Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Эрик Ubil был профинансирован, в частности, Американское онкологическое общество постдокторской стипендий (128770-PF-15-216-01-LIB). Работа была поддержана грантом от NIH (R01-CA205398) и наградой Фонда исследований рака молочной железы (BCRF-18-041) в ВШЭ.

Все процедуры, связанные с сбором и использованием макрофагов перитонеального перитонеала, были проведены в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл (КООН) и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных КООН (IACUC).
1. Культура макрофагов
<p cla...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors.">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li><li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages:+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth.">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li><li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

Анализ сокультуры, представленный здесь, представляет собой модификацию ранее установленных анализов, которая позволяет изучать опухолевые факторы активации иммунных клеток. В то время как контакт клеток, как известно, вызывают изменения в иммунной активности, способность опухолевы?...

Недавние исследования были сосредоточены на способности раковых клеток, чтобы избежать обнаружения иммунными клетками, подавить местную иммунную активацию, или производить толерантность опухоли вседозволенной среде в микроокружении опухоли. Были описаны два широких класса опухолевых и иммунных клеточных взаимодействий, которые облегчают эти эффекты: контактно-опосредованные взаимодействия или опухолевые лиганды. Одним из наиболее хорошо изученных и клинически tractable механизмов контактно-опосредованного иммунного ингибирования, используемых опухолями является выражение PD-L1, который взаимодействует с PD-1 на Т-клетки, чтобы ингибировать их активацию и функцию1,2. В ответ на интерферон-гамма (ИФНЗ), который выражается рядом активированных иммунных клеток, опухолевые клетки могут увеличить экспрессию PD-L1, чтобы вызвать истощение PD-1-выражения активированных Т-клеток, тем самым предотвращая их от эффективного искоренения опухолевых клеток3. Использование антител, чтобы блокировать взаимодействие между PD-L1 и PD-1 в настоящее время используется для лечения нескольких типов рака у людей4. В свете этого клинического успеха и других, выявление и таргетинг опухолевых иммуносупрессивных механизмов получил все большее внимание.
Помимо подавления адаптивного иммунитета, опухоли также известны выделять факторы, которые подавляют провоспалительные реакции врожденных иммунных клеток. Опухолевые или опухолевые выделения, в том числе IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, и колонии стимулирующий фактор (CSF-1), было показано, ингибировать противоопухолевые реакции естественных клеток убийцы (НК), гранулоцитов и дендритных клеток в микросреде опухоли5,6,7. Опухолевые клетки могут также выделять факторы, которые искажают набор и дифференциацию миелоидных клеток в микроокружении опухоли для содействия подавлению активации Т-клеток8,9.
Один из видов врожденных иммунных клеток, который имеет глубокое влияние на прогрессирование опухоли является макрофаг. На протяжении многих лет, наличие опухолевых макрофагов (TAMs) был использован в качестве отрицательного прогноза выживания пациента10. Концепция, что иммуносупрессивные TAMs ослабить иммунных клеток опосредованного очистки опухолей была введена более 40 лет назад11. Совсем недавно было показано, что макрофаг провоспалительных ответ может быть downregulated в то время как про-опухоли фенотип может быть индуцирован в микросреде опухоли. Эти иммуносупрессивные макрофаги могут способствовать толерантности, приводя к прогрессированию опухоли и устойчивости к химио- и иммунотерапии12. Учитывая, что макрофаги часто являются одним из наиболее распространенных лейкоцитов с опухолью, восстановление их опухоли специфической иммунной активности представляет собой потенциальную цель для противоопухолевых терапии13.
В то время как контактно-опосредованные взаимодействия между опухолевыми клетками и макрофагами могут быть смоделированы с помощью прямой кокультуры, использование проницаемых мембранных опор может выяснить, какие опухолевые факторы являются иммуномодулирующими без потенциально запутанного влияния опухолево-иммунного клеточного контакта. Используя несколько аналогичные методы, другие продемонстрировали потенциал выявления секретных факторов в микроглии / нейрональных взаимодействий14, а также опухолевые клетки с мезотелиальными клетками15. Мы также успешно использовали этот метод совместной культуры, чтобы охарактеризовать роль опухолевого белка, Pros1, как супрессор провоспалительного экспрессии генов после стимуляции перитонеальных макрофагов с LPS и интерферон-гамма16. Здесь мы описываем простую методологию, которая может быть использована для допроса, как опухолевые факторы могут повлиять на активацию макрофагов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

Сигнализация паракрина, полученная из опухолей, является упускаемым из виду компонентом местного иммуносупрессии и может привести к разрешительной среде для дальнейшего роста рака и метастазирования. Паракриновые сигналы могут включать контакт клеток между различными типами клеток, таких как PD-L1, выраженный на поверхности опухолей, взаимодействующих непосредственно с PD-1 на поверхности Т-клеток, или секреция лигандов опухолевой клеткой, чтобы возразить иммунную клетку. Здесь мы описываем метод совместной культуры для того чтобы допросить влияния тумор-секретированных ligands на активации иммунных клеток (макрофага). Эта простая процедура использует коммерчески доступные 0,4 мкм поликарбонатной мембраны проницаемые опоры и стандартные пластины культуры тканей. В описанном процессе макрофаги культивируются в верхней камере и опухолевых клетках в нижней палате. Наличие барьера 0,4 мкм позволяет изучать межклеточную сигнализацию без запутанной переменной физического контакта, поскольку эти два типа клеток имеют одинаковую среду и подвержены паракринным лиганам. Этот подход можно сочетать с другими, такими как генетические изменения макрофага (например, изоляция от генетических вырубки мышей) или опухоли (например, CRISPR-опосредованные изменения) для изучения роли конкретных секретных факторов и рецепторов. Этот подход также поддается стандартному молекулярному биологическому анализу, такому как количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) или западный анализ помарки, без необходимости сортировки потока для разделения двух популяций клеток. Фермент-связанные иммуносорбентные анализы (ELISAs) могут также быть использованы для измерения выделяется лиганды, чтобы лучше понять динамическое взаимодействие клеточной сигнализации в контексте нескольких типов клеток. Длительность совместной культуры также может быть различной для изучения временно регулируемых событий. Этот метод совместной культуры является надежным инструментом, который облегчает изучение опухолевых сигналов в иммунном контексте.

Для определения влияния опухолевых лигандов на поляризацию макрофагов была использована описанная процедура. Перитональные макрофаги, культивируемые при отсутствии опухолевых клеток, использовались в качестве отрицательных (необработанные и крайне левые) и положительные (IFN и LPS сти...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Здесь мы представляем метод с использованием проницаемых мембранных опор для облегчения изучения бесконтактной паракриной сигнализации, используемой опухолевыми клетками для подавления иммунного ответа. Система поддается изучению роли опухолевых факторов в увлажнении активации макрофагов.

Изучение влияния опухолевых паракринных лигандов на активацию макрофагов с помощью совместной культуры с проницаемой мембраной поддержкой

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Этот метод совместной культуры Transwell используется для изучения паракринной сигнализации, используемой опухолевыми клетками для подавления иммунного ответа. Этот метод может быть использован для обнаружения новых секретных лигандов, а также механистических основ их иммунного подавления эффектов. Ранее мы использовали этот метод, чтобы показать, как опухолевые факторы могут ослабить макрофаг провоспалительные транскрипции генов.Мы считаем, что этот инструмент имеет широкие последствия в изучении опухолевых иммунного подавления. Одним из основных преимуществ этого метода является то, что он может быть использован для изучения паракринной сигнализации между опухолевыми клетками и иммунными клетками без потенциально запутанной переменной контакта между клетками. Эта платформа также подменяется к различным молекулярно-биологическим методам для анализа ниже по течению.После сбора перитонеальных макрофагов, пластины их непосредственно в верхние камеры 0,4 микрометра полиэфирной мембраны вставить совместно культуры шесть хорошо пластины. Затем добавили дополненный DMEM к хорошо так, что верхняя камера содержит один миллилитр и нижняя камера содержит 1,5 миллилитров. Инкубировать в течение трех дней при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.Во-первых, культура коммерчески доступны опухолевых клеток в их соответствующей среде, после ATCC рекомендовал методы культуры тканей. Далее, мыть адепт опухолевых клеток один раз с PBS. Добавьте 0,05%трипсина в ЭДТА и инкубировать при 37 градусах по Цельсию, пока клетки не отсоединятся.Затем повторно приостанавливать ячейки в средствах массовой информации, содержащих FBS. Используйте гемоцитометр или клеточный счетчик для количественной оценки общего количества клеток и центрифуг в 220 раз G в течение пяти минут, чтобы гранулировать. Во время центрифугации аспирировать среду из верхней и нижней камер макрофага, содержащего проницаемые мембранные вспомогательные пластины, и заменить свежей средой.Для нижних камер, где опухолевые клетки будут поцаряться, заполните одним миллилитром среды вместо 1,5 миллилитров, чтобы оставить достаточный объем для добавления клеток. Когда центрифугация завершена, аспирировать среды из гранулированных опухолевых клеток и вновь приостановить клетки в дополненных DMEM в концентрации 300000 клеток на миллилитр. Добавьте 0,5 миллилитров этой клеточной подвески в нижнюю камеру нужных скважин.Чтобы вызвать макрофаг провоспалительные экспрессии генов, лечить потихоньку или совместно культурных макрофагов, добавив интерферон гамма в концентрации 100 нанограмм на миллилитр и LPS в концентрации 50 нанограмм на миллилитр. Варьировать продолжительность времени лечения в культуре по мере необходимости. Активация макрофагов происходит в течение двух часов, и некоторые опухоли опосредованное подавление происходит на восемь часов.Со-культура в течение 24 часов дает надежное и последовательное подавление опухоли. В качестве отрицательного контроля, культура макрофаги по-настоящему и оставить без лечения. В качестве положительного контроля, лечить отдельно-культурных макрофагов с интерферон гамма и LPS в тех же концентрациях, используемых для образцов.После желаемого инкубации время прошло, изолировать лизолировать клетки или состояние культуры среды по желанию в зависимости от потребностей тестирования. Чтобы изолировать лизат клетки для количественного анализа цепной реакции полимеразы, аспирировать среду из обеих камер хорошо и мыть один раз с двумя миллилитров PBS. Нанесите буфер РНК-лиза на верхнюю камеру, содержащую макрофаги.После этого аккуратно соскреблите мембрану, чтобы освободить лисат клетки и перенесите ее в трубку для дальнейшей обработки в соответствии с протоколом производителя изоляционных комплектов РНК. Описанный здесь метод совместной культуры включает в себя культуру макрофагов и опухолевых клеток без физического контакта. Перитонеальные макрофаги, культурные при отсутствии опухолевых клеток, используются в качестве отрицательного и положительного контроля.Перитонеальные макрофаги совместно культурируются в присутствии опухолевых клеток B16F10, но без активации стимулов не увеличивают экспрессию провоспалительных связанных генов. Это означает, что опухолевых лигандов либо недостаточно, чтобы вызвать провоспалительные экспрессии генов сами по себе, или если есть иммунная активация выделения опухоли, паракрин лиганды достаточно, чтобы подавить его до своего родного уровня. Этот метод совместной культуры иллюстрирует, что, когда макрофаги поляризованы интерферонной гаммой и LPS культурируются в присутствии опухолевых клеток, подавление воспаления связанных экспрессии генов было сокращено на столько, сколько 60%Сопоставимый уровень макрофага провоспалительные подавления генов наблюдается, когда мурин макрофаг клеточной линии J774 заменяется брюшной макрофаги.Предыдущая работа определила протеин S как тумор-секретный фактор который может ингибировать активацию макрофага, поэтому проницаемая модель поддержки мембраны co-культуры использована в сочетании с lysA для того чтобы assay концентрация протеина S в условных средствах после 24 часов. В условных средствах массовой информации из интерферон гамма и LPS-обработанных B16F10 клеток меланомы, белок S выражается в концентрации около 475 нанограмм на миллилитр. Перитонеальные макрофаги, обработанные в тех же условиях, выражали белок S примерно на 61 нанограмм на миллилитр.Интересно, что при совместной культуре концентрация белка S в гамма-интерфероне и хорошо обработанной LPS составила примерно 86 нанограмм на миллилитр. Это говорит о том, что либо макрофаги, высекаемые опухолью белка S, либо о том, что количество белка S, выделяется клетками B16F10, существенно снижается при наличии макрофагов. Эти результаты подчеркивают глубокие изменения активации макрофага и сигнализации паракрина, когда макрофаги совместно культуры с опухолевыми клетками.Метод совместной культуры Transwell может ответить на различные вопросы, относящиеся к сигнализации паракрина. Западный анализ помарки можно было бы провести, чтобы определить, как опухолевые белки изменяют различные сигнальные пути в макрофагах.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Практические соображения в изучении метастатического легких колонизации в остеосаркома, используя Assay легочных метастазов

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Характеристика расширений клеточной мембраны и изучения их роли в динамике адгезии клеток рака

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging подходы для оценки токсикологической оксидативного стресса, используя генетически закодированный Fluorogenic датчики

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Двойное воздействие на дифференциации адипоциты костного факторов клеток меланомы

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Мезенхимальных стволовых клеток изолированно от ткани пульпы и культуры совместно с раковых клеток, чтобы изучить их взаимодействия

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Измерение ремоделирования костей и воссоздания микроокружения опухоли и кости с использованием кокультуры Кальварии и гистоморфометрии

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Изучение нормальных эффектов радиации тканей с помощью внеклеточных гидрогелей матрицы

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Характеристика влияния миграстатических ингибиторов на 3D-вторжение опухолевых сфероидов с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Кокультура стволовых клеток глиобластомы на узорчатых нейронах для изучения миграции и клеточных взаимодействий

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...