Name: real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis
Uploaded: 2019-12-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis at JoVE.com

We danken Yumiko Iwamoto voor de ondersteuning van de productie van de video. We zijn ook Akihiro Isomura dankbaar voor de bespreking en ondersteuning van beeldanalyse, Hitoshi Miyachi voor technische ondersteuning voor het genereren van transgene dieren, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) en OUIN Kunitaki (Andor Japan) voor de technische ondersteuning en discussies van het bioluminescentie beeldvormings systeem. Dit werk werd gesteund door kernonderzoek voor Evolutionele wetenschap en technologie (JPMJCR12W2) (R.K.), subsidie-in-steun voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden (MEXT 24116705 voor H.S. en MEXT 16H06480 voor R.K.), subsidie-in-steun voor wetenschappelijk onderzoek (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. en H.S.), en platform voor dynamische benaderingen van het woon systeem van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie, Japan.

Alle procedures, waaronder dierproef personen, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van het Instituut voor grens leven en medische wetenschappen, de Universiteit van Kyoto.
1. bioluminescentie verslaggevers
Opmerking: de plaats reporter is geschikt voor het meten van de snelle dynamiek van de organisator activiteit door het degradatie signaal te fusing. Bovendien maakt de plaats Fusion reporter het mogelijk om de eiwit dynamiek in de...

<ol>
	<li>Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+factors+in+cortical+development.">Basic helix-loop-helix factors in cortical development.</a> Neuron. 39, 13-25 (2003).</li><li>Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+intermediate+progenitor+cells+in+cerebral+cortex+development.">Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development.</a> Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li><li>Paridaen, J. T., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+during+development+of+the+vertebrate+central+nervous+system.">Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system.</a> EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).</li><li>Taverna, E., G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+vertebrate+neural+development.">Notch signaling in vertebrate neural development.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).</li><li>Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+in+the+Vertebrate+Nervous+System:+An+Old+Dog+with+New+Tricks.">Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks.</a> Neuron. 69, 840-855 (2011).</li><li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling:+a+simple+pathway+becomes+complex.">Notch signalling: a simple pathway becomes complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).</li><li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+in+context.">Notch signalling in context.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Canonical+Notch+Signaling+Pathway:+Unfolding+the+Activation+Mechanism.">The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism.</a> Cell. 137, 216-233 (2009).</li><li>Ishibashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+helix-loop-helix+factor+HES-1+prevents+mammalian+neural+differentiation+in+the+central+nervous+system.">Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system.</a> The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).</li><li>Ohtsuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hes1+and+Hes5+as+notch+effectors+in+mammalian+neuronal+differentiation.">Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation.</a> The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).</li><li>Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Basic+Helix-Loop-Helix+Genes+Hes1+and+Hes5+in+Expansion+of+Neural+Stem+Cells+of+the+Developing+Brain.">Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).</li><li>Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hes+gene+family:+repressors+and+oscillators+that+orchestrate+embryogenesis.">The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis.</a> Development. 134, 1243-1251 (2007).</li><li>Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+in+Notch+Signaling+Regulate+Maintenance+of+Neural+Progenitors.">Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors.</a> Neuron. 58, 52-64 (2008).</li><li>Imayoshi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors.">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li><li>Shimojo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis.">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes and Development. 30, 102-116 (2016).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+expression+of+the+bHLH+factor+Hes1+regulated+by+a+negative+feedback+loop.">Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.</a> Science. 298, 840-843 (2002).</li><li>Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Notch+signaling+in+neural+progenitor+cells+and+a+revised+view+of+lateral+inhibition.">Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition.</a> Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+pulsing+in+genetic+circuits.">Functional roles of pulsing in genetic circuits.</a> Science. 342, 1193-1200 (2013).</li><li>Purvis, J. E., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+decoding+cellular+information+through+signaling+dynamics.">Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics.</a> Cell. 152, 945-956 (2013).</li><li>Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+26S+proteasome+activity+and+inhibition+in+living+mice.">Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice.</a> Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).</li><li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Cellular+Clocks+in+the+Suprachiasmatic+Nucleus.">Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus.</a> Science. 302, 1408-1412 (2003).</li><li>Kiyohara, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMAL1+C+terminus+regulates+the+circadian+transcription+feedback+loop.">The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).</li><li>Behar, M., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+temporal+codes+of+intra-cellular+signals.">Understanding the temporal codes of intra-cellular signals.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Gene+Expression+in+a+Single+Cell.">Stochastic Gene Expression in a Single Cell.</a> Science. 297, 1183-1186 (2002).</li><li>Nelson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+in+NF-kappaB+signaling+control+the+dynamics+of+gene+expression.">Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression.</a> Science. 306, 704-708 (2004).</li><li>Purvis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+dynamics+control+cell+fate.">p53 dynamics control cell fate.</a> Science. 336, 1440-1444 (2012).</li><li>Hansen, A. S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+decoding+of+transcription+factor+dynamics+involves+a+trade-off+between+noise+and+control+of+gene+expression.">Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression.</a> Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).</li><li>Hansen, A. S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+Determinants+of+Promoter+Threshold+and+Activation+Timescale.">cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale.</a> Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).</li><li>Johnson, H. E., Toettcher, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Dynamics+Control+Cell+Fate+in+the+Early+Drosophila+Embryo.">Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+Progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: Progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Nakajima, Y., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+assays:+multicolor+luciferase+assay,+secreted+luciferase+assay+and+imaging+luciferase+assay.">Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).</li><li>Nakajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+beetle+luciferase+for+high-resolution+bioluminescence+imaging.">Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Stacer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+reporter+for+dual+luciferase+imaging+in+living+animals.">NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals.</a> Molecular Imaging. 12, (2013).</li></ol>

De componenten van Inkeping signalering tonen oscillerende uitdrukkingen in Synchrony tijdens somitogenese maar uit Synchrony tijdens neurogenese, wat leidt tot de moeilijkheden bij het vastleggen van de expressie dynamiek door statische analyse in het laatste geval. Real-time monitoring is dus vereist om de expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten, zoals Hes1 en dll1-te onthullen. Omdat de perioden van de expressies van Hes1 en dll1- oscillaties extreem kort zijn, zijn ...

Het zoogdier brein bestaat uit een groot aantal verschillende soorten neuronen en gliacellen. Alle cellen worden gegenereerd uit neurale stam/voorlopercellen (npc's), die eerst prolifereren om hun getallen uit te breiden, dan beginnen te differentiëren in neuronen, en ten slotte geven aanleiding tot gliacellen1,2,3,4,5. Zodra cellen zijn gedifferentieerd in neuronen, ze kunnen niet vermenigvuldigen of hun aantallen te verhogen, en daarom, het onderhoud van Npc's tot latere stadia is belangrijk. Notch signalering via celcelinteracties speelt een belangrijke rol bij het handhaven van npc's6,7. Notch liganden interactie met het membraan eiwit, Inkeping, op het oppervlak van de naburige cellen en activeert de inkeping eiwit. Na activering komt proteolyse van Inkeping eiwit voor, waardoor het intracellulaire domein van Inkeping (NiCd) van het celmembraan in de Nucleus8,9,10wordt vrijgegeven. In de Nucleus bindt NICD aan de organisator regio's van Hes1 en Hes5 (Hes1/5) en activeert de expressie van deze genen. Hes1/5 Druk op de uitdrukking van de proneural genen Ascl1 en Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Omdat proneural genen neuronale differentiatie induceren, spelen Hes1/5 essentiële rollen bij het onderhouden van npc's. Bovendien, als proneural genen de uitdrukking van de inkeping ligand Delta-like1 (Dll1-) kunnen activeren, Hes1/5 ook onderdrukken de uitdrukking van dll1-. Daarom, de uitdrukking van Dll1-leidt tot de naburige cellen negatief voor Dll1-via inkeping signalering. Op deze manier, cellen remmen aangrenzende cellen van het volgen van hun zelfde lot, een fenomeen bekend als de laterale remming8. In de ontwikkelende hersenen speelt laterale remming een rol bij het genereren van verschillende celtypen.
Real-time beeldvorming op het niveau van één cel onthult dynamische expressies van de componenten van Inkeping signalering in npc's15,16,17. Notch signalering activeert de uitdrukking van Hes1, maar Hes1 eiwit bindt aan zijn eigen promotor en onderdrukt zijn eigen uitdrukking. Bovendien is Hes1 een extreem onstabiel eiwit, dat wordt aangetast door het ubiquitin-proteasome traject; Daarom is de onderdrukking van zijn eigen promotor slechts van korte duur en vervolgens begint de transcriptie opnieuw. Op deze manier, de uitdrukking van Hes1 schommelt op zowel de transcriptie en translationele niveaus in een 2 h cyclus18. De oscillerende uitdrukking van Hes1 induceert op zijn beurt de oscillerende expressie van de downstream-doel genen, zoals Ascl1, Neurog2 en dll1-, via periodieke repressie15,16,17,19. Terwijl proneural genen neuronale differentiatie kunnen induceren, is hun oscillerende expressie niet voldoende voor Neuronale Differentiatie; hun aanhoudende expressie is veeleer essentieel voor de neuronale differentiatie. De oscillerende expressie van proneural genen is belangrijk voor het onderhouden van npc's in plaats van voor het induceren van neuronale differentiatie14,15,16. De uitdrukking van dll1- oscilleert op zowel de transcriptie-als translationele niveaus tijdens verschillende morfogenese, zoals neurogenese en somitogenese. De dynamische expressie van dll1- is belangrijk voor de normale morfogenese en gestage expressie van dll1-induceert defecten in neurogenese en somitogenese17. Deze bevindingen tonen de belangrijke functie die de dynamiek van genexpressie en eiwit kinetiek heeft op de regulering van verschillende ontwikkelings gebeurtenissen (d.w.z. dat verschillende expressie dynamiek verschillende outputs in cellulair gedrag oplevert).
Voor het analyseren van de dynamiek van Inkeping signalering, de statische analyse van weefsels en cellen zijn onvoldoende omdat ze voortdurend veranderen. Real-time beeldvorming van enkele cellen is een krachtig hulpmiddel om de dynamiek in genexpressie te onthullen. De dynamische uitdrukking van inkepingen signalering moleculen ondergaan snelle cyclische reacties in de periode van 2-3 h. Deze snelle periodieke uitdrukking presenteert twee moeilijke problemen voor de real-time monitoring: (1) de uitdrukking van de moleculen wordt onderdrukt tot lage niveaus, en (2) snelle omzet vereist snelle respons Reporters. Om deze problemen te overwinnen, ontwikkelden we eerder een bioluminescentie real-time beeldvormings methode20. Omdat de Bioluminescentie reporter een hogere gevoeligheid en kortere rijpingstijd heeft dan fluorescerende reporters, stelt deze strategie ons in staat om de snelle dynamiek in levende cellen te monitoren. Met behulp van real-time visualisatie ontdekten we dat meer genen dynamische expressie vertoonden dan we eerder dachten. Daarnaast is het aantal rapporten met uitdrukking en eiwit dynamiek in levende cellen en de betekenis van deze dynamiek in verschillende biologische gebeurtenissen toegenomen, wat een fundamentele rol van de dynamiek in genexpressies21,22suggereert.
In dit rapport beschrijven we een manier om de uitdrukking van de inkeping ligand dll1-in npc's in zowel gezien culturen als in corticale segment culturen te visualiseren. Om de dynamiek van dll1- transcriptie op één celniveau te monitoren, genereerden we gezien culturen van npc's afgeleid van de embryonale telencephalon van transgene muizen met pDll1-UB-Fluc Reporter, een dll1-Promoter-gedreven gedestabiliseerde plaats Reporter. Om Dll1-proteïne dynamica in vivo te monitoren, introduceerden we de Dll1--Fluc Fusion reporter in Npc's in de cortex en visualiseerde de uitdrukking van de reporter in Npc's in corticale segment culturen. Real-time Imaging stelde ons in staat om de verschillende kenmerken van genexpressie en eiwit dynamiek in levende cellen te vangen met een hoge temporele resolutie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioluminescence Imaging System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled water circulator (chiller)</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>Model: F12-ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Model: iKon-M 934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>Model: INU-ONICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination device</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>Model: pE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td>Model: 40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix gas controller</td>
			<td>Tokken</td>
			<td>Model: TK-MIGM OLO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: UPLFLN 40X O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Model: SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for NPC dissociation culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock solution: 1 &#956;g/ml in 0.1% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01493-85</td>
			<td>Stock solution: 100mM in 0.9% saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003172</td>
			<td>Stock solution: 1000U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cystein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003178</td>
			<td>Stock solution: 7U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptmycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6281</td>
			<td>40 mg/ml in DW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for in utero electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>181228T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>7-mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>CUY21 EDIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauzes</td>
			<td>Kawamoto co.</td>
			<td>7161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro capillary</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentbarbital</td>
			<td>Kyoritsuseiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needle</td>
			<td>Akiyama MEDICAL MFG. CO</td>
			<td>F17-40B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Seractal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Slice culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro surgical knife</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>19 Gauge V-Lance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5MUV-PJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2/B27 media</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>ref. NPC dissociatioin culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber cutting board</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis

Inkeping signalering regelt het onderhoud van neurale stam/progenitorcellen door celcelinteracties. De componenten van Inkeping signalering vertonen dynamische expressie. Inkeping signalering Effector Hes1 en de inkeping ligand Delta-like1 (dll1-) worden uitgedrukt in een oscillerende manier in neurale stam/voorlopercellen. Omdat de periode van de oscillerende expressie van deze genen zeer kort is (2 uur), is het moeilijk om hun cyclische expressie te monitoren. Om zulke snelle veranderingen in de genexpressie of eiwit dynamiek te onderzoeken, zijn snelle respons verslaggevers vereist. Vanwege de snelle rijpings kinetiek en hoge gevoeligheid is de Bioluminescentie reporter plaats geschikt om snelle genexpressie veranderingen in levende cellen te monitoren. We gebruikten een gedestabiliseerde plaats reporter voor het bewaken van de organisator activiteit en een plaats-gesmolten reporter voor visualisatie van eiwit dynamica bij een enkele celresolutie. Deze bioluminescentie verslaggevers vertonen een snelle omzet en genereren zeer zwakke signalen; Daarom hebben we een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem ontwikkeld om dergelijke zwakke signalen te detecteren. Deze methoden stellen ons in staat om verschillende genexpressie dynamiek in levende cellen en weefsels te monitoren, wat belangrijke informatie is om de werkelijke cellulaire toestanden te helpen begrijpen.

Uitdrukkingen van de genen Hes1/7 vertonen 2 uur oscillatie cyclus in verschillende cellijnen en tijdens de somitogenese. Bovendien is de periode van oscillatie zeer kort en zowel hun Mrna's en eiwitten zijn zeer onstabiel met de halfwaardetijd van rond 20 min. Als we een trage reactie reporter gebruiken, kunnen we dergelijke snelle dynamiek niet traceren en als we een stabiele reporter gebruiken, accuiteert deze geleidelijk, terwijl de genexpressie oscilleert. Zo moet de melder snel worden afgebroken om de snel...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis at JoVE.com

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de betekenis van genexpressie dynamiek in celproliferatie en differentiatie, met name de dynamiek van Notch signalering moleculen in neurale stamcellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we zowel in vitro als in vivo genexpressie kunnen monitoren met een zeer hoge precisie door live beeldvorming. Het aantonen van de procedure zal Hiromi Shimojo zijn, de assistent-professor uit mijn laboratorium die deze nieuwe technologie ontwikkelde.Voor Dll1 F luciferase verslaggever inleiding in NPC, bevestigen een gebrek aan reactie op pedaal reflex in een embryonale dag 12,5 tot 14,5 zwangere muis voor het maken van een twee-tot drie centimeter incisie door de buik, langs de middellijn. Plaats PBS-geweekt gaas rond de incisie, en gebruik ringvormige tangen om zorgvuldig te extraheren van de juiste baarmoeder hoorn. Gebruik na het tellen van de embryo's een micro capillair om één tot twee microliter gemengde Dll1 F luciferase reporter DNA te injecteren in de ventrikel van de telencephalon van elk embryo.Een succesvolle injectie zal resulteren in de naleving van blauwe kleurstof over het oppervlak van de baarmoeder. Voor elektroporatie, nat de baarmoeder en de elektrode met PBS, en voorzichtig grijpen het hoofd van het eerste embryo. Stel de positief geladen elektrode aan de kant van het halfrond in waarin het DNA werd geïnjecteerd, en geef vijf 30-tot 50-volt, 50-milliseconde pulsen, met een pauze van één seconde tussen pulsen, waarbij wordt gecontroleerd of bellen worden gegenereerd uit de negatief geladen elektrode.Wanneer alle embryo's zijn geïnjecteerd, breng de linker baarmoederhoorn terug naar de buik en gebruik een 17-millimeter naald om de incisie te sluiten met een 4-0 zijden hechting, waardoor warme PBS in de buikholte worden gelegd voordat de sluiting wordt voltooid. Voor het opzetten van een gescheiden NPC cultuur, ten eerste plaats de baarmoeder van een embryonale dag 12,5 tot 14,5 zwangere Dll1 ubiquiinated luciferase transgene muis in een 10-centimeter Petri schotel met 25 milliliter ijskoude PBS, en gebruik microschaar en fijne tangen om de embryo's te verwijderen uit de baarmoeder. Na het onthoofden van de embryo's, plaats de hoofden in een nieuwe 10-centimeter Petri schotel met ijskoude DMEM/F12, en verwijder de opperhuid en kraakbeen rond elke hersenen.Breng de hersenen in een 35-millimeter schotel onder een ontledenmicroscoop met drie milliliter ijskoud N2B27 medium. Verwijder de rechter- en linkertelengte van diencephalon. Gebruik fijne tangen om de hersenvliezen die het oppervlak van telencephalon bedekken te verwijderen en om het dorsolaterale deel van de cortex uit de telencephalon te ontleden.Wanneer alle neurale weefsels van belang zijn geïsoleerd, gebruik maken van een P1000 pipet om de monsters over te dragen in individuele 1,5-milliliter buizen, en gebruik een P200 pipet om een extra medium van elke buis aan te trekken. Voeg 100 microliters papaïneoplossing per cortexpaar toe en plaats de monsters gedurende 15 minuten op 24 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, voorzichtig pipette de monsters 10 keer met een nieuwe P1000 pipet, en breng de buizen terug naar 24 graden Celsius voor een extra 15 minuten.Aan het einde van de incubatie, voorzichtig pipette de monsters weer voor het verzamelen van de verteerde weefsels door centrifugatie. Aspirate de supernatants, en voorzichtig resuspend elke pellet met een milliliter van DMEM/ F12 medium. Centrifuge de monsters nog drie keer zoals net aangetoond, voorzichtig resuspending elke pellet met een verse milliliter van medium na elke centrifugatie.Na de laatste centrifugatie, resuspend de pellets in 500 microliters van N2B27 medium aangevuld met een-millimolar luciferine, en zaad een keer 10 tot de zes cellen van elk monster op individuele poly-L-lysine-gecoate glazen bodemschotels. Plaats vervolgens de platen in de celcultuur incubator voor een uur. Zodra de cellen hebben gehecht aan de schotel, voeg twee milliliter verse N2B27 medium plus een-millimolar luciferin aan elke plaat.Om luciferase reporter expressie in NPC dissociatie culturen visualiseren, selecteer de olie onderdompeling doelstelling, en plaats het monster schotel op de microscoop stadium. Bekijk het veld handmatig om de beste positie voor het bekijken van de cellen te bepalen en focus op de cellen van belang. Klik op Live om de testafbeelding te verkrijgen en gebruik het multidimensionale acquisitieprogramma om de time-lapse-acquisitie uit te voeren door tweedimensionale luminescentie- en bright-field-acquisities gedurende 24 uur.Voor de voorbereiding van de ontwikkeling van cortex slice culturen, een dag na reporter injectie, oogst de embryonale dag 13,5 tot 14,5 embryo hersenen zoals aangetoond, en plaats het gerecht met de hersenen op het stadium van een fluorescentie stereoscopische microscoop. Bevestig dat elke cortex de geïnjecteerde tl-reporter onder het juiste excitatielicht uitdrukt en breng de hersenen over naar een siliconen rubberen snijplank gevuld met 30 milliliter DMEM/F12-medium, boordebeld met 100% zuurstofgas. Gebruik een micro chirurgisch mes en fijne tangen om de grens tussen het mediale en laterale gedeelte van de rugstelengte te snijden, en scheid het weefsel in twee hemisferen.Gebruik vervolgens het mes om de cortex als strepen te snijden om corticale plakjes te verkrijgen, waarbij de plakjes in medium van de snijplank worden overgebracht naar een nieuwe petrischaal van 35 millimeter terwijl ze worden verworven. Wanneer alle plakjes zijn verzameld, plaats het gesneden oppervlak van elk plakje op een kweekplaat in een glazen bodemschaal met verrijkt medium, waarbij de oriëntatie van elk segment zo nodig wordt aangepast met fijne tangen. Verwijder vervolgens een overtollig medium met een pipet en plaats de schotel in een multi-gas incubator ingesteld op 40% zuurstof, 5% kooldioxide, en 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Voeg aan het einde van de incubatie 300 microliter verrijkt medium toe, aangevuld met één millimolar luciferin aan het kweekgerecht. Om de luciferase reporter expressie in de slice culturen te visualiseren, selecteert u de 40x doelstelling, en plaats het monster schotel op de microscoop stadium. Verwerf een testbeeld van de fluorescentie en stel de positie en het focusvlak in op het gebied van belang onder de verlichting van het juiste excitatielicht.Voer vervolgens de time-lapse-acquisitie uit door driedimensionale luminescentie-, fluorescentie- en bright-field-acquisities gedurende 24 uur. Om de promotoractiviteit van het oscillerende gen Dll1 te monitoren, kan alomtegenwoordige luciferase, een gedestabiliseerde luciferase-verslaggever met een halflevenstijd van ongeveer 10 minuten, worden gebruikt. Net als een fluorescerende verslaggever, kan de luciferase verslaggever worden gebruikt om de expressie dynamiek van een eiwit te controleren door te worden versmolten met de gen codering sequentie van belang.Om de expressie van verslaggevers op eencellig niveau in weefselculturen te visualiseren, kan het reportergen via utero-elektroporatie, zoals aangetoond, transiëntly worden doorgetransfecteerd in NPC's. Bovendien, microscoop-gebaseerde beeldvorming maakt de verwerving van helder-veld, fluorescentie, en chemiluminescentie beelden. De verslaggever van Dll1 promotor activiteit vertoont een oscillerende uitdrukking in NPC's afgeleid van de telencephalon van Dll1 ubiquiinated F luciferase reporter muizen, met de gedestabiliseerde luciferase verslaggever die een scherpe op en neer regulering van de expressie van promotor activiteit.In aangrenzende verbeterde groene fluorescerende eiwit-positieve cellen die Hes1 verslaggever en mCherry-positieve cellen uitdrukken Dll1 eiwit verslaggever die contact met elkaar gemaakt tijdens observatie, Hes1 verslaggever expressie lijkt te beginnen ongeveer 60 minuten na contact, wat suggereert dat de vertraging voor de overdracht van Notch signalering tussen de aangrenzende cellen is ongeveer een uur. Bovendien vertoont Dll1-eiwitexpressie tijdens signaaloverdracht een dynamische translocatie. Houd bij het verwerven van de bioluminescentiebeeldvorming de microscoopruimte volledig donker, omdat vreemd licht een optimale acquisitie kan voorkomen.Recente ontwikkelingen in optogenetica stelt ons in staat om genexpressie te controleren met licht. Met deze techniek kunnen we tegelijkertijd verschillende patronen van genexpressie introduceren en de reacties van luciferase reporter monitoren.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Developmental Biology

Unit 2

Unit 1

Cell Signaling Pathways

Alternative Signaling Routes in Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Studeren Wnt Signalering Tijdens patroonvorming van Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Meet- en Real Time Visualisatie van Somatic herprogrammeren

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Beeldvorming van de spier-pees morfogenese in Drosophila poppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

Neurogenese met behulp van P19 embryonale carcinoom cellen

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Real-time beeldvorming van CCL5-geïnduceerde migratie van periosteale skeletstamcellen bij muizen

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...