Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Eric Ubil finansierades delvis av American Cancer Society postdoktor Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Arbetet stöddes av ett bidrag från NIH (R01-CA205398) och en Breast Cancer Research Foundation Award (BCRF-18-041) till HSE.

Alla förfaranden relaterade till skörd och användning av murin peritonealdialys makrofager genomfördes vid University of North Carolina at Chapel Hill (UNC) och godkändes av UNC institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC).
1. macrophage kultur
Anmärkning: denna procedur kan använda primära peritoneala makrofager (beskrivs i detalj nedan), benmärg-härledda makrofager, eller makrofage cellinjer såsom J774 (ATCC) eller RAW264 (ATCC).
<ol>...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors.">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li><li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages:+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth.">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li><li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

Den Co-Culture assay presenteras här är en modifiering av tidigare etablerade analyser som gör det möjligt för studiet av tumör-utsöndras faktorer på immuncellernas aktivering. Medan cell-cell kontakt är känt för att framkalla förändringar i immunförsvaret, förmågan hos tumör-utsöndras ligander att modulera immunförsvaret aktiveringen är mindre väl förstått. Vi beskriver en metod som, till skillnad från direkt samodling, kan användas för att förhöra hur tumör-härledda utsöndrande faktorer p...

Nyligen genomförda studier har fokuserat på förmågan hos cancerceller att undvika detektion av immunceller, undertrycka lokala immunförsvaret aktivering, eller att producera en tolerogena tumör-tillåtande miljö i tumören mikromiljö. Två breda klasser av tumör-och immun cells interaktioner har beskrivits som underlättar dessa effekter: kontaktmedierade interaktioner eller tumörutsöndras ligander. En av de mest välstuderade och kliniskt tractable mekanismerna för kontakt-medierad Immunhämning utnyttjas av tumörer är uttrycket av PD-L1, som interagerar med PD-1 på T-celler för att hämma deras aktivering och funktion1,2. Som svar på interferon-gamma (IFNγ), som uttrycks av ett antal aktiverade immunceller, tumörceller kan öka uttrycket av PD-L1 att inducera utmattning av PD-1 – uttrycker aktiverade T-celler, vilket hindrar dem från att effektivt utrota tumörceller3. Användning av antikroppar för att blockera interaktionen mellan PD-L1 och PD-1 används för närvarande för att behandla flera cancertyper hos människa4. Mot bakgrund av denna kliniska framgång och andra, identifiering och inriktning av tumör-derived immunsuppressiva mekanismer har fått ökad uppmärksamhet.
Bortom dämpning av adaptiv immunitet, tumörer är också kända för att utsöndra faktorer som undertrycka den pro-inflammatoriska reaktioner av medfödda immunceller. Tumör-derived eller tumör-inducerad sekret, inklusive Il-6, Il-10, VEGF, Il-23, och kolonin stimulerande faktor (CSF-1), har visat sig hämma antitumöreffekt svar av naturliga mördare (NK) celler, granulocyter, och dendritiska celler i tumören mikromiljö5,6,7. Tumörceller kan också utsöndra faktorer som skeva rekrytering och differentiering av myeloida-härledda celler i tumören mikromiljö att främja dämpning av T-cells aktivering8,9.
En typ av medfödda immunceller som har en djupgående effekt på tumörprogression är makrofagen. Under många år har närvaron av tumörassocierade makrofager (TAMs) använts som en negativ prognostisk av patientens överlevnad10. Konceptet att immunsuppressiva TAMs dämpa immun Cell-medierad clearance av tumörer infördes mer än 40 år sedan11. På senare tid har det visats att makrofage pro-inflammatorisk reaktion kan vara nedreglerad medan en Pro-tumör fenotyp kan induceras i tumören mikromiljö. Dessa immunsuppressiva makrofager kan bidra till en tolerogena svar, drivande tumör progression och resistens mot kemo-och immunterapi12. Med tanke på att makrofager är ofta en av de mest rikliga leukocyter med tumören, restaurering av deras tumör-specifika immun aktivitet representerar ett potentiellt mål för cancer Therapeutics13.
Medan kontakt-medierade interaktioner mellan tumörceller och makrofager kan modelleras genom direkt coculture, användning av permeabla membran stöd kan belysa vilka tumörutsöndrande faktorer är immunmodulerande utan potentiellt störande inverkan av tumör-immun cell-cell kontakt. Med något liknande metoder, andra har visat potentialen att identifiera utsöndras faktorer i mikroglia/neuronala interaktioner14 samt tumörceller med mesothelial celler15. Vi har också framgångsrikt använt denna Co-Culture teknik för att karakterisera rollen av en tumör-utsöndras protein, Pros1, som en suppressor av pro-inflammatorisk genuttryck efter stimulering av peritoneala makrofager med LP-skivor och interferon-gamma16. Här beskriver vi en enkel metod som kan användas för att förhöra hur tumör-utsöndras faktorer kan påverka makrofagaktivering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

Tumör-derived parakrin signalering är en förbisedd del av lokal immunsuppression och kan leda till en tillåtande miljö för fortsatt cancer tillväxt och metastaser. Paracrine signaler kan innebära cell-cell kontakt mellan olika celltyper, såsom PD-L1 uttrycks på ytan av tumörer interagerar direkt med PD-1 på ytan av T-celler, eller utsöndring av ligander av en tumör cell för att påverka en immun cell. Här beskriver vi en co-Culture metod för att förhöra effekterna av tumör-utsöndras ligander på immunceller (makrofage) aktivering. Detta enkla förfarande utnyttjar kommersiellt tillgängliga 0,4 μm polykarbonat membran permeabla stöd och standard vävnad kultur plattor. I den beskrivna processen är makrofager odlade i övre kammaren och tumörceller i nedre kammaren. Närvaron av 0,4 μm barriären möjliggör studiet av intercellulära signalering utan confounding variabeln av fysisk kontakt, eftersom de två celltyperna delar samma medium och exponering för parakrin ligands. Denna metod kan kombineras med andra, såsom genetiska förändringar av makrofagen (t. ex. isolering från genetiska knock-out möss) eller tumör (t. ex., CRISPR-medierade förändringar) för att studera rollen av specifika utsöndras faktorer och receptorer. Metoden lämpar sig också för standardiserade molekylära biologiska analyser som kvantitativ omvänd Transkription av polymeras kedjereaktion (QRT-PCR) eller Western blot-analys, utan behov av flödes sortering för att separera de två cell populationerna. Enzymlänkade immunosorbent analyser (ELISAs) kan på samma sätt utnyttjas för att mäta utsöndras ligander för att bättre förstå den dynamiska interaktionen av cellsignalering i multipel celltyp kontext. Varaktigheten av medkulturen kan också varieras för studien av temporally reglerade händelser. Denna Co-Culture metod är ett robust verktyg som underlättar studiet av tumör-utsöndras signaler i immun sammanhang.

För att bestämma effekten av tumör-utsöndras ligander på makrofagpolarisering, det förfarande som beskrivs utnyttjades. Peritoneala makrofager odlade i avsaknad av tumörceller användes som negativa (obehandlad = långt till vänster) och positiva (IFNγ och LPS stimuleras = 2nd från vänster) kontroller (figur 2A). Alternativt, peritonealdialys makrofager var Co-odlade med B16F10 melanomtumörceller (ATCC) (figur 1a). Omedelbart efter pläter...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Här presenterar vi en metod med permeabla membran stöd för att underlätta studiet av icke-kontakt parakrin signalering används av tumörceller för att undertrycka immunförsvaret. Systemet är mottaglig för att studera rollen av tumör-utsöndras faktorer i dämpande makrofagaktivering.

Studera effekterna av Tumörutsöndras Paracrine ligander på Makrofagaktivering med hjälp av co-kultur med permeabla membran stöder

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Denna Transwell co-kultur metod används för att studera paracrine signalering används av tumörceller för att undertrycka immunsvaret. Denna metod kan användas för att upptäcka nya utsöndring ligander, liksom mekanistiska underbyggnad av deras immun suppressiva effekter. Vi har tidigare använt denna metod för att visa hur tumör-utsöndring faktorer kan dämpa makrofag pro-inflammatoriska gen transkription.Vi tror att detta verktyg har omfattande konsekvenser i studien av tumör-derived immun suppression. En av de största fördelarna med denna teknik är att den kan användas för att studera paracrine signalering mellan tumörceller och immunceller utan potentiellt förvirrande variabel av cell-till-cell kontakt. Denna plattform är också mottaglig för en mängd olika molekylärbiologiska tekniker för nedströms analys.Efter skörd peritoneal makrofager, platta dem direkt i de övre kamrarna i en 0,4 mikrometer polyestermembran infoga kokultur sex-väl platta. Därefter tillsats kompletteras DMEM till brunnen så att den övre kammaren innehåller en milliliter och den nedre kammaren innehåller 1,5 milliliter. Inkubera i tre dagar vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid.Först, kultur kommersiellt tillgängliga tumörceller i deras respektive medium, efter ATCC rekommenderade vävnadskultur metoder. Därefter tvätta de vidhäftande tumörcellerna en gång med PBS. Tillsätt 0,05%trypsin i EDTA och inkubera i 37 grader Celsius tills cellerna lossnar.Sedan åter upphäva cellerna i media som innehåller FBS. Använd en hemocytometer eller cellräknare för att kvantifiera det totala antalet celler och centrifug vid 220 gånger G under fem minuter till pellet. Under centrifugeringen aspirera mediet från de övre och nedre kamrarna i makrofag som innehåller permeabla membranstödplattor och ersätter med färskt medium.För de nedre kamrarna där tumörceller kommer att pläterad, fyll med en milliliter medium i stället för 1,5 milliliter att lämna tillräcklig volym för cell tillägg. När centrifugeringen är klar aspirera du mediet från de pelleterade tumörcellerna och åter suspendera cellerna i kompletterad DMEM vid en koncentration av 300, 000 celler per milliliter. Lägg till 0,5 milliliter av denna cellupphängning till den nedre kammaren av de önskade brunnarna.För att inducera makrofag proinflammatoriska genuttryck, behandla singly eller co-odlade makrofager genom att lägga till interferon gamma vid en koncentration av 100 nanogram per milliliter och LPS vid en koncentration av 50 nanogram per milliliter. Variera behandlingstiderna i kulturen efter behov. Makrofagaktivering sker inom två timmar, och vissa tumörmedierade dämpning sker med åtta timmar.Samkultur i 24 timmar ger robust och konsekvent tumör-härledda förtryck. Som en negativ kontroll, kultur makrofager singly och lämna obehandlade. Som en positiv kontroll, behandla singly-odlade makrofager med interferon gamma och LPS vid samma koncentrationer som används för proverna.Efter att önskad inkubationstid har förflutit, isolera cellen lysate eller tillstånd odlingsmedium som önskas beroende på testbehov. För att isolera cellen lysate för kvantitativ polymeras kedjereaktion analys, aspirera mediet från båda kamrarna i brunnen och tvätta en gång med två milliliter PBS. Applicera RNA-lysbuffert på den översta kammaren som innehåller makrofagerna.Efter detta skrapar försiktigt membranet för att frigöra cellen lysate och överföra den till en insamlingsrör för vidare bearbetning enligt RNA isolering kit tillverkarens protokoll. Den samkultur metod som beskrivs här innebär kultur av makrofager och tumörceller utan fysisk kontakt. Peritoneal makrofager odlade i avsaknad av tumörceller används som negativa och positiva kontroller.Peritoneal makrofager co-odlade i närvaro av B16F10 tumörceller men utan att aktivera stimuli inte öka uttryck för pro-inflammatoriska associerade gener. Detta innebär att tumör-utsöndlade ligander är antingen inte tillräckliga för att inducera pro-inflammatoriska genuttryck av sig själva, eller om det finns immun aktivering av tumör sekret, paracrine ligander är tillräckliga för att undertrycka den till dess infödda nivåer. Denna samkultur metod illustrerar att när makrofager polariserade av interferon gamma och LPS är odlade i närvaro av tumörceller, var undertryckande av inflammation-associerade genuttryck minskas med så mycket som 60%En jämförbar nivå av makrofag pro-inflammatoriska gensupprning observeras när murin makrofag cell linje J774 ersätts för peritoneal makrofager.Tidigare arbete har identifierat protein S som en tumör-utsöndring faktor som kan hämma makrofag aktivering, så den genomsläppliga membran stöd samkultur modell används tillsammans med en lysA att analysera koncentrationen av protein S i konditionerade medier efter 24 timmar. Hos konditionerade medier från interferon gamma och LPS-behandlade B16F10 melanomceller uttrycks protein S i en koncentration på cirka 475 nanogram per milliliter. Peritoneala makrofager som behandlats i samma tillstånd uttryckte protein S vid ungefär 61 nanogram per milliliter.Intressant, när co-odlade, koncentrationen av protein S i interferon gamma och LPS-behandlade väl var cirka 86 nanogram per milliliter. Detta tyder på att antingen makrofager intag av tumör-utsöndring protein S eller att mängden protein S utsöndras av B16F10 celler är väsentligt minskat när i närvaro av makrofager. Dessa resultat belysa djupgående förändringar av makrofag aktivering och paracrin signalering när makrofager är co-odlade med tumör celler.Transwells co-culture-metod kan svara på en mängd olika frågor som rör paracrinsignalering. Western blot analys skulle kunna genomföras för att avgöra hur tumör-utsöndring proteiner ändra olika signalering vägar i makrofager.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktiska överväganden studera metastaserande lungcancer kolonisationen i osteosarkom med pulmonell metastas-analys

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Karakterisering av cellmembranet tillägg och studera deras roller i Cancer Cell Adhesion Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging metoder för bedömningar av toxikologiska oxidativ Stress använder genetiskt-kodade Fluorogenic sensorer

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Dubbla effekter av melanom Cell-derived faktorer på benmärgen adipocyter differentiering

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymala stamceller isolering från massa vävnad och samtidig kultur med cancerceller för att studera deras interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Mätning av benremodeling och återskapa tumör-ben mikromiljö med Calvaria Co-kultur och Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studera normal vävnad strålningseffekter med hjälp av extracellulära matrix hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekterna av Migrastatiska hämmare på 3D-tumör spheroid invasion av högupplöst Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Samkultur av Glioblastoma stamliknande celler på mönstrade nervceller för att studera migration och cellulära interaktioner

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...