Name: real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis
Uploaded: 2019-12-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis at JoVE.com

Vi takker Yumiko Iwamoto for at støtte produktionen af videoen. Vi er også taknemmelig for at Akihiro Isomura til diskussion og støtter af billedanalyse, Hitoshi Miyachi for teknisk støtte til generering af transgene dyr, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Af Olympus Medical Science) og Ouin Kunitaki (Andor Japan) til teknisk støtte og diskussioner i bioluminescens billedbehandlingssystem. Dette arbejde blev støttet af kerneforskning inden for evolutions videnskab og teknologi (JPMJCR12W2) (R.K.), tilskud til videnskabelig forskning i innovative områder (MEXT 24116705 for H.S. og MEXT 16H06480 for R.K.), støtte til videnskabelig forskning (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. og H.S.), og platform for dynamiske tilgange til levende system fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi, Japan.

Hele proceduren, herunder dyremotiver, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse på instituttet for grænse livet og lægevidenskaben, Kyoto Universitet.
1. bioluminescens journalister
Bemærk: der reporter er egnet til at måle den hurtige dynamik i promotoren aktivitet ved at fusing nedbrydnings signalet. Desuden gør der fusion reporter det muligt at overvåge protein dynamikken i den enkelte celle. Begge typer af journalister er t...

<ol>
	<li>Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+factors+in+cortical+development.">Basic helix-loop-helix factors in cortical development.</a> Neuron. 39, 13-25 (2003).</li><li>Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+intermediate+progenitor+cells+in+cerebral+cortex+development.">Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development.</a> Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li><li>Paridaen, J. T., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+during+development+of+the+vertebrate+central+nervous+system.">Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system.</a> EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).</li><li>Taverna, E., G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+vertebrate+neural+development.">Notch signaling in vertebrate neural development.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).</li><li>Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+in+the+Vertebrate+Nervous+System:+An+Old+Dog+with+New+Tricks.">Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks.</a> Neuron. 69, 840-855 (2011).</li><li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling:+a+simple+pathway+becomes+complex.">Notch signalling: a simple pathway becomes complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).</li><li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+in+context.">Notch signalling in context.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Canonical+Notch+Signaling+Pathway:+Unfolding+the+Activation+Mechanism.">The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism.</a> Cell. 137, 216-233 (2009).</li><li>Ishibashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+helix-loop-helix+factor+HES-1+prevents+mammalian+neural+differentiation+in+the+central+nervous+system.">Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system.</a> The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).</li><li>Ohtsuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hes1+and+Hes5+as+notch+effectors+in+mammalian+neuronal+differentiation.">Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation.</a> The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).</li><li>Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Basic+Helix-Loop-Helix+Genes+Hes1+and+Hes5+in+Expansion+of+Neural+Stem+Cells+of+the+Developing+Brain.">Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).</li><li>Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hes+gene+family:+repressors+and+oscillators+that+orchestrate+embryogenesis.">The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis.</a> Development. 134, 1243-1251 (2007).</li><li>Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+in+Notch+Signaling+Regulate+Maintenance+of+Neural+Progenitors.">Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors.</a> Neuron. 58, 52-64 (2008).</li><li>Imayoshi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors.">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li><li>Shimojo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis.">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes and Development. 30, 102-116 (2016).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+expression+of+the+bHLH+factor+Hes1+regulated+by+a+negative+feedback+loop.">Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.</a> Science. 298, 840-843 (2002).</li><li>Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Notch+signaling+in+neural+progenitor+cells+and+a+revised+view+of+lateral+inhibition.">Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition.</a> Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+pulsing+in+genetic+circuits.">Functional roles of pulsing in genetic circuits.</a> Science. 342, 1193-1200 (2013).</li><li>Purvis, J. E., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+decoding+cellular+information+through+signaling+dynamics.">Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics.</a> Cell. 152, 945-956 (2013).</li><li>Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+26S+proteasome+activity+and+inhibition+in+living+mice.">Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice.</a> Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).</li><li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Cellular+Clocks+in+the+Suprachiasmatic+Nucleus.">Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus.</a> Science. 302, 1408-1412 (2003).</li><li>Kiyohara, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMAL1+C+terminus+regulates+the+circadian+transcription+feedback+loop.">The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).</li><li>Behar, M., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+temporal+codes+of+intra-cellular+signals.">Understanding the temporal codes of intra-cellular signals.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Gene+Expression+in+a+Single+Cell.">Stochastic Gene Expression in a Single Cell.</a> Science. 297, 1183-1186 (2002).</li><li>Nelson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+in+NF-kappaB+signaling+control+the+dynamics+of+gene+expression.">Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression.</a> Science. 306, 704-708 (2004).</li><li>Purvis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+dynamics+control+cell+fate.">p53 dynamics control cell fate.</a> Science. 336, 1440-1444 (2012).</li><li>Hansen, A. S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+decoding+of+transcription+factor+dynamics+involves+a+trade-off+between+noise+and+control+of+gene+expression.">Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression.</a> Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).</li><li>Hansen, A. S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+Determinants+of+Promoter+Threshold+and+Activation+Timescale.">cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale.</a> Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).</li><li>Johnson, H. E., Toettcher, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Dynamics+Control+Cell+Fate+in+the+Early+Drosophila+Embryo.">Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+Progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: Progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Nakajima, Y., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+assays:+multicolor+luciferase+assay,+secreted+luciferase+assay+and+imaging+luciferase+assay.">Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).</li><li>Nakajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+beetle+luciferase+for+high-resolution+bioluminescence+imaging.">Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Stacer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+reporter+for+dual+luciferase+imaging+in+living+animals.">NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals.</a> Molecular Imaging. 12, (2013).</li></ol>

Komponenterne i notch signalering viser oscillatoriske udtryk i Synchrony under somitogenesen, men ud af Synchrony under neurogenese, hvilket fører til vanskelighederne med at opfange udtryks dynamikken ved statisk analyse i sidstnævnte tilfælde. Således, real-time overvågning er nødvendig for at afsløre udtrykket dynamik af notch signalering komponenter, såsom Hes1 og filen dll1. Fordi perioderne med udtrykkene Hes1 og filen dll1 svingninger er ekstremt korte, ca. 2-3 h, hurti...

Den pattedyr hjerne består af et stort antal forskellige typer af neuroner og gliale celler. Alle celler genereres fra neurale stamme/stamceller (NPCs), som først formere sig for at udvide deres tal, derefter begynde at differentiere sig til neuroner, og endelig give anledning til gliaceller celler1,2,3,4,5. Når cellerne har differentieret i neuroner, kan de ikke formere sig eller øge deres antal, og derfor er vedligeholdelsen af NPC'erne indtil senere stadier vigtig. Notch signalering via celle-celle interaktioner spiller en vigtig rolle i at opretholde NPCs6,7. Notch ligander interagere med membran protein, hak, på overfladen af tilstødende celler og aktiverer hakket protein. Efter aktivering opstår proteolyse af hakket protein, hvorved det intracellulære domæne af hak (NiCd) frigives fra cellemembranen ind i kernen8,9,10. I kernen binder NICD sig til arrangøren regioner Hes1 og Hes5 (Hes1/5) og aktiverer ekspression af disse gener. Hes1/5 Tryk igen på ekspression af de proneurale gener Ascl1 og Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Fordi proneurale gener inducerer neuronal differentiering, Hes1/5 spille væsentlige roller i at opretholde NPCs. Desuden, som proneurale gener kan aktivere ekspression af hak ligand Delta-like1 (filen dll1), Hes1/5 også undertrykke udtrykket af filen dll1. Derfor, udtrykket af filen dll1 fører til tilstødende celler er negativ for filen dll1 via notch signalering. På denne måde, celler hæmmer tilstødende celler fra at følge deres samme skæbne, et fænomen kendt som den laterale hæmning8. I den udviklende hjerne, lateral hæmning spiller en rolle i at generere forskellige forskellige celletyper.
Real-time Imaging på enkelt celleniveau afslører dynamiske udtryk af komponenterne i notch signalering i NPCs15,16,17. Notch signalering aktiverer ekspression af Hes1, men Hes1 protein binder sig til sin egen promotor og undertrykker sit eget udtryk. Desuden er Hes1 et ekstremt ustabilt protein, der nedbrydes af den ubiquitin-proteasome pathway; Derfor er undertrykkelsen af sin egen promotor kun kortvarig og derefter transskription starter igen. På denne måde, udtrykket af Hes1 svinger på både transskription og translationelle niveauer i en 2 h cyklus18. Den oscillatoriske udtryk for Hes1, til gengæld, inducerer den oscillatoriske udtryk for downstream Target gener, såsom Ascl1, Neurog2, og filen dll1, via periodisk undertrykkelse15,16,17,19. Mens proneurale gener kan inducere neuronal differentiering, deres oscillerende udtryk er ikke tilstrækkelig for neuronal differentiering; snarere deres vedvarende udtryk er afgørende for neuronal differentiering. Den oscillatoriske ekspression af proneurale gener er vigtig for at opretholde NPCs snarere end for inducerende neuronal differentiering14,15,16. Udtrykket af filen dll1 svinger ved både transkriptionen og translationelle niveauer under forskellige morfogenesis, såsom neurogenese og somitogenesis. Det dynamiske udtryk for filen dll1 er vigtigt for den normale morfogenesis og Steady Expression af filen dll1 inducerer defekter i neurogenese og somitogenesen17. Disse resultater viser den vigtige funktion, som dynamikken i genekspression og protein kinetik har på reguleringen af forskellige udviklingsmæssige hændelser (dvs. forskellige udtryks dynamikker producerer forskellige udgange i cellulær adfærd).
For at analysere dynamikken i notch signalering, den statiske analyse af væv og celler er utilstrækkelige, fordi de er i konstant forandring. Realtidsbilleder af enkeltceller er et effektivt værktøj til at afsløre dynamikken i genekspression. Det dynamiske udtryk for notch signalering molekyler gennemgår hurtige cykliske reaktioner i perioden 2-3 h. Denne hurtige periodiske udtryk præsenterer to vanskelige problemer for real-time overvågning: (1) udtrykket af molekyler er undertrykt til lave niveauer, og (2) hurtig omsætning kræver hurtig-respons journalister. For at overvinde disse problemer, har vi tidligere udviklet en bioluminescens real-time Imaging metode20. Fordi bioluminescens reporter har en højere følsomhed og kortere modningstid end fluorescerende journalister, denne strategi giver os mulighed for at overvåge den hurtige dynamik i levende celler. Ved hjælp af real-time visualisering, vi fandt, at flere gener udstillet dynamisk udtryk, end vi tidligere havde troet. Desuden er antallet af rapporter, der viser udtryk og protein dynamik i levende celler og betydningen af denne dynamik i forskellige biologiske begivenheder steget, hvilket tyder på en grundlæggende rolle i dynamikken i gene udtryk21,22.
I denne rapport beskriver vi en måde at visualisere udtrykket af den notch ligand filen dll1 i NPCs i både dissocierede kulturer og i kortikale skive kulturer. For at overvåge dynamikken i filen dll1 transskription på enkelt celle niveauer, genererede vi dissocierede kulturer af NPC'er afledt af embryonale telencephalon af Transgene mus transporterer pDll1-UB-fluc reporter, en filen dll1 promotor-drevet destabiliseret der reporter. For at overvåge filen dll1 protein dynamik in vivo introducerede vi filen dll1-Fluc fusion reporter i NPCs i cortex og visualiserede ekspression af journalisten i NPC'ere i kortikale skive kulturer. Real-time Imaging gjort det muligt for os at fange de forskellige funktioner i genekspression og protein dynamik i levende celler ved høj tidsmæssig opløsning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioluminescence Imaging System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled water circulator (chiller)</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>Model: F12-ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Model: iKon-M 934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>Model: INU-ONICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination device</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>Model: pE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td>Model: 40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix gas controller</td>
			<td>Tokken</td>
			<td>Model: TK-MIGM OLO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: UPLFLN 40X O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Model: SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for NPC dissociation culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock solution: 1 &#956;g/ml in 0.1% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01493-85</td>
			<td>Stock solution: 100mM in 0.9% saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003172</td>
			<td>Stock solution: 1000U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cystein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003178</td>
			<td>Stock solution: 7U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptmycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6281</td>
			<td>40 mg/ml in DW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for in utero electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>181228T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>7-mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>CUY21 EDIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauzes</td>
			<td>Kawamoto co.</td>
			<td>7161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro capillary</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentbarbital</td>
			<td>Kyoritsuseiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needle</td>
			<td>Akiyama MEDICAL MFG. CO</td>
			<td>F17-40B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Seractal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Slice culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro surgical knife</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>19 Gauge V-Lance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5MUV-PJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2/B27 media</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>ref. NPC dissociatioin culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber cutting board</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis

Notch signalering regulerer vedligeholdelsen af neurale stamme-/progenitorceller ved celle celle interaktioner. Komponenterne i notch signalering udviser dynamisk udtryk. Notch signalering Effector Hes1 og indhak ligand Delta-like1 (filen dll1) udtrykkes i en oscillerende måde i neurale stamceller/progenitorcellerne. Da perioden med det oscillatoriske udtryk for disse gener er meget kort (2 timer), er det vanskeligt at overvåge deres cykliske udtryk. For at undersøge sådanne hurtige ændringer i genekspression eller protein dynamik, er hurtige respons reportere påkrævet. På grund af sin hurtige modning kinetik og høj følsomhed, den bioluminescens reporter der er egnet til at overvåge hurtige genekspression ændringer i levende celler. Vi brugte en destabiliseret der Reporter til overvågning af arrangøren aktivitet og en der-smeltet reporter for visualisering af protein dynamik ved enkelt celle opløsning. Disse bioluminescens reportere viser hurtig omsætning og genererer meget svage signaler; Derfor har vi udviklet en meget følsom bioluminescens Imaging system til at detektere sådanne svage signaler. Disse metoder giver os mulighed for at overvåge forskellige genekspressions dynamik i levende celler og væv, som er vigtige oplysninger til at hjælpe med at forstå de faktiske cellulære stater.

Udtryk af gener Hes1/7 udviser 2 h svingningscyklus i forskellige cellelinjer og under somitogenesen. Desuden er perioden med svingning meget kort, og både deres mRNAs og proteiner er ekstremt ustabile med halveringstiden på omkring 20 min. Hvis du bruger en langsom respons reporter, kan vi ikke spore sådan hurtig dynamik, og hvis du bruger en stabil reporter, det gradvist ophobes, mens genekspression svinger. Således skal journalisten hurtigt nedbrydes for at overvåge den hurtige omsætning af sådanne cyk...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis at JoVE.com

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Neurale Stem/stamceller udviser forskellige udtryks dynamik af notch signalerings komponenter, der fører til forskellige udfald af cellulære hændelser. Et sådant dynamisk udtryk kan afsløres ved realtidsovervågning, ikke ved statisk analyse, ved hjælp af et meget følsomt bioluminescens billedbehandlingssystem, der muliggør visualisering af hurtige ændringer i genudtryk.

Real-time bioluminescens billeddannelse af notch signalering dynamik under murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om betydningen af genekspression dynamik i celleproliferedning og differentiering, især dynamikken i Notch signalering molekyler i neurale stamceller. Den største fordel ved denne teknik er, at vi kan overvåge genekspression både in vitro og in vivo med en meget høj præcision ved levende billeddannelse. Demonstration af proceduren vil være Hiromi Shimojo, adjunkt fra mit laboratorium, der udviklede denne nye teknologi.For Dll1 F luciferase reporter introduktion i NPC, bekræfte en manglende reaktion på pedal refleks i en embryonal dag 12,5 til 14,5 gravid mus, før du foretager en to-til tre-centimeter snit gennem maven, langs midterlinjen. Placer PBS-gennemblødt gaze omkring snittet, og bruge ringformede kraftpind til omhyggeligt at udtrække højre livmoder horn. Efter optælling af embryoner, bruge en mikro kapillær til at injicere en til to mikroliter af blandet Dll1 F luciferase reporter DNA i hjertekammer af telencephalon af hvert foster.En vellykket injektion vil resultere i overholdelse af blå farvestof over overfladen af livmoderen. Til elektroporation skal du våd livmoderen og elektroden med PBS, og forsigtigt gribe fat i hovedet på det første foster. Indstil den positivt ladede elektrode til den side af halvkugle, hvor DNA'et blev injiceret, og giv fem 30-til 50-volt, 50-millisekund impulser, med en et-sekund pause mellem impulser, kontrol af, at bobler genereres fra negativt ladede elektrode.Når alle embryoner er blevet injiceret, returnere venstre livmoder horn til maven, og bruge en 17-millimeter nål til at lukke snittet med en 4-0 silke sutur, placere varm PBS i bughulen, før du afslutter lukningen. For at oprette en dissocieret NPC kultur, først placere livmoderen fra en embryonal dag 12,5 til 14,5 gravid Dll1 ubiquitinated luciferase transgene mus i en 10-centimeter Petri fad, der indeholder 25 milliliter iskold PBS, og bruge mikro saks og fine kraftoverførsel til at fjerne embryoner fra livmoderen. Efter halshugning af embryoner, placere hovedet i en ny 10-centimeter petriskål indeholder iskold DMEM/F12, og fjern epidermis og brusk omkring hver hjerne.Overfør hjernen til en 35-millimeter skål under et dissekerende mikroskop, der indeholder tre milliliter iskoldT N2B27-medium. Fjern højre og venstre telencephalon fra diencephalon. Brug fine kraftbefængsler til at fjerne meninges, der dækker overfladen af telencephalon og til at dissekere den dorsolaterale del af cortex fra telencephalon.Når alle de neurale væv af interesse er blevet isoleret, skal du bruge en P1000 pipette til at overføre prøverne til individuelle 1,5-milliliter rør, og bruge en P200 pipette til at aspirere eventuelle ekstra medium fra hvert rør. Tilsæt 100 mikroliter papainopløsning pr. cortex par, og placer prøverne ved 24 grader Celsius i 15 minutter. Ved slutningen af inkubationen pipettes forsigtigt prøverne 10 gange med en ny P1000-pipette, og rørene returneres til 24 grader Celsius i yderligere 15 minutter.Ved inkubationens afslutning pipettes prøverne forsigtigt igen, før det fordøjede væv indsamles ved centrifugering. Inspirer supernatanterne, og opslæmp forsigtigt hver pellet med en milliliter DMEM/F12 medium. Centrifuge prøverne tre gange mere som blot påvist, forsigtigt resuspending hver pellet med en frisk milliliter medium efter hver centrifugering.Efter den sidste centrifugering opsuspenrede pellets i 500 mikroliter af N2B27 medium suppleret med en millimolar luciferin og frø en gang 10 til de seks celler fra hver prøve på individuelle poly-L-lysinbelagte glasbundsretter. Derefter placeres pladerne i cellekulturskuvøsen i en time. Når cellerne har holdt sig til skålen, tilsættes to milliliter frisk N2B27 medium plus en millimolar luciferin til hver plade.For at visualisere luciferase reporter udtryk i NPC dissociation kulturer, skal du vælge olie nedsænkning mål, og placere prøven parabol på mikroskop fase. Få vist feltet manuelt for at bestemme den bedste placering til visning af cellerne og fokusere på de celler, der er af interesse. Klik på Live for at hente testbilledet, og brug programmet Multi-Dimensional Acquisition til at køre time-lapse-anskaffelsen ved todimensionelle luminescens- og erhvervelser i lyse felter i 24 timer.For at forberede udvikle cortex skive kulturer, en dag efter reporter injektion, høste embryonale dag 13,5 til 14,5 embryo hjerner som påvist, og placere fadet indeholder hjerner på scenen af en fluorescens stereoskopisk mikroskop. Bekræft, at hver cortex udtrykker den injicerede fluorescerende reporter under passende excitation lys, og overføre hjerner til en silikone gummi skærebræt fyldt med 30 milliliter DMEM/F12 medium, boblede med 100% ilt gas. Brug en mikro kirurgisk kniv og fine kraftaffængt til at skære grænsen mellem den mediale og laterale del af dorsale telencephalon, og adskille vævet i to halvkugler.Brug derefter kniven til at skære cortex som striber for at opnå kortikale skiver, overføre skiverne i medium fra skærebrættet til en ny 35-millimeter petriskål, som de er erhvervet. Når alle skiverne er opsamlet, skal den afskårne overflade af hver skive på en kulturindsats, der er sat i en glasbundsskål, der indeholder beriget medium, justere retningen af hver skive med fine kraftbefædre efter behov. Fjern derefter overskydende medium med en pipette, og læg skålen i en multi-gas inkubator indstillet til 40% ilt, 5% kuldioxid og 37 grader Celsius i 30 minutter.Ved slutningen af inkubationen tilsættes 300 mikroliter beriget medium suppleret med en millimolar luciferin til kulturskålen. For at visualisere luciferase reporter udtryk inden for skiven kulturer, skal du vælge 40x mål, og placere prøven parabol på mikroskop fase. Ansk af fluorescensen, og indstil positionen og fokusplanet til interesseområdet under belysning af det relevante excitationslys.Kør derefter time-lapse erhvervelse af tre-dimensionelle luminescens, fluorescens, og lyse-felt opkøb i 24 timer. For at overvåge promotor aktivitet oscillerende genet Dll1, ubiquitinated luciferase, en destabiliseret luciferase reporter med en halveringstid på omkring 10 minutter, kan anvendes. Ligesom en fluorescerende reporter kan luciferase-reporteren bruges til at overvåge et proteins udtryksdynamik ved at blive smeltet til genkodningssekvensen af interesse.For at visualisere reporterudtryk på enkeltcelleniveau i vævskulturer kan reporter-genet transiently transinteres til NPC'er via in utero electroporation som påvist. Desuden mikroskop-baseret billeddannelse gør det muligt at erhverve lyse felt, fluorescens, og chemiluminescens billeder. Reporter af Dll1 promotor aktivitet udviser en oscillatory udtryk i NPC'er stammer fra telencephalon af Dll1 ubiquitinated F luciferase reporter mus, med destabiliserede luciferase reporter angiver en skarp op og ned regulering af udtrykket af initiativtageraktivitet.I tilstødende forbedrede grønne fluorescerende protein-positive celler transporterer Hes1 reporter og mCherry-positive celler udtrykker Dll1 protein reporter, der fik kontakt med hinanden under observation, Hes1 reporter udtryk synes at starte omkring 60 minutter efter kontakt, hvilket tyder på, at tidsforsinkelsen for transmission af Notch signalering mellem de tilstødende celler er omkring en time. Desuden udviser Dll1 proteinudtryk under signaltransmission en dynamisk translokation. Når du anskaffer bioluminescensbilleddannelsen, skal mikroskoprummet være helt mørkt, da uvedkommende lys kan forhindre en optimal erhvervelse.Den seneste udvikling inden for optogenetik giver os mulighed for at kontrollere genekspression med lys. Med denne teknik kan vi samtidig introducere forskellige mønster af genekspression og overvåge luciferase reporter svar.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Developmental Biology

Unit 2

Unit 1

Cell Signaling Pathways

Alternative Signaling Routes in Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Studere Wnt Signaling Under mønster af ledende Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Måling og Real Time Visualisering af Somatisk Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Stimulering af Notch signalering i Mouse osteoklastpræcursorer

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi Photon tid bortfalder Imaging til at visualisere udvikling i realtid: visualisering af overflytning neurale Crest celler i zebrafisk embryoner

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Real-time måling af epitel barriere permeabilitet i menneskelige tarm Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Billeddannelse af muskel-sene morfogenese i Drosophila pupper

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle billeddannelse af kromosom Segregation under mitosen

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

Neurogenese ved hjælp af P19 embryonal carcinoma celler

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Billeddannelse og analyse af vævsorientering og vækstdynamik i udvikling af Drosophila Epithelia under pupalfaser

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Realtidsbilleddannelse af CCL5-induceret migration af periosteal skeletstamceller i mus

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...