Name: real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis
Uploaded: 2019-12-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis at JoVE.com

映像制作を応援してくださった岩本由美子さんに感謝します。また、磯村明宏の議論や画像解析のサポートにも感謝しており、トランスジェニック動物の生成に対する技術支援のための宮地仁、新庄裕司(オリンパス医学)、江川正敏(オリンパス医科)、石津拓也()オリンパス医科学)とオイン・クニタキ(アンドール・ジャパン)は、生物発光イメージングシステムの技術サポートと議論を行っています。この研究は、進化科学技術のコア研究(JPMJCR12W2)(R.K.)、革新的領域に関する科学研究のための助成(H.S.のためのMEXT 24116705およびR.K.のためのMEXT 16H06480)、科学研究のための補助金援助(C)(JSPS)によって支えられた18K06254)(H.S.)、武田財団(R.K.およびH.S.)、および文部科学省の生活システムへの動的アプローチのためのプラットフォーム。

動物の被験者を含むすべての手続きは、京都大学フロンティア生命医科学研究所の制度的動物管理利用委員会によって承認されています。
1. 生物発光レポーター
注:ルシフェラーゼレポーターは、分解シグナルを融合してプロモーター活性の急速なダイナミクスを測定するのに適しています。さらに、ルシフェラーゼ融合レポーターは、単一細胞にお?...

<ol>
	<li>Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+factors+in+cortical+development.">Basic helix-loop-helix factors in cortical development.</a> Neuron. 39, 13-25 (2003).</li><li>Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+intermediate+progenitor+cells+in+cerebral+cortex+development.">Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development.</a> Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li><li>Paridaen, J. T., Huttner, W. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMAL1+C+terminus+regulates+the+circadian+transcription+feedback+loop.">The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).</li><li>Behar, M., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+temporal+codes+of+intra-cellular+signals.">Understanding the temporal codes of intra-cellular signals.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+decoding+of+transcription+factor+dynamics+involves+a+trade-off+between+noise+and+control+of+gene+expression.">Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression.</a> Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).</li><li>Hansen, A. S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+Determinants+of+Promoter+Threshold+and+Activation+Timescale.">cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale.</a> Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).</li><li>Johnson, H. E., Toettcher, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Dynamics+Control+Cell+Fate+in+the+Early+Drosophila+Embryo.">Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+Progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: Progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Nakajima, Y., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+assays:+multicolor+luciferase+assay,+secreted+luciferase+assay+and+imaging+luciferase+assay.">Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).</li><li>Nakajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+beetle+luciferase+for+high-resolution+bioluminescence+imaging.">Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Stacer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+reporter+for+dual+luciferase+imaging+in+living+animals.">NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals.</a> Molecular Imaging. 12, (2013).</li></ol>

ノッチシグナル伝達の成分は、ソミト形成時に同期して振動発現を示すが、神経新生時には同期がとれないので、後者の場合には静的解析によって発現ダイナミクスを捕捉するのが困難になる。したがって、Hes1やDll1などのノッチ シグナリング コンポーネントの表現ダイナミクスを明らかにするには、リアルタイム監視が必要です。Hes1およびDll1振動の式の期間は?...

哺乳類の脳は、様々な種類のニューロンとグリア細胞で構成されています。すべての細胞は神経幹/前駆細胞(NPC)から生成され、最初に増殖してその数を拡大し、次にニューロンに分化し始め、最後にグリア細胞1、2、3、4、5を生み出します。細胞がニューロンに分化すると、細胞の増殖や数の増加はできないため、後の段階までNPCのメンテナンスが重要になります。細胞間相互作用を介したノッチシグナル伝達は、NPC6、7を維持する上で重要な役割を果たす。ノッチリガンドは、隣接する細胞の表面上の膜タンパク質、ノッチと相互作用し、ノッチタンパク質を活性化します。活性化後、ノッチタンパク質のタンパク質分解が起こり、それによってノッチ(NICD)の細胞内ドメインを細胞膜から核8、9、10に放出する。核では、NICDはHes1およびHes5(Hes1/5)のプロモーター領域に結合し、これらの遺伝子の発現を活性化する。 Hes1/5 は、プロニューラル遺伝子Ascl1およびニューロゲニン1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14の発現を抑制します。プロニューラル遺伝子は神経分化を誘発するので、Hes1/5はNPCの維持に重要な役割を果たします。さらに、プロニューアル遺伝子はノッチリガンドデルタ様1(Dll1)の発現を活性化することができるので、Hes1/5もDll1の発現を抑制する。したがって、Dll1 の式は、ノッチシグナリングを介して Dll1 に対して隣接するセルが負の結果になります。このようにして、細胞は隣接する細胞が同じ運命をたどるのを阻害し、横方向阻害8と呼ばれる現象である。発達中の脳では、側面阻害は様々な異なる細胞型を生成する役割を果たす。
単一細胞レベルでのリアルタイムイメージングは、NPC15、16、17におけるノッチシグナリングの成分の動的表現を明らかにする。ノッチシグナル伝達はHes1の発現を活性化しますが、Hes1タンパク質は独自のプロモーターに結合し、独自の発現を抑制します。さらに、Hes1は非常に不安定なタンパク質であり、ユビキチン-プロテアソーム経路によって分解される。したがって、独自のプロモーターの抑圧は短命であり、その後、転写が再び開始されます。このようにして、Hes1の発現は、2時間サイクル18における転写レベルと翻訳レベルの両方で振動する。Hes1の振動発現は、順番に、Ascl1、Neurog2、およびDll1などの下流標的遺伝子の振動発現を、周期的な抑制15、16、17、19を介して誘導する。プロニューラル遺伝子は神経分化を誘発する可能性がありますが、その振動発現は神経分化には不十分です。むしろ彼らの持続的な発現は、神経の分化のために不可欠です。プロエン神経遺伝子の振動発現は、神経分化14、15、16を誘導するのではなく、NPCを維持するために重要である。Dll1の発現は、神経新生やソミトジェネシスなどの様々な形態形成の間の転写および翻訳レベルの両方で振動する。Dll1の動的発現は、正常な形態形成およびDll1の安定した発現が神経新生およびソミト形成17の欠陥を誘発する上で重要である。これらの知見は、遺伝子発現およびタンパク質動態のダイナミクスが様々な発達イベントの調節に及ぼす重要な機能を示している(すなわち、異なる発現ダイナミクスが細胞挙動において異なる出力を生み出す)。
ノッチシグナル伝達のダイナミクスを分析するために、組織や細胞の静的解析は絶えず変化しているため不十分です。単一細胞のリアルタイムイメージングは、遺伝子発現のダイナミクスを明らかにする強力なツールです。ノッチシグナル伝達分子の動的発現は、2〜3時間の間に急速な環状応答を受ける。この迅速な周期的発現は、リアルタイムモニタリングのための2つの困難な問題を提示する:(1)分子の発現が低レベルに抑制され、(2)急速な回転率は高速応答レポーターを必要とする。これらの問題を克服するために、我々は以前に生物発光リアルタイムイメージング法20を開発した。生物発光レポーターは蛍光レポーターよりも感度が高く成熟時間が短いため、生細胞の急激なダイナミクスをモニタリングすることができます。リアルタイムビジュアライゼーションを用いて、これまで考えられていたよりも多くの遺伝子が動的発現を示していることがわかりました。また、生細胞における発現およびタンパク質ダイナミクスを示す報告の数および様々な生物学的事象におけるこれらのダイナミクスの意義が増加しており、遺伝子発現21、22におけるダイナミクスの基本的な役割を示唆している。
本報告では、解別培養と皮質スライス培養の両方において、NPCにおけるノッチリガンドDll1の発現を可視化する方法について説明する。単一細胞レベルでのDll1転写のダイナミクスをモニタリングするために、pDll1-Ub-Flucレポーターを担うトランスジェニックマウスの胚性脳から由来するNPCの解離培養物を生成した。生体内のDll1タンパク質ダイナミクスをモニタリングするために、皮質のNPCにDll1-Fluc融合レポーターを導入し、皮質スライス培養におけるNPCにおけるレポーターの発現を可視化した。リアルタイムイメージングにより、生細胞における遺伝子発現やタンパク質ダイナミクスの様々な特徴を高い時間分解能で捉え得ることができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioluminescence Imaging System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled water circulator (chiller)</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>Model: F12-ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Model: iKon-M 934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>Model: INU-ONICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination device</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>Model: pE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td>Model: 40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix gas controller</td>
			<td>Tokken</td>
			<td>Model: TK-MIGM OLO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: UPLFLN 40X O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Model: SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for NPC dissociation culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock solution: 1 &#956;g/ml in 0.1% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01493-85</td>
			<td>Stock solution: 100mM in 0.9% saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003172</td>
			<td>Stock solution: 1000U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cystein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003178</td>
			<td>Stock solution: 7U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptmycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6281</td>
			<td>40 mg/ml in DW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for in utero electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>181228T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>7-mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>CUY21 EDIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauzes</td>
			<td>Kawamoto co.</td>
			<td>7161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro capillary</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentbarbital</td>
			<td>Kyoritsuseiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needle</td>
			<td>Akiyama MEDICAL MFG. CO</td>
			<td>F17-40B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Seractal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Slice culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro surgical knife</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>19 Gauge V-Lance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5MUV-PJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2/B27 media</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>ref. NPC dissociatioin culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber cutting board</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis

ノッチシグナル伝達は、細胞間相互作用によって神経幹/前駆細胞の維持を調節する。ノッチシグナリングの成分は動的発現を示す。ノッチシグナル伝達エフェクターHes1およびノッチリガンドデルタ様1(Dll1)は、神経幹/前駆細胞において振動的に発現される。これらの遺伝子の振動発現の期間は非常に短い(2時間)ため、その周期発現を監視することは困難である。このような遺伝子発現またはタンパク質ダイナミクスの急速な変化を調べるには、迅速な応答レポーターが必要である。その速い成熟運動と高感度のために、生物発光レポータールシフェラーゼは、生きている細胞の急速な遺伝子発現変化を監視するのに適しています。プロモーター活性をモニタリングするために不安定化ルシフェラーゼレポーターと、単一細胞分解能でタンパク質ダイナミクスを可視化するためのルシフェラーゼ融合レポーターを使用しました。これらの生物発光レポーターは、急速な回転率を示し、非常に弱い信号を生成します。そこで、このようなかすかな信号を検出する高感度生物発光イメージングシステムを開発しました。これらの方法により、生きている細胞や組織における様々な遺伝子発現ダイナミクスをモニタリングすることが可能となり、実際の細胞状態を理解するのに役立つ重要な情報である。

遺伝子Hes1/7の表現は、様々な細胞株および通血中に2時間振動サイクルを示す。さらに、振動の期間は非常に短く、mRNAとタンパク質の両方が約20分の半減期で非常に不安定です。応答が遅いレポーターを使用すると、このような急速なダイナミクスを追跡することができず、安定したレポーターを使用すると、遺伝子発現が振動する間に徐々に蓄積します。したがって、レポーターは、...

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Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

神経幹/前駆細胞は、細胞イベントの異なる結果につながるノッチシグナル伝達成分の様々な発現ダイナミクスを示す。このような動的発現は、遺伝子発現の急速な変化の可視化を可能にする高感度生物発光イメージングシステムを用いて、静的解析ではなくリアルタイムモニタリングによって明らかにすることができる。

マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

この方法は、細胞増殖と分化における遺伝子発現ダイナミクスの重要性、特に神経幹細胞におけるノッチシグナル伝達分子のダイナミクスに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ライブイメージングによって非常に高精度でインビトロとインビボの両方の遺伝子発現を監視できることです。この手順を実証するのが、この新技術を開発した研究室の下條宏助教授です。NPCへのDll1 Fルシファーゼレポーターの導入については、胚の日12.5〜14.5妊娠中のマウスでペダル反射への応答の欠如を確認してから、正中線に沿って腹部を通して2〜3センチメートルの切開を行う。切開の周りにPBS浸しガーゼを置き、リング状の鉗子を使用して慎重に右の子宮ホーンを抽出します。胚を数えた後、マイクロキャピラリーを使用して、混合Dll1 FルシフラーゼレポーターDNAの1〜2マイクロリットルを各胚のテレンセバロンの心室に注入する。注射が成功すると、子宮の表面に青い染料が観察されます。エレクトロポレーションの場合は、PBSで子宮と電極を湿潤し、第1の胚の頭部を軽くつかむ。正に荷電した電極をDNAが注入された半球の側に設定し、30~50ボルトの50ボルトのパルスを5個提供し、パルス間に1秒間の休止を行い、負に帯電した電極から気泡が発生することを確認します。すべての胚が注入されたら、左子宮角を腹部に戻し、17ミリメートルの針を使って4-0シルク縫合糸で切開を閉じ、閉鎖を完了する前に腹腔に温かいPBSを入れる。解離されたNPC培養を設定するには、胚の日12.5から14.5の妊娠中のDll1ユビキチン化されたルシフェラーゼトランスジェニックマウスから25ミリリットルの氷冷PBSを含む10センチメートルのペトリ皿に子宮を置き、マイクロハサミと細かい鉗子を使用して子宮から胚を取り除きます。胚を切断した後、氷冷DMEM/F12を含む新しい10センチメートルのペトリ皿に頭部を置き、各脳を取り巻く表皮および軟骨を取り除く。3ミリリットルの氷冷N2B27培地を含む解剖顕微鏡の下で、脳を35ミリメートルの皿に移します。右と左のテレンスファロンを、ジエンスファロンから取り出します。細かい鉗子を使用して、テレンセバロンの表面を覆う髄膜を取り除き、テレンセックスの側側部分をテレンセグロンから解剖する。目的の神経組織がすべて単離されたら、P1000ピペットを使用してサンプルを個々の1.5ミリリットルチューブに移し、P200ピペットを使用して各チューブから余分な培地を吸引します。皮質対当たり100マイクロリットルのパパイン溶液を加え、サンプルを摂氏24度で15分間置きます。インキュベーションの最後に、サンプルを新しいP1000ピペットで10回そっとピペットし、チューブを摂氏24度に戻します。インキュベーションの終了時に、サンプルを再び穏やかにピペットしてから、遠心分離によって消化された組織を採取する。上清を吸引し、各ペレットを1ミリリットルのDMEM/F12培地で徐々に再懸濁する。サンプルをさらに3回遠心分離し、各遠心分離後に新鮮なミリリットルの培地で各ペレットを穏やかに再懸濁する。最後の遠心分離の後、1ミリモルルシフェリンを補充したN2B27培地の500マイクロリットルのペレットを再懸濁し、各サンプルから6個の細胞に10回10回種を個々のポリLリジンコーティングガラス底皿に入れます。次いで、細胞培養インキュベーターにプレートを1時間置く。細胞が皿に付着したら、新鮮なN2B27培地と1ミリモルルシフェリンを各プレートに2ミリリットル加えます。NPC解離培養でのルシファーゼレポーター発現を可視化するには、油浸性目的を選択し、サンプル皿を顕微鏡ステージに配置します。フィールドを手動で表示して、セルを表示するための最適な位置を決定し、対象のセルに焦点を当てます。[Live] をクリックしてテストイメージを取得し、多次元取得プログラムを使用して、2次元発光によるタイムラプス取得と明視野取得を24時間実行します。皮質スライス培養の開発を準備するために、レポーター注射の翌日、実証されたように胚の日13.5〜14.5胚の脳を収穫し、脳を含む皿を蛍光立体顕微鏡のステージに置く。各皮質が適切な励起光の下で注入された蛍光レポーターを発現していることを確認し、脳をDMEM/F12培地の30ミリリットルで満たされたシリコーンゴム製まな板に移し、100%酸素ガスで泡立たせた。マイクロ外科用ナイフと細かい鉗子を使用して、内側と内側のテラル脳管の部分の境界を切断し、組織を2つの半球に分離する。その後、ナイフを使用してストライプのような皮質を切断して皮質スライスを得て、取得した新しい35ミリメートルのペトリ皿にまな板から媒体でスライスを移します。すべてのスライスが収集されたら、各スライスのカット面を、濃縮された媒体を含むガラス底皿にセットされた培養インサートに置き、必要に応じて細かい鉗子で各スライスの向きを調整します。その後、ピペットで余分な培地を取り除き、40%酸素、5%の二酸化炭素、37°Cに設定したマルチガスインキュベーターに30分間皿を入れます。インキュベーションの終わりに、培養皿に1ミリモルルシフェリンを添加した濃縮培地300マイクロリットルを加える。スライス培養物内のルシファーゼレポーターの発現を可視化するには、目的40xを選択し、サンプル皿を顕微鏡ステージに配置します。蛍光の試験画像を取得し、適切な励起光の照射下で対象領域に位置と焦点面を設定する。次いで、3次元発光、蛍光、および明視野取得によるタイムラプス取得を24時間実行する。振動遺伝子Dll1のプロモーター活性をモニタリングするために、ユビキチン化ルシファーゼ、約10分の半減期を有する不安定化したルシファーゼレポーターを、使用することができる。蛍光レポーターと同様に、ルシファーゼレポーターは、目的の遺伝子コード配列に融合させることによってタンパク質の発現ダイナミクスを監視するために使用することができる。組織培養における単細胞レベルでレポーター発現を可視化するために、レポーター遺伝子は、示されるように子宮エレクトロポレーションを介してNPCに一時的にトランスフェクトすることができる。さらに、顕微鏡ベースのイメージングにより、明視野、蛍光、化学発光画像の取得が可能になります。Dll1プロモーター活性のレポーターは、Dll1ユビキチン化Fルシファーゼレセレポーターマウスのテレンセバロンに由来するNPCにおける振動発現を示し、不安定化したルシファーゼレポーターはプロモーター活性の発現の急激な上下調節を示す。観察中に互いに接触したHes1レポーターとmCherry陽性細胞とDll1タンパクレポーターを発現する隣接する強化された緑色蛍光タンパク質陽性細胞では、Hes1レポーター発現は接触後約60分開始するように見え、隣接する細胞間のノッチシグナル伝達の伝達に対する時間遅延が約1時間であることを示唆している。さらに、シグナル伝達の間、Dll1タンパク質発現は動的転座を示す。生物発光イメージングを取得する際には、余分な光が最適な取得を防ぐことができるように、顕微鏡室を完全に暗く保ちます。光遺伝学の最近の発展は、光で遺伝子発現を制御することを可能にします。この技術により、遺伝子発現のさまざまなパターンを同時に導入し、ルシファーゼレポーターの反応を監視することができます。

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Unit 1

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SCIENTISTS IN ACTION

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Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

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