्युत्पन्न पैराक्रिन सिग्नलिंग स्थानीय इम्यूनोसप्रेसिंग का एक अनदेखा घटक है और निरंतर कैंसर के विकास और मेटाटैसिस के लिए एक स्वतंत्र वातावरण का कारण बन सकता है। पैराक्रिन संकेतों में विभिन्न सेल प्रकारों के बीच सेल-सेल संपर्क शामिल हो सकता है, जैसे कि टी कोशिकाओं की सतह पर पीडी-1 के साथ सीधे बातचीत करने वाले ट्यूमर की सतह पर व्यक्त किए गए ट्यूमर की सतह पर व्यक्त किया जाता है, या प्रतिरक्षा कोशिका को प्रभावित करने के लिए ट्यूमर सेल द्वारा लिगांड का स्राव होता है। यहां हम प्रतिरक्षा कोशिका (मैक्रोफेज) सक्रियण पर ट्यूमर-स्रावित लिगांड के प्रभावों से पूछताछ करने के लिए एक सह-संस्कृति विधि का वर्णन करते हैं। यह सीधी प्रक्रिया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 0.4 माइक्रोन पॉलीकार्बोनेट झिल्ली परगम्य समर्थन और मानक ऊतक संस्कृति प्लेटों का उपयोग करती है। वर्णित प्रक्रिया में, मैक्रोफेज ऊपरी कक्ष और निचले कक्ष में ट्यूमर कोशिकाओं में सुसंस्कृत हैं। 0.4 माइक्रोन बाधा की उपस्थिति शारीरिक संपर्क के जटिल चर के बिना इंटरकोशियलर सिग्नलिंग के अध्ययन के लिए अनुमति देती है, क्योंकि दो सेल प्रकार एक ही माध्यम और पैराक्रिन लिगांड के संपर्क को साझा करते हैं। इस दृष्टिकोण को दूसरों के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे मैक्रोफेज के आनुवंशिक परिवर्तन (उदाहरण के लिए, आनुवंशिक नॉक-आउट चूहों से अलगाव) या ट्यूमर (जैसे, CRISPR-मध्यस्थता परिवर्तन) विशिष्ट स्रावित कारकों और रिसेप्टर्स की भूमिका का अध्ययन करने के लिए। यह दृष्टिकोण दो सेल आबादी को अलग करने के लिए प्रवाह छंटाई की आवश्यकता के बिना, मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) या पश्चिमी दाग विश्लेषण जैसे मानक आणविक जैविक विश्लेषणों को भी उधार देता है। एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (ELISAs) इसी तरह कई सेल प्रकार के संदर्भ में सेल सिग्नलिंग की गतिशील बातचीत को बेहतर ढंग से समझने के लिए स्रावित लिगांड को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है। सह-संस्कृति की अवधि को अस्थायी विनियमित घटनाओं के अध्ययन के लिए भी विविध किया जा सकता है। यह सह-संस्कृति विधि एक मजबूत उपकरण है जो प्रतिरक्षा संदर्भ में ट्यूमर-स्रावित संकेतों के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है।

मैक्रोफेज ध्रुवीकरण पर ट्यूमर-स्रावित लिगांड के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, वर्णित प्रक्रिया का उपयोग किया गया था। ट्यूमर कोशिकाओं की अनुपस्थिति में सुसंस्कृत पेरिटोनियल मैक्रोफेज का उपयोग नक...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

यहां, हम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबाने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा उपयोग किए जाने वाले गैर-संपर्क पैराक्रिन सिग्नलिंग के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए पारगम्य झिल्ली का उपयोग करके एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह प्रणाली मैक्रोफेज सक्रियण को गीला करने में ट्यूमर-स्रावित कारकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी है।

पारगम्य झिल्ली समर्थन के साथ सह संस्कृति का उपयोग कर मैक्रोफेज सक्रियण पर ट्यूमर स्रावित पैराक्रिन लिगांड्स के प्रभाव का अध्ययन

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

इस ट्रांसवेल सह-संस्कृति विधि का उपयोग प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबाने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा उपयोग किए जाने वाले पैराक्राइन सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इस विधि का उपयोग उपन्यास स्रावित लिगांड की खोज के साथ-साथ उनके प्रतिरक्षा दमनकारी प्रभावों के मशीनी आधार को खोजने के लिए किया जा सकता है। हमने पहले इस विधि का उपयोग यह दिखाने के लिए किया है कि ट्यूमर-स्रावित कारक मैक्रोफेज प्रो-भड़काऊ जीन ट्रांसक्रिप्शन को कैसे गीला कर सकते हैं।हमारा मानना है कि इस उपकरण ट्यूमर व्युत्पन्न प्रतिरक्षा दमन के अध्ययन में व्यापक निहितार्थ है । इस तकनीक के मुख्य फायदों में से एक यह है कि इसका उपयोग कोशिका-से-सेल संपर्क के संभावित भ्रामक चर के बिना ट्यूमर कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच पैराक्रिन सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह मंच डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रकार की आणविक जैविक तकनीकों के लिए भी उत्तरदायी है।पेरिटोनियल मैक्रोफेज की कटाई के बाद, उन्हें सीधे 0.4 माइक्रोमीटर पॉलिएस्टर झिल्ली के ऊपरी कक्षों में प्लेट करें सह-संस्कृति छह-अच्छी प्लेट डालें। फिर अच्छी तरह से पूरक डीएमईएम जोड़ा गया कि शीर्ष कक्ष में एक मिलीलीटर होता है और नीचे के कक्ष में 1.5 मिलीलीटर होते हैं। तीन दिनों के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।सबसे पहले, संस्कृति अपने संबंधित माध्यम में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्यूमर कोशिकाओं, एटीसीसी के बाद ऊतक संस्कृति के तरीकों की सिफारिश की । इसके बाद, पीबीएस के साथ एक बार अनुयायी ट्यूमर कोशिकाओं को धोएं। EDTA में 0.05% ट्राइप्सिन जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।फिर एफबीएस युक्त मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। गोली के लिए पांच मिनट के लिए २२० बार जी पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र की कुल संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करें । अपकेंद्रित्र के दौरान, पारगम्य झिल्ली समर्थन प्लेटों वाले मैक्रोफेज के ऊपरी और निचले कक्षों से माध्यम को एस्पिरेट करें और ताजा माध्यम से प्रतिस्थापित करें।निचले कक्षों के लिए जहां ट्यूमर कोशिकाओं को चढ़ाया जाएगा, सेल इसके अलावा के लिए पर्याप्त मात्रा छोड़ने के लिए 1.5 मिलीलीटर के बजाय माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ भरें। जब अपकेंद्रित्र पूरा हो जाता है, तो गोली ट्यूमर कोशिकाओं से माध्यम को एस्पिरेट करें और 300, 000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर पूरक डीएमईएम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। वांछित कुओं के निचले कक्ष में इस सेल निलंबन के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।मैक्रोफेज समर्थक भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, 50 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर और एलपीएस की एकाग्रता पर इंटरफेरॉन गामा को जोड़कर अकेले या सह-संस्कारी मैक्रोफेज का इलाज करें। आवश्यकतानुसार संस्कृति में उपचार के समय की अवधि भिन्न करें। मैक्रोफेज सक्रियण दो घंटे के भीतर होता है, और कुछ ट्यूमर-मध्यस्थता दमन आठ घंटे तक होता है।24 घंटे के लिए सह संस्कृति मजबूत और लगातार ट्यूमर व्युत्पन्न दमन पैदावार । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, संस्कृति मैक्रोफेज अकेले और अनुपचारित छोड़ दें। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, नमूनों के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही सांद्रता पर इंटरफेरॉन गामा और एलपीएस के साथ अकेले-संस्कारी मैक्रोफेज का इलाज करें।वांछित इनक्यूबेशन समय बीत जाने के बाद, परीक्षण की जरूरतों के आधार पर वांछित कोशिका lysate या शर्त संस्कृति माध्यम को अलग करें। मात्रात्मक पॉलीमरेज चेन रिएक्शन एनालिसिस के लिए सेल lysate को अलग करने के लिए, कुएं के दोनों कक्षों से माध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस के दो मिलीलीटर के साथ एक बार धोएं। मैक्रोफेज वाले शीर्ष कक्ष में आरएनए लाइसिस बफर लागू करें।इसके बाद, धीरे-धीरे झिल्ली को परिमार्जन करें ताकि सेल को जारी किया जा सके और आरएनए आइसोलेशन किट निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आगे के प्रसंस्करण के लिए इसे संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सके। यहां वर्णित सह-संस्कृति विधि में शारीरिक संपर्क के बिना मैक्रोफेज और ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृति शामिल है। ट्यूमर कोशिकाओं की अनुपस्थिति में सुसंस्कृत पेरिटोनियल मैक्रोफेज का उपयोग नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है।पेरिटोनियल मैक्रोफेज B16F10 ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति में सह-सुसंस्कृत लेकिन उत्तेजनाओं को सक्रिय किए बिना समर्थक भड़काऊ जुड़े जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि नहीं करते हैं। इसका मतलब यह है कि ट्यूमर-स्रावित लिगामेंट्स या तो खुद से प्रो-भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं, या यदि ट्यूमर स्राव द्वारा प्रतिरक्षा सक्रियण है, तो पैराक्राइन लिगांड इसे अपने मूल स्तर तक दबाने के लिए पर्याप्त हैं। यह सह-संस्कृति विधि दिखाती है कि जब इंटरफेरॉन गामा और एलपीएस द्वारा ध्रुवीकृत मैक्रोफेज ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति में सुसंस्कृत होते हैं, तो सूजन से जुड़े जीन अभिव्यक्ति के दमन को 60% से कम कर दिया गया था मैक्रोफेज प्रो-भड़काऊ जीन दमन का एक तुलनीय स्तर तब मनाया जाता है जब मुरीन मैक्रोफेज सेल लाइन J774 पेरिटोनियल मैक्रोफेज के लिए प्रतिस्थापित किया जाता है।पिछले काम एक ट्यूमर स्रावित कारक है कि मैक्रोफेज सक्रियण को बाधित कर सकते है के रूप में प्रोटीन एस की पहचान की है, तो पारम झिल्ली समर्थन सह संस्कृति मॉडल एक lysA के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है 24 घंटे के बाद वातानुकूलित मीडिया में प्रोटीन एस की एकाग्रता परख । इंटरफेरॉन गामा और एलपीएस-इलाज B16F10 मेलानोमा कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया में, प्रोटीन एस लगभग 475 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता में व्यक्त किया जाता है। एक ही परिस्थितियों में इलाज पेरिटोनियल मैक्रोफेज ने लगभग 61 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर पर प्रोटीन एस व्यक्त किया।दिलचस्प बात यह है कि जब सह-संस्कारी, इंटरफेरॉन गामा और एलपीएस-इलाज में प्रोटीन एस की एकाग्रता लगभग 86 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर थी। इससे पता चलता है कि या तो मैक्रोफेज ट्यूमर-स्रावित प्रोटीन एस को निगलते हैं या कि मैक्रोफेज की उपस्थिति में B16F10 कोशिकाओं द्वारा स्रावित प्रोटीन एस की मात्रा में काफी कमी आई है। ये परिणाम मैक्रोफेज सक्रियण और पैराक्रिन सिग्नलिंग के गहन परिवर्तनों को उजागर करते हैं जब मैक्रोफेज ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी होते हैं।ट्रांसवेल सह-संस्कृति विधि पैराक्राइन सिग्नलिंग से संबंधित कई तरह के सवालों के जवाब दे सकती है । पश्चिमी दाग विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए आयोजित किया जा सकता है कि कैसे ट्यूमर-स्रावित प्रोटीन मैक्रोफेज में विभिन्न सिग्नलिंग रास्तों को बदल देते हैं।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Imaginal डिस्क ट्यूमर आदर्श: दृश्य और जीन अभिव्यक्ति और ट्यूमर invasiveness की मात्रा जेनेटिक मोज़ाइक का प्रयोग

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

ऑस्टियो में फेफड़े के मेटास्टेसिस परख का उपयोग मेटास्टेटिक फेफड़ों औपनिवेशीकरण अध्ययन में व्यावहारिक विचार

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

कोशिका झिल्ली एक्सटेंशन के लक्षण वर्णन और कैंसर कोशिका आसंजन गतिशीलता में उनकी भूमिका का अध्ययन

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

विषाक्तता Oxidative तनाव के आकलन के लिए इमेजिंग दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग Fluorogenic सेंसर का उपयोग

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

मेलेनोमा कोशिका के दोहरे प्रभाव-अस्थि मज्जा Adipocytes भेदभाव पर व्युत्पंन कारकों

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal लुगदी ऊतक और सह कैंसर कोशिकाओं के साथ संस्कृति से कोशिका अलगाव स्टेम उनके बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

बोन रीमॉडलिंग को मापने और Calvaria सह संस्कृति और हिस्टोमोर्पोमेट्री का उपयोग कर ट्यूमर हड्डी माइक्रोएनवायरमेंटल पुनः बनाने

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Extracellular मैट्रिक्स hydrogels का उपयोग कर सामान्य ऊतक विकिरण प्रभाव का अध्ययन

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

उच्च संकल्प Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी ट्यूमर स्फीरॉइड आक्रमण पर Migrastatic inhibitors के प्रभाव का चरित्र

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

प्रवासन और सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पैटर्न वाले न्यूरॉन्स पर ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम जैसी कोशिकाओं की सह-संस्कृति

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...