Name: studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Eric Ubil, kısmen, Amerikan Kanser Derneği Doktora Sonrası Bursu (128770-PF-15-216-01-LIB) tarafından finanse edildi. Çalışma NIH (R01-CA205398) ve Meme Kanseri Araştırma Vakfı ödülü (BCRF-18-041) hse bir hibe tarafından desteklendi.

Murin periton makrofajlarının hasat ve kullanımı ile ilgili tüm prosedürler Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi'nde (UNC) yürütülmüş ve UNC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Makrofaj kültürü
NOT: Bu yordam, birincil periton makrofajları (aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır), kemik iliği kaynaklı makrofajlar veya J774 (ATCC) veya RAW264 (ATCC) gibi makrofaj hücre hatlarını k...

<ol>
	<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation.">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li><li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes.">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li><li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis:+a+potential+mechanism+of+immune+evasion.">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li><li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+(PD-L1)+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response.">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).</li><li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment.">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li><li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site.">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells.">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li><li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism.">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li><li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients:+a+mechanism+of+tumor+evasion.">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li><li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors.">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li><li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages:+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth.">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li><li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+macrophages:+from+mechanisms+to+therapy.">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).</li><li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells.">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).</li><li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response.">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).</li><li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+(Taxol)+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines.">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li></ol>

Burada sunulan co-kültür tahlil bağışıklık hücresi aktivasyonu üzerinde tümör salgılanan faktörlerin incelenmesi için izin veren daha önce kurulmuş tahliller bir değişikliktir. Hücre-hücre temasının immün aktivitede değişikliklere yol açtığı bilinmekle birlikte, tümörse salgılanan ligandların bağışıklık aktivasyonunu modüle etme yeteneği daha az anlaşılmaktadır. Doğrudan ortak kültürün aksine, tümörkaynaklı salgılanan sekans faktörlerinin temas aracılı sinyalin kafa k...

Son çalışmalar, kanser hücrelerinin bağışıklık hücreleri tarafından tespit önlemek için yeteneği üzerinde duruldu, lokal immün aktivasyonu bastırmak, ya da tümör mikroortamda bir tolerojenik tümör-buna kalım ortamı üretmek için. Bu etkileri kolaylaştıran iki geniş tümör ve bağışıklık hücresi etkileşimi sınıfı tanımlanmıştır: temas aracılı etkileşimler veya tümör salgılanan ligandlar. Tümörler tarafından kullanılan temas aracılı immün inhibisyonun en iyi çalışılmış ve klinik olarak çekilebilir mekanizmalarından biri PD-L1 ifadesidir, hangi PD-1 ile T hücreleri onların aktivasyon vefonksiyoninhibe etkileşime 1,2. Aktif bağışıklık hücrelerinin bir dizi tarafından ifade edilen interferon-gama (IFNγ), yanıt olarak, tümör hücreleri PD-1-ifade aktive T hücrelerinin yorgunluğunu neden pd-L1 ekspresyonu artırabilir, bu nedenle etkili tümör hücrelerinin ortadan kaldırılmasını engelleyerek3. PD-L1 ve PD-1 arasındaki etkileşimi engellemek için antikorların kullanımı şu anda insanlarda birden fazla kanser türlerini tedavi etmek için kullanılır4. Bu klinik başarı ve diğerleri ışığında, tümör kaynaklı immünsupresif mekanizmaların tanımlanması ve hedefalınması giderek artan bir ilgi almıştır.
Adaptif bağışıklık baskılanması ötesinde, tümörler de doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin pro-inflamatuar yanıtları bastırmak faktörlerse salgılamak bilinmektedir. Tümör kaynaklı veya tümör kaynaklı salgılar, IL-6 dahil, IL-10, VEGF, IL-23, ve koloni uyarıcı faktör (BOS-1), doğal katil antitümör yanıtlarını inhibe gösterilmiştir (NK) hücreleri, granülositler, ve tümör mikroortamında dendritik hücreler5,6,7. Tümör hücreleri de t hücre aktivasyonu bastırılması teşvik etmek için tümör mikroortamında işe alım ve miyeloid türetilmiş hücrelerin farklılaşması çarpık faktörler salgılayabilir8,9.
Tümör progresyonu üzerinde derin bir etkiye sahip doğuştan gelen bağışıklık hücresi bir türü makrofaj olduğunu. Uzun yıllar boyunca, tümör ilişkili makrofajlar varlığı (TAMs) hasta sağkalım negatif prognostik olarak kullanılmıştır10. İmmünsupresif TAM'ların immün hücre aracılı tümörlerin temizlenmesini azalttağı kavramı 40 yıldan daha uzun bir süre önce11. Daha yakın zamanda, makrofaj pro-inflamatuar yanıtın alt regüle edilebildiği, tümör mikroortamında pro-tümör fenotipinin indüklenebileceği gösterilmiştir. Bu immünsupresif makrofajlar tolerojenik bir yanıta katkıda bulunabilir, tümör ilerlemesi ve kemoterapi direnci sürüş- ve immünoterapi12. Makrofajlar genellikle tümör ile en bol lökositler biri olduğu göz önüne alındığında, onların tümöre özgü bağışıklık aktivitesinin restorasyonu antikanser terapötikler için potansiyel bir hedef temsil13.
Tümör hücreleri ve makrofajlar arasındaki temas aracılı etkileşimler doğrudan kokültür yoluyla modellenebilir iken, geçirgen membran desteklerkullanımı tümör-immün hücre hücre teması potansiyel şaşırtıcı etkisi olmadan hangi tümör salgılanan faktörlerin immünomodülatör olduğunu açıklayabilir. Biraz benzer yöntemler kullanarak, diğerleri mikroglia / nöronal etkileşimleri salgılanan faktörlerin belirlenmesi potansiyelini göstermiştir14 yanı sıra mezotelyal hücreleri ile tümör hücreleri15. Ayrıca bu ortak kültür tekniğini, LPS ve interferon-gamma16ile periton makrofajlarının uyarılmasından sonra pro-inflamatuar gen ekspresyonunun bastırıcısı olarak tümör salgılanan bir protein olan Pros1'in rolünü karakterize etmek için başarıyla kullandık. Burada tümör salgılanan faktörlerin makrofaj aktivasyonunu nasıl etkileyebileceğini sorgulamak için kullanılabilecek basit bir metodolojiyi açıklıyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">B16-F10</td>
			<td style="width:244px;">ATCC</td>
			<td style="width:344px;">ATCC CRL-6475</td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMS-013-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">J774A.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5293-2ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murine M-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pros1 ELISA</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS2886720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse IFN&#947;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>575302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensimix SYBR Low-ROX kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>QT625-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell permeable supports</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the effects of tumor-secreted paracrine ligands on macrophage activation using co-culture with permeable membrane supports

Tümör kaynaklı parakrin sinyalizasyon lokal immünsupresyonun gözden kaçan bir bileşenidir ve sürekli kanser büyümesi ve metastaz için izin verilen bir ortama yol açabilir. Parakrin sinyalleri farklı hücre tipleri arasında hücre-hücre teması içerebilir, PD-L1 gibi tümörlerin yüzeyinde doğrudan T hücrelerinin yüzeyinde PD-1 ile etkileşim, ya da bir tümör hücresi tarafından ligands salgılanması bir bağışıklık hücresi etkilemek için ifade. Burada tümör salgılanan ligandların bağışıklık hücresi (makrofaj) aktivasyonu üzerindeki etkilerini sorgulamak için bir ortak kültür yöntemi ni tanımlıyoruz. Bu basit prosedür, ticari olarak mevcut 0,4 μm polikarbonat membran geçirgen destekler ve standart doku kültür plakaları kullanır. Açıklanan süreçte makrofajlar üst haznede, tümör hücrelerinde ise alt odada kültürlenir. 0.4 μm bariyerinin varlığı, iki hücre tipi aynı ortamı ve parakrin ligandlara maruz kalma açısından şaşırtıcı değişkeni olmadan hücreler arası sinyalleme nin incelenmesine olanak sağlar. Bu yaklaşım, makrofajın genetik değişiklikleri (örn. genetik nakavt farelerden izolasyon) veya tümör (örneğin, CRISPR aracılı değişiklikler) gibi diğer kişilerle birleştirilip belirli salgılanan faktörlerin ve reseptörlerin rolünü inceleyebilir. Bu yaklaşım aynı zamanda iki hücre popülasyonlarını ayırmak için akış ayarı gerek kalmadan, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) veya Batı leke analizi gibi standart moleküler biyolojik analizlere de katkıda bulunur. Enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA) benzer şekilde çoklu hücre tipi bağlamda hücre sinyalinin dinamik etkileşimini daha iyi anlamak için salgılanan ligandları ölçmek için kullanılabilir. Eş-kültür süresi de zamansal düzenlenmiş olayların çalışma için çeşitli olabilir. Bu co-kültür yöntemi bağışıklık bağlamında tümör salgılanan sinyallerin çalışmasını kolaylaştıran sağlam bir araçtır.

Tümör salgılanan ligandların makrofaj polarizasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için açıklanan prosedür kullanılmıştır. Tümör hücrelerinin yokluğunda kültürlenmiş peritoneal makrofajlar negatif (tedavi edilmemiş = çok sol) ve pozitif (IFNγ ve LPS uyarılmış = 2soldan) kontrolleri olarak kullanılmıştır (Şekil 2A). Alternatif olarak, periton makrofajları B16F10 melanom tümör hücreleri (ATCC) ile birlikte kültürlendi (Şekil...

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports at JoVE.com

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Burada, bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan temassız parakrin sinyalçalışmasını kolaylaştırmak için geçirgen membran destekleri kullanan bir yöntem salıyoruz. Sistem makrofaj aktivasyonu sönümleme tümör salgılanan faktörlerin rolünü incelemek için münasip olduğunu.

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Bu Transwell co-kültür yöntemi bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan parakrin sinyal çalışması için kullanılır. Bu yöntem yeni salgılanan ligands keşfetmek için kullanılabilir, yanı sıra bağışıklık baskılayıcı etkileri mekanistik temelleri. Daha önce tümör salgılanan faktörlerin makrofaj pro-inflamatuar gen transkripsiyonuna nasıl engel olabileceğini göstermek için bu yöntemi kullandık.Bu aletin tümör kaynaklı immün baskılama çalışmalarında geniş kapsamlı etkileri olduğuna inanıyoruz. Bu tekniğin en önemli avantajlarından biri, hücre-hücre temasının potansiyel olarak kafa karıştırıcı değişkeni olmadan tümör hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki parakrin sinyalizasyon çalışmaları için kullanılabilmedir. Bu platform aynı zamanda downstream analizi için moleküler biyolojik teknikler çeşitli münasip olduğunu.Periton makrofajları hasat ettikten sonra, doğrudan 0,4 mikrometre polyester membran eklemek co-kültür altı-iyi plaka üst odaları içine plaka. Daha sonra üst oda bir mililitre ve alt oda 1.5 mililitre içeren kuyuya eklenmiş DMEM eklendi. %5 karbondioksitle 37 derecede üç gün kuluçkaya yat.İlk olarak, atcc aşağıdaki kendi ortamda kültür ticari olarak kullanılabilir doku kültürü yöntemleri önerilir. Daha sonra, yapışık tümör hücrelerini pbs ile bir kez yıkayın. EDTA'da %0.05 tripsin ekleyin ve hücreler ayrışana kadar 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Ardından, FBS içeren ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın. Pelet için beş dakika için 220 kez G hücre ve santrifüj toplam sayısını quantitate için bir hemositometre veya hücre sayacı kullanın. Santrifüj sırasında, geçirilmez membran destek plakaları içeren makrofajın üst ve alt odalarından ortayı aspire edin ve taze ortamla değiştirin.Tümör hücrelerinin kaplandığı alt bölmeler için, hücre ilavesi için yeterli hacim bırakmak için 1,5 mililitre yerine bir mililitre orta ile doldurun. Santrifüj tamamlandığında, peletli tümör hücrelerinden orta aspire ve mililitre başına 300, 000 hücre konsantrasyonu ile eklenmiş DMEM hücreleri yeniden askıya. İstenilen kuyuların alt odasına bu hücre süspansiyon0,5 mililitre ekleyin.Makrofaj pro-inflamatuar gen ekspresyonunu indüklemek için, mililitrede 100 nanogram ve mililitrede 50 nanogram konsantrasyonda LPS konsantrasyonuna interferon gama ekleyerek tek başına veya eş kültürlü makrofajları tedavi edin. Kültürde tedavi sürelerini gerektiği gibi değiştirin. Makrofaj aktivasyonu iki saat içinde gerçekleşir ve bazı tümör aracılı bastırma sekiz saat oluşur.24 saat boyunca ortak kültür sağlam ve tutarlı tümör kaynaklı baskılama sağlar. Olumsuz bir kontrol olarak, kültür makrofajlar tek son ve tedavi edilmezse bırakın. Pozitif kontrol olarak, tek kültürlü makrofajları interferon gama ve LPS ile numuneler için kullanılan aynı konsantrasyonlarda tedavi edin.İstenilen kuluçka süresi geçtikten sonra, test ihtiyaçlarına bağlı olarak hücre lisate veya durum kültürü ortamını istenildiği gibi izole edin. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyon analizi için hücre lisatını izole etmek için, kuyunun her iki odasından ortayı aspire edin ve iki mililitre PBS ile bir kez yıkayın. RNA lysis tamponu makrofajları içeren üst hazneye uygulayın.Bundan sonra, hücre lisatını serbest bırakmak için membranı hafifçe kazıyın ve RNA izolasyon kiti üreticisinin protokolüne göre daha fazla işleme için bir toplama tüpüne aktarın. Burada açıklanan ortak kültür yöntemi makrofajlar ve tümör hücrelerinin fiziksel temas olmadan kültürünü içerir. Tümör hücrelerinin yokluğunda kültürlenmiş peritoneal makrofajlar negatif ve pozitif kontroller olarak kullanılır.Peritoneal makrofajlar B16F10 tümör hücrelerinin varlığında eş kültürlü ancak uyarıcı aktive olmadan pro-inflamatuar ilişkili genlerin ekspresyonunu artırmaz. Bu tümör salgılanan ligands ya kendileri tarafından pro-inflamatuar gen ekspresyonu neden yeterli olmadığını ima, ya da tümör salgıları ile bağışıklık aktivasyonu varsa, parakrin ligands doğal seviyelerine bastırmak için yeterli dir. Bu eş-kültür yöntemi, interferon gama ve LPS ile polarize makrofajlar tümör hücrelerinin varlığında kültürlendiğinde, inflamasyona bağlı gen ekspresyonunun baskılanmasının %60'a kadar azaldığı, rurine makrofaj hücre hattı J774 peritonmakrofajlarının yerine geçildiğinde makrofaj pro-inflamatuar gen baskılanmasının karşılaştırılabilir düzeyde gözlendiğini göstermektedir.Önceki çalışmada makrofaj aktivasyonunu inhibe edebilir bir tümör salgılanan faktör olarak protein S tespit etmiştir, bu nedenle geçirgen membran destek co-kültür modeli 24 saat sonra şartlı ortamda protein S konsantrasyonu teşif etmek için bir lysA ile birlikte kullanılır. İnterferon gama ve LPS ile tedavi edilen B16F10 melanom hücrelerinden klimalı ortamda, Protein S mililitre başına yaklaşık 475 nanogram konsantrasyonu ile ifade edilir. Aynı koşullarda tedavi edilen peritoneal makrofajlar mililitrede yaklaşık 61 nanogram protein S'yi ifade etti.İlginçtir, co-kültür, interferon gama protein S konsantrasyonu ve LPS tedavi iyi mililitre başına yaklaşık 86 nanogram oldu. Bu da ya makrofajların tümörse salgılanan protein S'i yuttuğunda ya da Makrofajlar varlığında B16F10 hücreleri tarafından salgılanan Protein S miktarının önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Bu sonuçlar, makrofajlar tümör hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde makrofaj aktivasyonu ve parakrin sinyalizasyon derin değişiklikler vurgulamak.Transwell ortak kültür yöntemi parakrin sinyalizasyon ile ilgili çeşitli soruları yanıtlayabilir. Tümör salgılanan proteinlerin makrofajlarda çeşitli sinyal yollarını nasıl değiştirdiğini belirlemek için Batı leke analizi yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Melanoma hücre kaynaklı faktörler çift etkileri kemik iliği adiposit farklılaşması üzerine

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mezenkimal kök hücre izolasyon hamuru doku ve kanser hücreleri ile ortak kültür ilişkileri incelemek için

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Ekstrasellüler matris Hidrogeller kullanarak normal doku radyasyon etkileri eğitim

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Migrastatik İnhibitörlerin 3Boyutlu Tümör Spheroid İnvazyonu Üzerine Etkilerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi Ile Karakterizasyonu

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...