Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Eric Ubil ble delvis finansiert av American Cancer Society postdoktor Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Verket ble støttet av et stipend fra NIH (R01-CA205398) og en bryst Cancer Research Foundation Award (BCRF-18-041) til HMS.

Alle prosedyrer knyttet til høsting og bruk av murine bukhulen makrofager ble gjennomført ved University of North Carolina i Chapel Hill (UNC) og ble godkjent av UNC institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).
1. macrophage kultur
Merk: denne prosedyren kan bruke primære bukhulen makrofager (beskrevet i detalj nedenfor), benmarg-avledet makrofager, eller macrophage cellelinjer som J774 (ATCC) eller RAW264 (ATCC).
<ol><li>Harvest bukhulen makrofager so...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors.">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li><li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages:+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth.">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li><li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

Co-kulturen analysen presenteres her er en modifikasjon av tidligere etablerte analyser som gjør det mulig for studiet av tumor-utskilt faktorer på immun celle aktivering. Mens celle-celle kontakt er kjent for å indusere endringer i immunforsvaret, er evnen til tumor-utskilles ligander til modulere immun aktivering mindre godt forstått. Vi beskriver en metode som, i motsetning til direkte co-kultur, kan brukes til å forhøre hvordan tumor-avledet utskilles faktorer innvirkning immun celle aktivering uten forvirrende...

Nyere studier har fokusert på evnen til kreftceller for å unngå deteksjon av immunceller, undertrykke lokale immun aktivering, eller å produsere en tolerogenic svulst-ettergivende miljø i tumor mikromiljøet. To brede klasser av tumor og immun celle interaksjoner har blitt beskrevet som letter disse effektene: kontakt-mediert interaksjoner eller tumor-utskilt ligander. En av de mest godt studert og klinisk medgjørlig mekanismer for kontakt-mediert uimottakelig hemming utnyttet av svulster er uttrykk for PD-L1, som samhandler med PD-1 på T celler for å hemme deres aktivisering og funksjon1,2. Som svar på interferon-gamma (IFNγ), som uttrykkes av en rekke aktiverte immunceller, tumorceller kan øke uttrykk for PD-L1 å indusere utmattelse av PD-1-uttrykker aktivert T-celler, og dermed hindre dem fra effektivt å utrydde tumorceller3. Bruken av antistoffer for å blokkere samspillet mellom PD-L1 og PD-1 er i dag brukes til å behandle flere krefttyper hos mennesker4. I lys av denne kliniske suksessen og andre, har identifisering og målretting av tumor-avledet immunsuppressiv mekanismer fått økende oppmerksomhet.
Utover undertrykkelse av adaptive immunitet, svulster er også kjent for å skille ut faktorer som undertrykker Pro-inflammatoriske reaksjoner av medfødte immunceller. Tumor-avledet eller tumor-indusert sekreter, inkludert Il-6, Il-10, VEGF, Il-23, og Colony stimulerende faktor (CSF-1), har vist å hemme antitumor reaksjoner av Natural Killer (NK) celler, granulocytter, og dendrittiske celler i svulsten mikromiljøet5,6,7. Tumorceller kan også skille ut faktorer som skew rekrutteringen og differensiering av myelogen-avledede celler i tumor mikromiljøet å fremme undertrykkelse av T celle aktivering8,9.
En type medfødt immun celle som har en dyp effekt på tumorprogresjon er macrophage. I mange år har tilstedeværelsen av tumor-assosiert makrofager (TAMs) blitt brukt som en negativ Prognostisk av pasienten overlevelse10. Konseptet som immunsuppressiv TAMs dempe immun celle-mediert clearance av svulster ble innført mer enn 40 år siden11. I den seneste tid, den har blitt vist det det macrophage Pro-opphissende svaret kan downregulated stund en Pro-svulst fenotype kan indusert inne det svulst mikromiljøet. Disse immunsuppressiv makrofager kan bidra til en tolerogenic respons, kjøring tumorprogresjon og motstand mot kjemoterapi-og immunterapi12. Gitt at makrofager er ofte en av de mest tallrike leukocytter med svulsten, representerer restaurering av deres tumor-spesifikke immun aktivitet et potensielt mål for anticancer legemiddel selskap13.
Mens kontakt-mediert interaksjoner mellom tumorceller og makrofager kan være modellert gjennom direkte coculture, kan bruk av gjennomtrengelig membran støtter belyse som tumor utskilles faktorer er immunmodulerende uten potensielt forvirrende påvirkning av tumor-immun celle-celle kontakt. Ved hjelp av noe lignende metoder, andre har vist potensialet for å identifisere utskilles faktorer i mikroglia/neuronal interaksjoner14 samt tumorceller med mesothelial celler15. Vi har også med hell brukt denne co-kultur teknikk for å karakterisere rollen som en tumor utskilles protein, Pros1, som en Suppressor av Pro-inflammatorisk genuttrykk etter stimulering av bukhulen makrofager med LPS og interferon-gamma16. Her beskriver vi en grei metodikk som kan brukes til å forhøre hvordan tumor-utskilt faktorer kan påvirke macrophage aktivering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

Tumor-avledet paracrine signalering er en oversett komponent i lokale immunsuppresjon og kan føre til en ettergivende miljø for fortsatt kreft vekst og metastasering. Paracrine signaler kan innebære celle-celle kontakt mellom ulike celletyper, for eksempel PD-L1 uttrykt på overflaten av svulster kommunisere direkte med PD-1 på overflaten av T-celler, eller utskillelsen av ligander av en svulst celle for å påvirke en immun celle. Her beskriver vi en co-kultur metode for å forhøre virkningene av tumor-utskilt ligander på immun celle (macrophage) aktivering. Denne enkle prosedyren benytter kommersielt tilgjengelige 0,4 μm polykarbonat-membran gjennomtrengelig støtter og standard vev kultur plater. I prosessen beskrevet, makrofager er kultivert i det øvre kammeret og tumorceller i nedre kammeret. Tilstedeværelsen av 0,4 μm barrieren åpner for studiet av intercellulære signalering uten forvirrende variabel av fysisk kontakt, fordi de to celletyper deler samme medium og eksponering for paracrine ligander. Denne tilnærmingen kan kombineres med andre, slik som genetiske endringer av macrophage (f. eks isolert fra genetiske Knock-Out mus) eller tumor (f. eks CRISPR-mediert endringer) for å studere rollen som spesifikke utskilles faktorer og reseptorer. Tilnærmingen gir også seg til standard molekylære biologiske analyser som kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (qRT-PCR) eller Western Blot analyse, uten behov for flyt sortering å skille de to celle populasjoner. Enzym-knyttet immunosorbentanalyse analyser (ELISAs) kan på samme måte utnyttes til å måle utskilles ligander å bedre forstå den dynamiske samspillet av celle signalering i flere celle type sammenheng. Varighet av co-kultur kan også varieres for studiet av timelig regulerte hendelser. Denne co-kulturen metoden er et robust verktøy som forenkler studiet av tumor-utskilles signaler i immun sammenheng.

For å bestemme effekten av tumor-utskilt ligander på macrophage polarisering, prosedyren beskrevet ble utnyttet. Bukhulen kultur Fager i fravær av tumorceller ble brukt som negative (ubehandlet = lengst til venstre) og positive (IFNγ og LPS stimulert = 2nd fra venstre) kontroller (figur 2a). Alternativt var bukhulen makrofager co-kultivert med B16F10 melanom tumorceller (ATCC) (figur 1a). Umiddelbart etter plating, celler ble enten behandlet med I...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Her presenterer vi en metode som bruker gjennomtrengelig membran støtter for å lette studiet av ikke-kontakt paracrine signalering brukt av tumorceller for å undertrykke immunrespons. Systemet er mottagelig for å studere rollen som tumor-utskilt faktorer i demping macrophage aktivering.

Studere effekter av tumor-utskilt paracrine ligander på macrophage aktivisering bruker co-kultur med gjennomtrengelig membran støtter

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Denne Transwell co-kultur metoden brukes til å studere paracrine signalering brukes av tumorceller for å undertrykke immunresponsen. Denne metoden kan brukes til å oppdage nye utskilles ligands, samt mekanistiske underlag av deres immun suppressive effekter. Vi har tidligere brukt denne metoden for å vise hvordan tumorutskillede faktorer kan dempe makrofag pro-inflammatorisk gentranskripsjon.Vi tror dette verktøyet har vidtrekkende implikasjoner i studiet av tumor-avledet immunundertrykkelse. En av de viktigste fordelene med denne teknikken er at den kan brukes til å studere paracrine signalering mellom tumorceller og immunceller uten potensielt forvirrende variabel av celle-til-celle kontakt. Denne plattformen er også mottagelig for en rekke molekylære biologiske teknikker for nedstrøms analyse.Etter høsting av peritoneale makrofager, plate dem direkte inn i de øvre kamrene i en 0,4 mikrometer polyester membran sette co-kultur seks-brønns plate. Deretter lagt supplerte DMEM til brønnen slik at det øverste kammeret inneholder en milliliter og det nederste kammeret inneholder 1,5 milliliter. Inkuber i tre dager ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.Først kultur kommersielt tilgjengelige tumorceller i deres respektive medium, etter ATCC anbefalte vev kultur metoder. Vask deretter de tiltalende tumorcellene en gang med PBS. Tilsett 0,05% trypsin i EDTA og inkuber ved 37 grader Celsius til cellene løsner.Deretter suspenderer cellene på igjen i medier som inneholder FBS. Bruk et hemocytometer eller celleteller til å kvantisere det totale antall celler og sentrifuge ved 220 ganger G i fem minutter for å pellet. Under sentrifugering, aspirere mediet fra de øvre og nedre kamrene i makrofagen som inneholder gjennomtrengelige membranstøtteplater og erstattes med friskt medium.For de nedre kamrene hvor tumorceller vil bli belagt, fyll med en milliliter medium i stedet for 1,5 milliliter for å forlate tilstrekkelig volum for celletillegg. Når sentrifugeringen er fullført, aspirerer mediet fra de pelleted tumorcellene og re-suspendere cellene i supplert DMEM i en konsentrasjon på 300 000 celler per milliliter. Tilsett 0,5 milliliter av denne cellesuspensjonen til det nedre kammeret i de ønskede brønnene.For å indusere makrofag pro-inflammatorisk genuttrykk, behandle enkeltvis eller co-kultiverte makrofager ved å legge interferon gamma i en konsentrasjon på 100 nanogram per milliliter og LPS i en konsentrasjon på 50 nanogram per milliliter. Varier varigheten av behandlingstider i kulturen etter behov. Makrofagaktivering skjer innen to timer, og noen tumormedierte undertrykkelse skjer med åtte timer.Co-kultur i 24 timer gir robust og konsekvent tumor-avledet undertrykkelse. Som en negativ kontroll, kultur makrofager enkeltvis og la ubehandlet. Som en positiv kontroll, behandle enkelt kultiverte makrofager med interferon gamma og LPS ved de samme konsentrasjonene som brukes til prøvene.Etter ønsket inkubasjonstid har gått, isolere cellelylat eller tilstand kultur medium som ønsket avhengig av testing behov. For å isolere cellelylat for kvantitativ polymerase kjedereaksjonsanalyse, aspirer mediet fra begge kamrene i brønnen og vask en gang med to milliliter PBS. Påfør RNA lysis buffer til det øverste kammeret som inneholder makrofagene.Etter dette skraper du forsiktig membranen for å frigjøre cellelylat og overføre den til et oppsamlingsrør for videre behandling i henhold til RNA-isolasjonssettprodusentens protokoll. Medkulturmetoden som er beskrevet her, innebærer kulturen av makrofager og tumorceller uten fysisk kontakt. Peritoneal makrofager dyrket i fravær av tumorceller brukes som negative og positive kontroller.Peritoneal makrofager co-kultivert i nærvær av B16F10 tumorceller, men uten å aktivere stimuli ikke øke uttrykk for pro-inflammatoriske assosierte gener. Dette innebærer at tumorutskilles ligander er enten ikke tilstrekkelig til å indusere pro-inflammatorisk genuttrykk av seg selv, eller hvis det er immunaktivering av tumorsekresjoner, paracrine ligander er tilstrekkelig til å undertrykke den til sine opprinnelige nivåer. Denne co-kultur metoden illustrerer at når makrofager polarisert av interferon gamma og LPS er dyrket i nærvær av tumorceller, undertrykkelse av betennelse-assosiert genuttrykk ble redusert med så mye som 60%Et sammenlignbart nivå av makrofag pro-inflammatorisk genundertrykkelse observeres når murine makrofag cellelinje J774 er erstattet for peritoneal makrofager.Tidligere arbeid har identifisert protein S som en tumor-utskilles faktor som kan hemme makrofag aktivering, slik at gjennomtrengelig membran støtte co-kultur modellen brukes sammen med en lysA å analysere konsentrasjonen av protein S i betinget media etter 24 timer. I betent media fra interferon gamma og LPS-behandlede B16F10 melanomceller, protein S uttrykkes i en konsentrasjon på ca 475 nanogram per milliliter. Peritoneal makrofager behandlet under de samme forholdene uttryktprotein S på ca 61 nanogram per milliliter.Interessant, når co-kultivert, konsentrasjonen av protein S i interferon gamma og LPS-behandlet godt var ca 86 nanogram per milliliter. Dette tyder på at enten makrofager inntar tumor-utskilles protein S eller at mengden protein S utskilles av B16F10 celler er betydelig redusert når i nærvær av makrofager. Disse resultatene fremhever dype endringer av makrofag aktivering og paracrine signalering når makrofager er co-kultivert med tumorceller.Transwell-kokulturmetoden kan svare på en rekke spørsmål knyttet til paracrinesignalering. Vestlig flekkanalyse kan utføres for å avgjøre hvordan tumorutskillede proteiner endrer ulike signalveier i makrofager.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktiske hensyn i å studere metastatisk lungekreft kolonisering i Osteosarcoma bruker lunge metastasering analysen

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Karakteristikk av cellemembranen utvidelser og studere deres roller i kreft celle vedheft Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging tilnærminger til vurderinger av toksikologiske oksidativt Stress bruker genetisk kodet Fluorogenic sensorer

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

To effekter av melanom Cell-derived faktorer på benmarg adipocytter differensiering

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal stamceller isolert fra cellulose vev og co kultur kreftceller å studere deres samhandling

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Måle beinremodellering og gjenskape tumor-bone mikromiljøet ved hjelp av Calvaria co-kultur og histomorfometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studere normal tissue stråling virkninger benytter ekstracellulære matrise Hydrogeler

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekter av Migrastatic hemmere på 3D tumor spheroid Invasion av høy oppløsning Konfokalmikroskopi mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Samkultur av Glioblastoma stamceller på mønstrede nevroner for å studere migrasjon og cellulære interaksjoner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...