Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
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エリック・ユービルは、部分的には、アメリカ癌学会博士フェローシップ(128770-PF-15-216-01-LIB)によって資金提供されました。この研究は、NIH(R01-CA205398)と乳がん研究財団賞(BCRF-18-041)からHSEへの助成金によって支援されました。

マウス腹腹マクロファージの収穫と使用に関連するすべての手順は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校(UNC)で行われ、UNC機関動物ケア使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. マクロファージ文化
注: この手順では、一次腹腹マクロファージ(後述)、骨髄由来マクロファージ、またはJ774(ATCC)またはRAW264(ATCC)などのマクロファージ細胞株を利用で...

<ol>
	<li>Freeman, G. 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(138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. 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ここで提示される共培養アッセイは、免疫細胞活性化に関する腫瘍分泌因子の研究を可能にする、以前に確立されたアッセイの改変である。細胞間接触は免疫活性の変化を誘導することが知られているが、腫瘍分泌リガンドが免疫活性化を調節する能力はあまりよく理解されていない。直接的な共培養とは異なり、腫瘍由来の分泌因子が接触媒介シグナル伝達の混同性なしに免疫細胞活性化?...

最近の研究では、免疫細胞による検出を回避し、局所免疫活性化を抑制し、腫瘍微小環境でトレロゲン性腫瘍寛容ミリウーを産生する癌細胞の能力に焦点を当てている。これらの効果を促進する腫瘍および免疫細胞相互作用の2つの広範なクラスが記載されている:接触媒介相互作用または腫瘍分泌リガンド。腫瘍によって利用される接触媒介性免疫阻害の最もよく研究され、臨床的にトラクタブルなメカニズムの1つは、それらの活性化および機能1、2を阻害するためにT細胞上のPD-1と相互作用するPD-L1の発現である。多数の活性化免疫細胞によって発現されるインターフェロン-γ(IFNγ)に応答して、腫瘍細胞はPD-1発現活性化T細胞の枯渇を誘導するPD-L1の発現を増加させることができ、それによって腫瘍細胞3を効果的に根絶することを防止する。PD-L1とPD-1との相互作用を遮断する抗体の使用は、現在、ヒト4における複数の癌タイプを治療するために使用されている。この臨床的成功などに照らして、腫瘍由来免疫抑制機構の同定と標的化が注目を集めている。
適応免疫の抑制を超えて、腫瘍は先天性免疫細胞の炎症性応答を抑制する因子を分泌することも知られている。IL-6、IL-10、VEGF、IL-23、およびコロニー刺激因子(CSF-1)を含む腫瘍由来または腫瘍誘発分泌物は、腫瘍微小環境におけるナチュラルキラー(NK)細胞、顆粒球、および樹状細胞の抗腫瘍応答を阻害することが示されている。腫瘍細胞はまた、腫瘍微小環境における骨髄由来細胞のリクルートおよび分化を歪める因子を分泌し、T細胞活性化の抑制を促進することができる8、9である。
腫瘍進行に大きな影響を与える先天性免疫細胞の一種がマクロファージである。長年にわたり、腫瘍関連マクロファージ(AM)の存在は、患者生存期間10の陰性予後として使用されてきた。免疫抑制性のTAMが腫瘍の免疫細胞媒介クリアランスを減衰させるという概念は、40年以上前に導入されました。さらに最近では、マクロファージ前炎症反応はダウンレギュレートされ、腫瘍微小環境ではプロ腫瘍表現型を誘導できることが示されている。これらの免疫抑制マクロファージは、トレロゲン応答に寄与し、腫瘍の進行および化学および免疫療法12に対する耐性を駆動する。マクロファージは、多くの場合、腫瘍を有する最も豊富な白血球の一つであることを考えると、それらの腫瘍特異的免疫活性の回復は、抗癌治療のための潜在的な標的を表す13。
腫瘍細胞とマクロファージ間の接触媒介性相互作用は直接共培養によってモデル化することができるが、透過性膜支持体の使用は、腫瘍免疫細胞間接触の潜在的に混乱する影響なしに、どの腫瘍分泌因子が免疫調節可能かを解明することができる。幾分類似した方法を用いて、他の人は、ミクログリア/ニューロン相互作用14における分泌因子ならびに中皮細胞15との腫瘍細胞における分泌因子を同定する可能性を実証した。我々はまた、LPSおよびインターフェロン-γ16を用いた腹腹マクロファージの刺激後の炎症性遺伝子発現の抑制剤として、腫瘍分泌タンパク質Pros1の役割を特徴付けるために、この共培養技術を使用することに成功した。ここでは、腫瘍分泌因子がマクロファージ活性化にどのような影響を与えるかを調べたりできる簡単な方法論について説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

腫瘍由来パラクリンシグナル伝達は、局所免疫抑制の見落とされた成分であり、継続的な癌増殖および転移のための寛容な環境につながる可能性があります。パラクリンシグナルは、T細胞の表面上でPD-1と直接相互作用する腫瘍の表面に発現するPD-L1のような異なる細胞型間の細胞間接触、または腫瘍細胞によるリガンドの分泌を含むことができる。ここでは、腫瘍分泌リガンドが免疫細胞(マクロファージ)活性化に及ぼす影響を問う共培養法について説明する。この簡単な手順は市販の0.4μmポリカーボネート膜透過性支持および標準的な組織培養プレートを利用する。記載されたプロセスにおいて、マクロファージは、下房内の上部チャンバーおよび腫瘍細胞で培養される。0.4 μmバリアの存在は、2つの細胞型が同じ培地を共有し、パラクリンリガンドへの暴露を行うので、物理的接触の交絡変数なしで細胞間シグナル伝達の研究を可能にする。このアプローチは、マクロファージの遺伝的変化(例えば、遺伝的ノックアウトマウスからの単離)または腫瘍(例えば、CRISPR媒介性変化)などの他の人と組み合わせて、特定の分泌因子および受容体の役割を研究することができる。このアプローチは、2つの細胞集団を分離するために流れの選別を必要とせずに、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)またはウェスタンブロット分析などの標準的な分子生物学的分析にも適しています。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)も同様に、分泌されたリガンドを測定し、多細胞型文脈における細胞シグナル伝達の動的相互作用をよりよく理解することができる。共培養の期間は、時間的に調節された事象の研究のためにも変化させることができる。この共培養法は、免疫コンテキストにおける腫瘍分泌シグナルの研究を容易にする堅牢なツールである。

腫瘍分泌リガンドがマクロファージ偏光に及ぼす影響を判定するために、記載された手順を利用した。腫瘍細胞の非存在下で培養した腹蓋マクロファージは、陰性(未処理=左端)および陽性(IFNγおよびLPS刺激=左から2番目)対照として用いた(図2A)。あるいは、腹膜マクロファージをB16F10黒色腫腫瘍細胞(ATCC)と共培養した(図1A)。めっき直後、細...

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Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

ここでは、腫瘍細胞が免疫応答を抑制するために使用する非接触パラクリンシグナル伝達の研究を容易にするために透過性膜支持体を用いる方法を提示する。このシステムは、マクロファージ活性化を減衰させる腫瘍分泌因子の役割を研究することに適している。

透過性膜支持体との共培養を用いたマクロファージ活性化に及ぼす腫瘍分泌パラクリンリガンドの効果の研究

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

このトランスウェル共培養法は、免疫応答を抑制するために腫瘍細胞が使用するパラクリンシグナル伝達を研究するために用いられる。この方法は、新しい分泌リガンド、ならびに免疫抑制効果の機械主義的基盤を発見するために使用することができる。我々は以前、この方法を使用して、腫瘍分泌因子がマクロファージ炎症促進遺伝子転写を減衰させる方法を示した。このツールは、腫瘍由来免疫抑制の研究に広範な意味を持つと考えています。この技術の主な利点の1つは、細胞間接触の潜在的に交和変数を伴わずに腫瘍細胞と免疫細胞の間のパラクリンシグナル伝達を研究するために使用できることである。このプラットフォームは、下流分析のための様々な分子生物学的手法にも適しています。腹膜マクロファージを収穫した後、0.4マイクロメートルのポリエステル膜挿入の上の部屋に直接それらをプレートする6ウェルプレートを含む。その後、上部のチャンバーが1ミリリットルを含み、底のチャンバーが1.5ミリリットルを含むようなウェルに添加されたDMEMを加えた。5%の二酸化炭素で摂氏37度で3日間インキュベートします。まず、それぞれの培地で市販の腫瘍細胞を培養し、ATCC推奨組織培養方法に従う。次に、接着性腫瘍細胞をPBSで1回洗浄する。EDTAに0.05%トリプシンを加え、細胞が切り離されるまで摂氏37度でインキュベートします。次に、FBS を含むメディアのセルを再中断します。ヘモサイトメーターまたはセルカウンターを使用して、細胞と遠心分離機の総数をGの220倍のペレットに5分間定量します。遠心分離の間、透過性膜支持プレートを含むマクロファージの上下のチャンバーから培地を吸引し、新鮮な培地に交換する。腫瘍細胞がメッキされる下部のチャンバーの場合、細胞の添加に十分な体積を残すために1.5ミリリットルではなく1ミリリットルの培地で満たします。遠心分離が完了したら、ペレット化された腫瘍細胞から培地を吸引し、1ミリリットル当たり300,000個の濃度で補充されたDMEM中の細胞を再懸濁する。所望のウェルの下の部屋にこの細胞懸濁液の0.5ミリリットルを加える。マクロファージの炎症促進遺伝子発現を誘導するには、1ミリリットル当たり100ナノグラムのインターフェロンガンマを加え、LPSを1ミリリットル当たり50ナノグラムの濃度で添加して、1回または共同培養マクロファージを治療する。必要に応じて、培養での治療時間を変更します。マクロファージの活性化は2時間以内に起こり、腫瘍媒介抑制は8時間までに起こる。24時間の共培養は、堅牢で一貫した腫瘍由来抑制をもたらす。ネガティブコントロールとして、文化マクロファージは1人で放置します。陽性対照として、インターフェロンガンマとLPSを用いて、サンプルに使用されるのと同じ濃度で、1回培養したマクロファージを治療する。所望のインキュベーション時間が経過した後、試験の必要性に応じて必要に応じて細胞のライセートまたは条件培地を分離する。定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析のために細胞ライセートを分離するために、ウェルの両チャンバーから培地を吸引し、PBSの2ミリリットルで1回洗浄する。マクロファージを含む上部チャンバーにRNAライシスバッファーを適用します。この後、膜を静かに掻き取って細胞のライセートを放出し、それを回収管に移して、RNA分離キットメーカーのプロトコルに従ってさらに処理します。ここで説明する共培養法は、物理的接触を伴わないマクロファージおよび腫瘍細胞の培養を含む。腫瘍細胞の不在時に培養した腹膜マクロファージは、陰性および陽性対照として使用される。B16F10腫瘍細胞の存在下で共培養された腹膜マクロファージは、刺激を活性化しないが、炎症促進関連遺伝子の発現を増加させない。これは、腫瘍分泌リガンドが単独で炎症促進遺伝子発現を誘導するのに十分でないか、または腫瘍分泌による免疫活性化がある場合、パラクリンリガンドがその天然レベルまでそれを抑制するのに十分であることを意味する。この共培養法は、インターフェロンガンマとLPSによって分極したマクロファージが腫瘍細胞の存在下で培養される場合、マウスマクロファージ細胞株J774が腹膜マクロファージに代用されると、炎症関連遺伝子発現の抑制が60%も減少したマクロファージプロ炎症遺伝子抑制が観察されることを示す。これまでの研究では、マクロファージ活性化を阻害できる腫瘍分泌因子としてプロテインSを同定しており、透過性膜支持共培養モデルは、24時間後に調整された培地中のプロテインSの濃度をアッセイするためにライサと組み合わせて使用されている。インターフェロンガンマおよびLPS処理B16F10黒色腫細胞からのコンディションされた培地では、プロテインSは、1ミリリットル当たり約475ナノグラムの濃度で発現される。腹膜マクロファージは、同じ条件で処理されたプロテインSを、1ミリリットル当たり約61ナノグラムで発現した。興味深いことに、共培養した場合、インターフェロンガンマとLPS処理ウェルにおけるプロテインSの濃度は、1ミリリットル当たり約86ナノグラムであった。これは、マクロファージが腫瘍分泌タンパク質Sを摂取するか、またはマクロファージの存在下でB16F10細胞によって分泌されるタンパク質Sの量が実質的に減少することを示唆している。これらの結果は、マクロファージが腫瘍細胞と共培養される場合のマクロファージ活性化およびパラクリンシグナル伝達の深い変化を強調する。トランスウェルの共培養法は、パラクリンシグナル伝達に関する様々な質問に答えることができます。ウェスタンブロット分析を行い、腫瘍分泌タンパク質がマクロファージの様々なシグナル伝達経路をどのように変化させるかを調べることができます。

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