Name: real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis
Uploaded: 2019-12-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis at JoVE.com

이와모토 유미코에게 동영상 제작을 지원해 주신 것에 대해 감사드립니다. 또한 이미지 분석의 논의와 지원에 대한 이소무라 아키히로, 형질전환 동물 생성을 위한 기술 지원을 위한 미야치 히토시, 신조 유지(올림푸스 의학), 에가와 마사토시(올림푸스 의학), 이시즈 다쿠야() 올림푸스 의학)과 우인 쿠니타키(Andor Japan)는 생물 발광 이미징 시스템의 기술 지원 및 논의를 위해 이 작품은 진화 과학 기술에 대한 핵심 연구에 의해 지원되었다 (JPMJCR12W2) (R.K.), 혁신적인 영역에 대한 과학 연구를위한 보조금 에이드 (MEXT 24116705 H.S. 및 MEXT 16H06480 R.K.에 대한), 과학 연구를위한 보조금 지원 (C) (JPSPs) 18K06254) (H.S.), 다케다 재단 (R.K. 및 H.S.), 그리고 교육, 문화, 스포츠, 과학 기술, 일본에서 생활 시스템에 대한 동적 접근을위한 플랫폼.

동물 과목을 포함한 모든 절차는 교토 대학 프론티어 생명 의학 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 생물 발광 기자
참고: 루시퍼라제 리포터는 분해 신호를 융합하여 프로모터 활성의 급속한 역학을 측정하는데 적합합니다. 더욱이, 루시퍼라제 융합 리포터는 단일 세포내의 단백질 역학을 모니터링할 수 있게 한다. 두 유형의 ...

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	<li>Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+factors+in+cortical+development.">Basic helix-loop-helix factors in cortical development.</a> Neuron. 39, 13-25 (2003).</li><li>Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+reporter+for+dual+luciferase+imaging+in+living+animals.">NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals.</a> Molecular Imaging. 12, (2013).</li></ol>

노치 시그널링의 구성 요소는 소미토 발생 시 동기화시 진동 발현을 나타내지만 신경 발생 시 동기화되지 않은 것으로 나타나며, 후자의 경우 정적 분석에 의한 발현 역학을 포착하는 데 어려움을 초래합니다. 따라서, 실시간 모니터링은 Hes1 및 Dll1과같은 노치 신호 구성 요소의 발현 역학을 밝히기 위해 요구된다. Hes1 및 Dll1 진동의 발현 기간이 매우 짧기 때문에 약 2-3?...

포유류 뇌는 다양한 유형의 뉴런 및 신경교 세포로 구성되어 있습니다. 모든 세포는 신경 줄기 / 전구 세포 (NPC)에서 생성되며, 이는 먼저 그 수를 확장하기 위해 증식한 다음 뉴런으로 분화하기 시작하고 마지막으로 신경교세포1,2,3,4,5를발생시다. 일단 세포가 뉴런으로 분화되면, 그(것)들은 증식하거나 그들의 수를 증가할 수 없고, 그러므로, 나중 단계까지 NPC의 유지보수가 중요합니다. 세포-세포 상호 작용을 통한 노치 신호는 NPC6,7을유지하는 데 중요한 역할을 한다. 노치 리간드막 단백질, 노치, 이웃 세포의 표면에 상호 작용하고 노치 단백질을 활성화합니다. 활성화 후, 노치 단백질의 단백질 해가 발생하여 세포막에서 노치 (NICD)의 세포 내 도메인을 핵8,9,10으로방출합니다. 핵에서 NICD는 Hes1 및 Hes5 (Hes1/5)의프로모터 영역에 결합하고 이러한 유전자의 발현을 활성화합니다. Hes1/5 는 신경성 유전자 Ascl1 및 Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14의발현을 억압한다. 신경성 유전자는 신경 분화를 유도하기 때문에 Hes1/5는 NPC 를 유지하는 데 필수적인 역할을 합니다. 더욱이, 신경성 유전자가 노치 리간드 델타유사1(Dll1)의 발현을 활성화시킬 수 있기 때문에, Hes1/5는 또한 Dll1의발현을 억압한다. 따라서, Dll1의 발현은 노치 시그널링을 통해 Dll1에 대해 음수인 인접 세포를 이끈다. 이와 같이, 세포는 인접한 세포가 동일한 운명을 따르는 것을 억제하며, 횡식 억제8로알려진 현상이다. 개발 뇌에서, 측면 억제 다양 한 다른 세포 종류를 생성하는 역할을 한다.
단일 셀 수준에서 실시간 이미징은 NPC15,16,17에서노치 시그널링 성분의 동적 발현을 보여줍니다. 노치 시그널링은 Hes1의발현을 활성화하지만 Hes1 단백질은 자체 프로모터에 결합하고 자체 발현을 억압합니다. 또한, Hes1은 매우 불안정한 단백질이며, 유비퀴틴-프로테아좀 통로에 의해 분해됩니다. 따라서, 자신의 프로모터의 억압은 단지 짧은 수명이고 그 다음에 전사가 다시 시작된다. 이와 같은 방식으로, Hes1의 발현은 2시간주기(18)에서전사 및 번역 수준 모두에서 진동한다. Hes1의 진동 발현은, 차례로, 주기적인 억압을 통해 Ascl1, Neurog2, 및 Dll1과 같은 하류 표적 유전자의 발진 발현을 유도한다15,16,17,19. 신경성 유전자는 신경 분화를 유도할 수 있지만, 그들의 진동 발현은 신경 분화를 위해 충분하지 않습니다; 오히려 그들의 지속적인 된 표현은 신경 분화에 필수적이다. 신경성 유전자의 진동 발현은 신경 분화 유도보다는 NPC 유지에 중요하다14,15,16. Dll1의 발현은 신경 발생 및 소미토발생과 같은 다양한 형태 발생 동안 전사 및 번역 수준 모두에서 진동한다. Dll1의 동적 발현은 정상적인 형태 형성및 Dll1의 꾸준한 발현에 중요하며 신경발생 및 소미토제네시스(17)의 결함을 유도한다. 이 사실 인정은 유전자 발현과 단백질 역학의 역학이 각종 발달 사건의 규칙에 있다는 중요한 기능을 보여줍니다 (즉, 다른 발현 역학은 세포 행동에서 다른 출력을 생성합니다).
노치 시그널링의 역학을 분석하기 위해 조직과 세포의 정적 분석은 끊임없이 변화하기 때문에 충분하지 않습니다. 단일 세포의 실시간 이미징은 유전자 발현의 역학을 밝히는 강력한 도구입니다. 노치 신호 분자의 동적 발현은 2-3 시간 의 기간에 급속한 순환 반응을 겪습니다. 이러한 빠른 주기적 발현은 실시간 모니터링을 위한 두 가지 어려운 문제를 제시한다: (1) 분자의 발현이 낮은 수준으로 억제되고, (2) 빠른 회전율은 빠른 응답 리포터가 필요하다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 우리는 이전에 생물 발광 실시간 이미징 방법20을개발하였다. 생물 발광 리포터는 형광 리포터보다 더 높은 감도와 짧은 성숙 시간을 가지고 있기 때문에,이 전략은 우리가 살아있는 세포의 급속한 역학을 모니터링 할 수 있습니다. 실시간 시각화를 사용하여, 우리는 더 많은 유전자가 우리가 이전에 생각했던 것보다 동적 발현을 나타낸다는 것을 것을을 발견했습니다. 또한, 살아있는 세포에서발현 및 단백질 역학을 나타내는 보고의 수와 다양한 생물학적 사건에서 이러한 역학의 중요성이 증가하고, 유전자 발현에서역학의 근본적인 역할을 시사하는21,22.
이 보고서에서는 해리된 배양물과 피질 슬라이스 배양물 모두에서 NPC에서 노치 리간드 Dll1의 표현을 시각화하는 방법을 설명합니다. 단일 세포 수준에서 Dll1 전사의 역학을 모니터링하기 위해, 우리는 pDll1-Ub-Fluc 리포터를 운반하는 형질전환 마우스의 배아 텔렌살론에서 유래한 NPC의 해리된 배양을 생성했습니다, Dll1 프로모터 구동 불안정성 luciferase 기자. 생체 내에서 Dll1 단백질 역학을 모니터링하기 위해 Dll1-Fluc 융합 리포터를 피질 내 NPC에 도입하고 피질 슬라이스 배양에서 NPC에서 리포터의 표정을 시각화했습니다. 실시간 화상 진찰은 높은 시간 해결책에 살아있는 세포에 있는 유전자 발현 그리고 단백질 역학의 각종 특징을 붙잡을 수 있었습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioluminescence Imaging System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled water circulator (chiller)</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>Model: F12-ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Model: iKon-M 934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>Model: INU-ONICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination device</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>Model: pE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td>Model: 40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix gas controller</td>
			<td>Tokken</td>
			<td>Model: TK-MIGM OLO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: UPLFLN 40X O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Model: SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for NPC dissociation culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock solution: 1 &#956;g/ml in 0.1% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01493-85</td>
			<td>Stock solution: 100mM in 0.9% saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003172</td>
			<td>Stock solution: 1000U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cystein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003178</td>
			<td>Stock solution: 7U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptmycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6281</td>
			<td>40 mg/ml in DW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for in utero electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>181228T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>7-mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>CUY21 EDIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauzes</td>
			<td>Kawamoto co.</td>
			<td>7161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro capillary</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentbarbital</td>
			<td>Kyoritsuseiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needle</td>
			<td>Akiyama MEDICAL MFG. CO</td>
			<td>F17-40B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Seractal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Slice culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro surgical knife</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>19 Gauge V-Lance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5MUV-PJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2/B27 media</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>ref. NPC dissociatioin culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber cutting board</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis

노치 신호는 세포-세포 상호 작용에 의해 신경 줄기/전구 세포의 유지 를 조절합니다. 노치 시그널링의 구성 요소는 동적 표현을 나타낸다. 노치 시그널링 이펙터 Hes1 및 노치 리간드 델타 유사1(Dll1)은 신경 줄기/전구 세포에서 진동 방식으로 발현된다. 이들 유전자의 진동 발현 기간이 매우 짧기 때문에(2시간), 그들의 순환 발현을 모니터링하기가 어렵다. 유전자 발현 또는 단백질 역학의 이러한 급격한 변화를 검토하기 위해서는 빠른 반응 리포터가 필요합니다. 그것의 빠른 성숙 역학 및 높은 감도 때문에, 생물 발광 리포터 luciferase는 살아있는 세포에 있는 급속한 유전자 발현 변경을 감시하기 위하여 적당합니다. 우리는 단세포 분해능에서 단백질 역학의 시각화를 위해 프로모터 활성을 모니터링하기 위해 불안정한 루시퍼라제 리포터와 루시퍼라제 융합 리포터를 사용했습니다. 이러한 생물 발광 리포터는 빠른 회전율을 보여주고 매우 약한 신호를 생성합니다. 따라서, 우리는 그러한 희미한 신호를 검출하기 위해 매우 민감한 생물 발광 이미징 시스템을 개발했습니다. 이 방법을 사용하면 실제 세포 상태를 이해하는 데 도움이되는 중요한 정보인 살아있는 세포 및 조직에서 다양한 유전자 발현 역학을 모니터링 할 수 있습니다.

Hes1/7 유전자의 발현은 다양한 세포주 및 소미토제네시스 동안2시간 진동 주기를 나타낸다. 게다가, 진동의 기간은 아주 짧고 그들의 mRNAs와 단백질 둘 다 약 20 분의 반감기와 극단적으로 불안정합니다. 느린 반응 리포터를 사용하는 경우, 우리는 이러한 급속한 역학을 추적 할 수 없으며, 안정적인 리포터를 사용하는 경우, 유전자 발현이 진동하는 동안 점차적으로 축적됩니다. 따라서, 리포...

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Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

신경 줄기/전구 세포는 세포 이벤트의 다른 결과로 이끌어 내는 노치 신호 분대의 각종 표현 역학을 전시합니다. 이러한 동적 발현은 유전자 발현의 급격한 변화를 시각화할 수 있는 매우 민감한 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 정적 분석이 아닌 실시간 모니터링을 통해 밝혀질 수 있습니다.

뮤린 신경 발생 시 노치 신호 역학의 실시간 생물 발광 이미징

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

이 방법은 세포 증식 및 분화에서 유전자 발현 역학의 중요성, 특히 신경 줄기 세포에서 노치 신호 분자의 역학에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 살아있는 화상 진찰에 의하여 아주 높은 정밀도로 시험관 내 및 생체 내 둘 다 유전자 발현을 감시할 수 있다는 것입니다. 이 새로운 기술을 개발한 실험실의 조교수 인 시모조 히로미(Hiromi Shimojo)가 절차를 시연할 것입니다.Dll1 F luciferase 기자 소개NPC에 대 한, 배아 날에 페달 반사에 응답의 부족을 확인 12.5 받는 사람 14.5 임신 마우스 를 통해 2-3 센티미터 절개를 하기 전에, 중간 라인을 따라. PBS에 흠뻑 젖은 거즈를 절개 주위에 놓고 링 모양의 집게를 사용하여 오른쪽 자궁 경적을 조심스럽게 추출합니다. 배아를 계산한 후, 마이크로 모세관을 사용하여 혼합 Dll1 F 루시파라제 기자 DNA의 1~2개의 마이크로리터를 각 배아의 텔렌세팔론 심실에 주입한다.성공적인 주사는 자궁 의 표면에 파란 염료의 준수 귀착될 것입니다. 전기화의 경우, 자궁과 전극을 PBS로 적시고 첫 번째 배아의 머리를 부드럽게 잡습니다. DNA가 주입된 반구의 측면에 양전하 전극을 설정하고, 펄스 사이에 1초 동안 일시 정지하여 5개의 30-50볼트, 50밀리초 펄스를 제공하여 음전하 전극에서 거품이 생성되는지 확인합니다.모든 배아가 주입되면 왼쪽 자궁 경적을 복부에 반환하고 17mm 바늘을 사용하여 4-0 실크 봉합사로 절개를 닫고 폐쇄를 완료하기 전에 복강에 따뜻한 PBS를 배치합니다. 해리된 NPC 배양을 설정하려면, 먼저 배아일 12.5에서 14.5 임신 Dll1 유비쿼터트 루시포제 형 균질 마우스를 얼음 차가운 PBS의 25 밀리리터를 포함하는 10 센티미터 페트리 접시에 넣고 마이크로 가위및 미세 한 힘을 사용하여 배아로부터 배아를 제거합니다. 배아를 참수한 후, 얼음 차가운 DMEM/F12를 포함하는 새로운 10센티미터 페트리 접시에 머리를 놓고 각 뇌를 둘러싼 표피와 연골을 제거합니다.얼음 차가운 N2B27 배지의 3 밀리리터를 포함하는 해부 현미경의 밑에 35 밀리미터 접시로 두뇌를 전송합니다. 디엔셀론에서 오른쪽 및 왼쪽 텔렌실론을 제거합니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 텔렌스팔론의 표면을 덮고 수막을 제거 하 고 텔 렌 스 펠 론에서 피 질의 등 측 부분을 해부.관심있는 신경 조직의 모든 격리 된 경우, 개별 1.5 밀리리터 튜브로 샘플을 전송P1000 파이펫을 사용하고, 각 튜브에서 여분의 매체를 흡인P200 파이펫을 사용합니다. 피질 쌍당 100 마이크로리터의 파아플 용액을 추가하고 샘플을 섭씨 24도에서 15분 동안 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 새로운 P1000 파이펫으로 샘플을 10번 부드럽게 피펫하고 튜브를 섭씨 24도로 추가로 15분 간 반환합니다.인큐베이션의 끝에서 원심 분리에 의해 소화된 조직을 수집하기 전에 샘플을 부드럽게 피펫합니다. 수퍼넌트들을 흡인시키고, DMEM/F12 배지 1밀리리터로 각 펠릿을 부드럽게 재분리합니다. 원심분리는 시료를 단지 시연한 대로 3배 더, 각 환원 분리 후 신선한 밀리리터로 부드럽게 재연합니다.마지막 원심 분리 후, 1 밀리머 루시페린으로 보충된 N2B27 배지의 500 마이크로리터에서 펠릿을 재보중단하고, 각 샘플에서 6개의 세포로 10번 시드를 개별 폴리 L-L-리신 코팅 유리 바닥 접시에 뿌린다. 그런 다음, 1 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다. 세포가 접시에 부착되면, 신선한 N2B27 배지의 두 밀리리터플러스 각 접시에 1 밀리머 루시피린을 추가합니다.NPC 해리 배양에서 루시파라제 기자 발현을 시각화하려면 오일 침지 목표를 선택하고 샘플 접시를 현미경 단계에 배치합니다. 필드를 수동으로 보고 셀을 볼 수 있는 최상의 위치를 결정하고 관심 있는 셀에 집중합니다. 라이브를 클릭하여 테스트 이미지를 획득하고 다차원 획득 프로그램을 사용하여 2차원 발광 및 밝은 필드 획득을 통해 2차원 발광 및 밝은 필드 획득을 24시간 동안 실행합니다.피질 슬라이스 배양 개발을 준비하기 위해, 기자 주사 후 하루, 배아 일 13.5 받는 사람 14.5 배아 뇌를 수확하여, 형광 입체 현미경의 단계에 뇌를 함유 한 접시를 놓는다. 각 피질이 적절한 흥분 광 하에서 주입 된 형광 기자를 표현하고 뇌를 DMEM / F12 배지30 밀리리터로 채워진 실리콘 고무 도마로 옮기고 100 % 산소 가스로 거품을 낸지 확인하십시오. 마이크로 수술 칼과 미세 집게를 사용하여 등간 텔뇌스팔론의 내측과 측면 부분 사이의 경계를 절단하고 조직을 두 반구로 분리하십시오.그런 다음 칼을 사용하여 줄무늬와 같은 피질을 자르고 피질 조각을 얻고, 도마에서 중간 크기의 슬라이스를 새로운 35mm 페트리 접시로 옮기는 것입니다. 모든 슬라이스가 수집되면 각 슬라이스의 절단 표면을 농축 된 매체가 들어있는 유리 바닥 접시에 세팅 된 배양 인서치에 놓고 필요에 따라 각 슬라이스의 방향을 미세 한 집게로 조정합니다. 그런 다음 파이펫으로 초과 매체를 제거하고 접시를 40% 산소, 5%이산화탄소, 섭씨 37도로 설정된 다중 가스 인큐베이터에 30분 동안 배치합니다.인큐베이션이 끝나면 300마이크로리터의 농축 된 매체를 문화 요리에 1 밀리머 루시피린으로 보충합니다. 슬라이스 배양 내에서 루시파라제 기자 발현을 시각화하려면 40배 목표를 선택하고 샘플 접시를 현미경 단계에 배치한다. 형광의 시험 영상을 획득하고, 적절한 흥분광의 조명 아래 관심 영역으로 위치 및 초점 평면을 설정합니다.그런 다음 24시간 동안 3차원 발광, 형광 및 밝은 필드 인수를 통해 시간 경과 획득을 실행합니다. 진동 유전자 Dll1의 프로모터 활성을 모니터링하기 위해, 약 10분의 반감기를 가진 불안정한 루시파라제 기자인 유비퀴티드 루시파라제(luciferase)를 사용할 수 있다. 형광 기자처럼, 루시파라제 리포터는 관심의 유전자 코딩 서열에 융합됨으로써 단백질의 발현 역학을 모니터링하는 데 사용될 수 있다.조직 배양에서 단세포 수준에서 기자 발현을 시각화하기 위해, 리포터 유전자는 입증된 바와 같이 자궁 전기기화를 통해 NPC로 일시적으로 전환될 수 있다. 또한 현미경 기반 이미징을 통해 밝은 분야, 형광 및 화학 발광 이미지를 습득할 수 있습니다. Dll1 프로모터 활동의 리포터는 Dll1 유비퀴티드 F 루시프라아제 기자 마우스의 텔렌세팔론에서 파생된 NPC에서 진동표현을 나타내며, 불안정한 루시프라아제 리포터는 프로모터 활동의 발현에 대한 급격한 상하 조절을 나타낸다.관찰 과정에서 서로 접촉한 Dll1 단백질 리포터를 발현하는 Hes1 기자 및 mCherry 양성 세포를 운반하는 인접한 향상된 녹색 형광 단백질 양성 세포에서 Hes1 기자 발현은 접촉 후 약 60분 후에 시작되는 것으로 보이며, 인접한 세포 들 간의 노치 시그널링 전송시시간 지연이 약 1시간임을 시사한다. 더욱이, 신호 전송 도중, Dll1 단백질 발현은 동적 전좌를 나타낸다. 생물 발광 이미징을 습득 할 때, 외부 빛이 최적의 획득을 방지 할 수 있기 때문에 현미경 실을 완전히 어둡게 유지하십시오.광유전학에 있는 최근 발달은 우리가 빛으로 유전자 발현을 통제할 수 있습니다. 이 기술을 통해 다양한 유전자 발현 패턴을 동시에 도입하고 루시파라제 리포터 반응을 모니터링할 수 있습니다.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Developmental Biology

Unit 2

Unit 1

Cell Signaling Pathways

Alternative Signaling Routes in Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

실시 항공의 패터닝 동안 Wnt 신호를 공부

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

연구

발생학

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

체세포 재 프로그래밍의 운동 측정 및 실시간 시각화

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

P19 배아 암종을 이용한 신경 발생

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...