Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

에릭 우빌은 부분적으로 미국 암 학회 박사 후 펠로우십 (128770-PF-15-216-01-LIB)에 의해 지원되었습니다. 이 연구는 NIH(R01-CA205398)의 보조금과 유방암 연구 재단 상(BCRF-18-041)에서 HSE에 수여되었습니다.

유린 복막 대식세포의 수확 및 사용과 관련된 모든 절차는 채플 힐 (UNC)의 노스 캐롤라이나 대학에서 실시되었으며 UNC 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 대식세포 문화
참고: 이 절차는 1 차적인 맥기 대식세포 (아래에 자세히 설명함), 골수 유래 대식세포, 또는 J774 (ATCC) 또는 RAW264 (ATCC)와 같은 대식세포 세포주를 이용할 수 있습?...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors.">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li><li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages:+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth.">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li><li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

여기에서 제시된 공동 문화 분석법은 면역 세포 활성화에 종양 분비 요인의 연구를 허용하는 이전에 확립된 분석법의 수정입니다. 세포-세포 접촉은 면역 활동에 있는 변경을 유도하기 위하여 알려지는 동안, 면역 성 활성화를 조절하는 종양 분비 리간드의 기능은 잘 이해되지 않습니다. 우리는 직접적인 공동 배양과는 달리, 종양 유래 분비 요인이 접촉 매개 신호의 혼란스러운 특성 없이 면역 ?...

최근 연구는 면역 세포에 의한 검출을 피하고, 국소 면역 활성화를 억제하거나, 종양 미세 환경에서 내성 종양 허용 밀리를 생산하는 암세포의 능력에 초점을 맞추고 있다. 종양과 면역 세포 상호 작용의 2개의 넓은 종류는 이 효력을 촉진하는 기술되었습니다: 접촉 중재한 상호 작용 또는 종양 분비 한 리간드. 종양에 의해 이용되는 접촉 매개 면역 억제의 가장 잘 연구되고 임상적으로 견인가능한 메커니즘 중 하나는 그들의 활성화 및 기능을 억제하기 위해 T 세포에 PD-1과 상호 작용하는 PD-L1의 발현이다1,2. 다수의 활성화된 면역 세포에 의해 발현되는 인터페론 감마(IFNγ)에 반응하여, 종양 세포는 PD-L1의 발현을 증가시켜 활성 T 세포를 발현하여, 이를 효과적으로 종양 세포를 근절하지 못하게 한다3. PD-L1과 PD-1 사이의 상호 작용을 차단하는 항체의 사용은 현재 인간4에서여러 암 유형을 치료하는 데 사용된다. 이러한 임상적 성공 및 기타에 비추어, 종양 유래 면역억제 메커니즘의 식별 및 표적화는 점점 더 주목을 받고 있다.
적응 면역의 억제를 넘어, 종양은 또한 선천적인 면역 세포의 프로 염증 반응을 억제 하는 요인을 분 비 하는 것으로 알려져 있습니다. IL-6, IL-10, VEGF, IL-23 및 콜로니 자극 인자(CSF-1)를 포함하는 종양 유래 또는 종양 유도 분비물, 종양 미세환경5,6,7에서자연살인자(NK) 세포, 과립구 및 수지상 세포의 항종양 반응을 억제하는 것으로 나타났다. 종양 세포는 또한 종양 미세환경에서 골수성 유래 세포의 모집 및 분화를 왜곡하는 인자를 분비하여 T 세포활성화의억제를 촉진할 수 있다8,9.
종양 진행에 깊은 영향을 미치는 선천적인 면역 세포의 한 종류는 대식 세포입니다. 수년 동안, 종양 관련 대식세포(TAM)의 존재는 환자생존도 10의음성 예후로서 사용되어 왔다. 면역 억제 TAM이 종양의 면역 세포 매개 클리어런스를 약화시키는 개념은 40 년 전에11년 이상 소개되었습니다. 보다 최근에는, 대식세포 프로-염증 반응이 종양 미세환경에서 유도될 수 있는 동안 프로-종양 표현형이 하향 조절될 수 있음을 보여주었다. 이러한 면역억제 대식세포는 내성 반응에 기여할 수 있고, 종양 진행 및 화학요법및면역요법에대한 내성을 유도한다. 대식세포가 종종 종양과 함께 가장 풍부한 백혈구 중 하나라는 점을 감안할 때, 그들의 종양 특이적 면역 활성의 회복은 항암치료제(13)에대한 잠재적인 표적을 나타낸다.
종양 세포와 대식세포 사이의 접촉 매개 상호 작용은 직접 적인 공동 배양을 통해 모델링될 수 있는 동안, 투과성 막 지지체의 사용은 종양 분비 요인이 종양 면역 세포 세포 접촉의 잠재적으로 혼란스러운 영향 없이 면역 조절인 것을 해명할 수 있습니다. 다소 유사한 방법을 사용하여, 그 외는 중피 세포와 종양 세포뿐만 아니라 microglia/neuronal 상호 작용14에서 분비 된 인자를 식별할 수있는 잠재력을 입증했다15. 우리는 또한 LPS 및 인터페론 감마16을이용한 복막 대식세포의 자극 후 염증성 유전자 발현의 억제자로서 종양 분비 단백질, Pros1의 역할을 특성화하기 위해 이 공동 배양 기술을 성공적으로 사용하였다. 여기에서 우리는 종양 분비 요인이 대식세포 활성화에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 를 심문하기 위하여 이용될 수 있는 간단한 방법론을 기술합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

종양 유래 paracrine 신호는 국부적인 면역 억제의 간과된 분대이고 지속적인 암 성장 및 전이를 위한 관대한 환경으로 이끌어 낼 수 있습니다. 파라크린 신호는 T 세포의 표면에 PD-1과 직접 상호 작용하는 종양의 표면에 발현된 PD-L1과 같은 상이한 세포 유형 간의 세포 접촉, 또는 면역 세포에 영향을 미치는 종양 세포에 의한 리간드의 분비를 포함할 수 있다. 여기서 우리는 면역 세포(대식세포) 활성화에 대한 종양 분비 리간드의 효과를 심문하는 공동 배양 방법을 설명한다. 이 간단한 절차는 시판된 0.4 μm 폴리 카보네이트 멤브레인 투과성 지지대 및 표준 조직 배양 판을 이용합니다. 기재된 과정에서, 대식세포는 하부 챔버 내의 상부 챔버 및 종양 세포에서 배양된다. 0.4 μm 장벽의 존재는 두 세포 유형이 파라크린 리간드에 동일한 배지 및 노출을 공유하기 때문에 물리적 접촉의 혼란스러운 변수없이 세포 간 신호의 연구를 허용합니다. 이 접근법은 대식세포(예를 들어, 유전적 녹아웃 마우스로부터의 분리) 또는 종양(예를 들어, CRISPR 매개 변경)의 유전적 변경과 같은 다른 사람들과 결합되어 특정 분비 된 인자 및 수용체의 역할을 연구할 수 있다. 이 접근법은 또한 두 세포 집단을 분리하기 위한 유동 선별없이 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 또는 웨스턴 블롯 분석과 같은 표준 분자 생물학적 분석에 적합합니다. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISAs)은 유사하게 분비 된 리간드를 측정하여 다중 세포 유형 컨텍스트에서 세포 신호의 동적 상호 작용을 더 잘 이해하는 데 활용될 수 있다. 동시 조절 된 사건의 연구를 위해 공동 배양 기간은 또한 다양 할 수 있습니다. 이 공동 배양 방법은 면역 문맥에서 종양 분비 된 신호의 연구를 용이하게하는 강력한 도구입니다.

대식세포 편광에 대한 종양 분비 리간드의 효과를 확인하기 위해, 기재된 절차를 활용하였습니다. 종양 세포의 부재에서 배양된 맥막 대식세포는 음성(치료되지 않은 = 멀리 왼쪽) 및 양성(IFNγ 및 LPS 자극 = 왼쪽으로부터2nd) 대조군(도2A)으로사용하였다. 대안적으로, 맥막 대식세포는 B16F10 흑색종 종양 세포(ATCC)와 공동 배양하였다(도1A). 도금 직...

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Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

여기서, 우리는 종양 세포가 면역 반응을 억제하기 위해 사용하는 비접촉 파라크린 신호의 연구를 용이하게 하기 위해 투과막 지지대를 사용하는 방법을 제시한다. 시스템은 대식세포 활성화를 약화시키는 종양 분비 인자의 역할을 연구할 수 있습니다.

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

이러한 트랜스웰 공동 배양 방법은 종양 세포가 면역 반응을 억제하는 데 사용되는 파라크리인 신호를 연구하는 데 사용된다. 이 방법은 새로운 분비 리간드뿐만 아니라 면역 억제 효과의 기계론적 기초를 발견하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이전에 종양 분비 요인이 대식세포 프로 염증 유전자 전사를 약화시킬 수있는 방법을 보여주기 위해이 방법을 사용했다.우리는 이 공구가 종양 유래 면역 억제의 연구 결과에 있는 광범위한 연루가 있다고 믿습니다. 이 기술의 주요 장점 중 하나는 세포 대 세포 접촉의 잠재적으로 혼동 변수없이 종양 세포와 면역 세포 사이의 파라크리인 신호를 연구하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 플랫폼은 또한 다운스트림 분석을 위한 다양한 분자 생물학적 기술에 적합합니다.수막 대식대를 수확 한 후 0.4 마이크로 미터 폴리 에스테르 멤브레인의 상부 챔버로 직접 판화하여 공동 배양 6 웰 플레이트를 삽입하십시오. 그런 다음 상부 챔버에 1 밀리리터를 포함하고 하단 챔버는 1.5 밀리리터를 포함하도록 우물에 보충 DMEM을 추가했습니다. 이산화탄소 5%를 37도에서 3일간 배양합니다.첫째, ATCC 권장 조직 배양 방법에 따라 각각의 배지에서 상용화 가능한 종양 세포를 배양한다. 다음으로, PBS로 부착된 종양 세포를 한 번 씻는다. EDTA에 0.05%의 트립신을 추가하고 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 배양합니다.그런 다음 FBS를 포함하는 매체에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 혈혈계 또는 세포 카운터를 사용하여 총 세포 수와 원심분리기를 5분 동안 220배 G에서 양수화한다. 원심분리 하는 동안, 투과성 멤브레인 지지판을 포함하는 대식대식의 상부 및 하부 챔버에서 배지를 흡인하 고 신선한 매체로 대체 한다.종양 세포가 도금될 하부 챔버의 경우, 세포 첨가를 위한 충분한 부피를 남기기 위해 1.5 밀리리터 대신 배지 1밀리리터로 채우십시오. 원심분리가 완료되면, 펠릿 종양 세포로부터 배지를 흡인시키고 밀리리터당 300, 000세포의 농도로 보충DMEM에서 세포를 다시 중단한다. 원하는 우물의 하부 챔버에 이 세포 현탁액의 0.5 밀리리터를 추가합니다.대식세포 프로 염증 성 유전자 발현을 유도하기 위해 밀리리터 당 100 나노 그램의 농도에 인터페론 감마를 첨가하여 밀리리터 당 50 나노 그램의 농도로 심백성 또는 공동 배양 대식세포를 치료하십시오. 필요에 따라 문화에서 치료 시간의 기간을 변경합니다. 대식세포 활성화는 2시간 이내에 발생하며, 일부 종양 매개 억제는 8시간 이내에 발생합니다.24시간 동안의 공동 배양은 견고하고 일관된 종양 유래 억제를 낳습니다. 부정적인 제어로, 문화 대식세포는 노래하고 치료되지 않은 둡니다. 양수 조절으로, 시료에 사용되는 것과 동일한 농도에서 인터페론 감마 및 LPS로 노래배양 된 대식세포를 치료하십시오.원하는 잠복기 시간이 경과한 후, 테스트 요구에 따라 원하는 대로 세포 리세테 또는 조건 배양 배지를 분리한다. 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석을 위해 세포 용액을 분리하고, 우물의 양 챔버에서 배지를 흡인하고 PBS의 2밀리리터로 한 번 세척한다. 대식세포가 함유된 상부 챔버에 RNA 리시스 버퍼를 적용합니다.그 후, 세포를 용액을 방출하고 RNA 격리 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 추가 처리를 위해 수집 튜브로 전송하기 위해 멤브레인을 부드럽게 긁어낸다. 여기에서 기술된 공동 배양 방법은 물리적 접촉 없이 대식세포 및 종양 세포의 배양을 포함한다. 종양 세포의 부재에서 배양 된 회대식은 음수 및 양성 대조군으로 사용된다.B16F10 종양 세포의 존재에서 공동 배양되는 회대대세포는 자극을 활성화하지 않고 는 프로 염증 관련 유전자의 발현을 증가시키지 않는다. 이것은 종양 분비리 리간드가 스스로 프로 염증 성 유전자 발현을 유도하기에 충분하지 않거나 종양 분비에 의한 면역 활성화가있는 경우 파라크리네 리간드가 네이티브 수준으로 억제하기에 충분하다는 것을 의미합니다. 이러한 공동 배양 방법은 인터페론 감마 및 LPS에 의해 편광되는 대식세포가 종양 세포의 존재에서 배양될 때, 염증 관련 유전자 발현의 억제가 60%만큼 감소되었다는 것을 보여 주며, 뮤린 대식세포 세포주 J774가 코테톤 대식세포세포간을 대체할 때 유사한 수준의 대식세포증유전자 억제가 관찰된다.이전 연구는 단백질 S를 대식세포 활성화를 억제할 수 있는 종양 분비인자로 확인하였기 때문에 투과성 멤브레인 지원 공동 배양 모델은 lysA와 함께 24시간 후 조건부 배지에서 단백질 S의 농도를 분석하는 데 사용된다. 인터페론 감마 및 LPS 처리B16F10 흑색종 세포로부터 의 조건된 매체에서, 단백질 S는 밀리리터 당 대략 475 나노그램의 농도로 표현됩니다. 동일한 조건에서 치료된 회대대식은 밀리리터당 약 61 나노그램에서 단백질 S를 표현하였다.흥미롭게도, 공동 배양시, 인터페론 감마 및 LPS 처리 우물에서 단백질 S의 농도는 밀리리터 당 약 86 나노그램이었다. 이는 대식세포가 종양 분비 단백질 S를 섭취하거나 B16F10 세포에 의해 분비되는 단백질 S의 양이 대식세포의 존재시 실질적으로 감소한다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 대식세포가 종양 세포와 공동 배양될 때 대식세포 활성화 및 파라크리안 신호의 심오한 변화를 강조한다.Transwell 공동 문화 방법은 파라크리인 신호와 관련된 다양한 질문에 대답할 수 있습니다. 서양 얼룩 분석은 종양 분비 단백질이 대식세포에 있는 각종 신호 통로를 변경하는 방법을 결정하기 위하여 실행될 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

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그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

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폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

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The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

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Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

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세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상 조직 방사선 효과 연구

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고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

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Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...