Name: real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis
Uploaded: 2019-12-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis at JoVE.com

Vi takker Yumiko Iwamoto for å støtte produksjonen av videoen. Vi er også takknemlige for Akihiro Isomura for diskusjon og støtte av bildeanalyse, Hitoshi Bramidan for teknisk støtte for generering av transgene dyr, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Sangchul Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) og Ouin Kunitaki (Andor Japan) for teknisk støtte og diskusjoner av bioluminesens Imaging system. Dette arbeidet ble støttet av Core Research for evolusjonære Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på innovative områder (MEXT 24116705 for H.S. og MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (C) (JSP 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. og H.S.), og plattform for dynamiske tilnærminger til Living system fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan.

Alle fremgangsmåten inkluderer dyr emner ha blitt anerkjent av institusjonell dyr bekymre og bruk komité for det off for Frontier livet og legeundersøkelse vitenskap, Kyoto universitet.
1. bioluminesens journalister
Merk: luciferase reporter er egnet for å måle den raske dynamikken i promoter aktivitet ved å smelte ned brytnings signalet. Videre muliggjør luciferase Fusion reporter overvåking av protein dynamikk i enkelt celle. Begge typer journalister er tilg...

<ol>
	<li>Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+factors+in+cortical+development.">Basic helix-loop-helix factors in cortical development.</a> Neuron. 39, 13-25 (2003).</li><li>Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+intermediate+progenitor+cells+in+cerebral+cortex+development.">Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development.</a> Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li><li>Paridaen, J. T., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+during+development+of+the+vertebrate+central+nervous+system.">Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system.</a> EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).</li><li>Taverna, E., G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+vertebrate+neural+development.">Notch signaling in vertebrate neural development.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).</li><li>Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+in+the+Vertebrate+Nervous+System:+An+Old+Dog+with+New+Tricks.">Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks.</a> Neuron. 69, 840-855 (2011).</li><li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling:+a+simple+pathway+becomes+complex.">Notch signalling: a simple pathway becomes complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).</li><li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+in+context.">Notch signalling in context.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Canonical+Notch+Signaling+Pathway:+Unfolding+the+Activation+Mechanism.">The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism.</a> Cell. 137, 216-233 (2009).</li><li>Ishibashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+helix-loop-helix+factor+HES-1+prevents+mammalian+neural+differentiation+in+the+central+nervous+system.">Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system.</a> The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).</li><li>Ohtsuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hes1+and+Hes5+as+notch+effectors+in+mammalian+neuronal+differentiation.">Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation.</a> The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).</li><li>Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Basic+Helix-Loop-Helix+Genes+Hes1+and+Hes5+in+Expansion+of+Neural+Stem+Cells+of+the+Developing+Brain.">Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).</li><li>Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hes+gene+family:+repressors+and+oscillators+that+orchestrate+embryogenesis.">The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis.</a> Development. 134, 1243-1251 (2007).</li><li>Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+in+Notch+Signaling+Regulate+Maintenance+of+Neural+Progenitors.">Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors.</a> Neuron. 58, 52-64 (2008).</li><li>Imayoshi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors.">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li><li>Shimojo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis.">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes and Development. 30, 102-116 (2016).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+expression+of+the+bHLH+factor+Hes1+regulated+by+a+negative+feedback+loop.">Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.</a> Science. 298, 840-843 (2002).</li><li>Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Notch+signaling+in+neural+progenitor+cells+and+a+revised+view+of+lateral+inhibition.">Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition.</a> Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+pulsing+in+genetic+circuits.">Functional roles of pulsing in genetic circuits.</a> Science. 342, 1193-1200 (2013).</li><li>Purvis, J. E., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+decoding+cellular+information+through+signaling+dynamics.">Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics.</a> Cell. 152, 945-956 (2013).</li><li>Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+26S+proteasome+activity+and+inhibition+in+living+mice.">Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice.</a> Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).</li><li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Cellular+Clocks+in+the+Suprachiasmatic+Nucleus.">Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus.</a> Science. 302, 1408-1412 (2003).</li><li>Kiyohara, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMAL1+C+terminus+regulates+the+circadian+transcription+feedback+loop.">The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).</li><li>Behar, M., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+temporal+codes+of+intra-cellular+signals.">Understanding the temporal codes of intra-cellular signals.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Gene+Expression+in+a+Single+Cell.">Stochastic Gene Expression in a Single Cell.</a> Science. 297, 1183-1186 (2002).</li><li>Nelson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+in+NF-kappaB+signaling+control+the+dynamics+of+gene+expression.">Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression.</a> Science. 306, 704-708 (2004).</li><li>Purvis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+dynamics+control+cell+fate.">p53 dynamics control cell fate.</a> Science. 336, 1440-1444 (2012).</li><li>Hansen, A. S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+decoding+of+transcription+factor+dynamics+involves+a+trade-off+between+noise+and+control+of+gene+expression.">Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression.</a> Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).</li><li>Hansen, A. S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+Determinants+of+Promoter+Threshold+and+Activation+Timescale.">cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale.</a> Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).</li><li>Johnson, H. E., Toettcher, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Dynamics+Control+Cell+Fate+in+the+Early+Drosophila+Embryo.">Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+Progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: Progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Nakajima, Y., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+assays:+multicolor+luciferase+assay,+secreted+luciferase+assay+and+imaging+luciferase+assay.">Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).</li><li>Nakajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+beetle+luciferase+for+high-resolution+bioluminescence+imaging.">Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Stacer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+reporter+for+dual+luciferase+imaging+in+living+animals.">NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals.</a> Molecular Imaging. 12, (2013).</li></ol>

Komponentene i notch signalering viser oscillasjon uttrykk i Synchrony under somitogenesis men ut av Synchrony under neurogenesis, fører til vanskeligheter i å fange uttrykket dynamikk ved statisk analyse i sistnevnte tilfelle. Således, virkelig-tid avlytting er krevde å avsløre uttrykket dynamikken av hakk signalering komponentene, som Hes1 og Dll1. Fordi periodene i uttrykkene for Hes1 og Dll1 svingninger er ekstremt korte, er omtrent 2-3 h, rask respons og ustabile journalister...

Pattedyr hjernen består av et stort antall ulike typer neurons og gliacellene celler. Alle celler er generert fra neural Stem/stamceller (NPCer), som først sprer seg for å utvide sine tall, og deretter begynne å differensiere til neurons, og til slutt gi opphav til gliacellene celler1,2,3,4,5. Når cellene har differensiert inn i neurons, kan de ikke sprer eller øke sine tall, og derfor vedlikehold av NPCer til senere stadier er viktig. Hakk signalering via celle-celle interaksjoner spiller en viktig rolle i å opprettholde NPCer6,7. Notch ligander samhandle med membran protein, notch, på overflaten av nærliggende celler og aktiverer notch protein. Etter aktivering, proteinolyse av hakk protein oppstår, og dermed slippe intracellulære domene av hakk (NICD) fra cellemembranen i kjernen8,9,10. I kjernen, binder NICD til arrangøren regionene Hes1 og Hes5 (Hes1/5) og aktiverer uttrykk for disse genene. Hes1/5 undertrykke uttrykk for proneural gener Ascl1 og Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Fordi proneural gener induserer neuronal differensiering, Hes1/5 spille viktige roller i å opprettholde NPCer. Videre, som proneural gener kan aktivere uttrykket av notch ligand delta-like1 (Dll1), Hes1/5 også undertrykke uttrykk for Dll1. Derfor, uttrykk for Dll1 fører til nærliggende celler blir negativt for Dll1 via notch signalering. På denne måten cellene hemme tilstøtende celler fra å følge deres samme skjebne, et fenomen som kalles lateral hemming8. I den utviklende hjernen, lateral hemming spiller en rolle i å generere ulike celletyper.
Real-Time Imaging på enkelt cellenivå avslører dynamiske uttrykk for komponentene i hakk signalering i NPCer15,16,17. Notch signalering aktiverer uttrykk for Hes1, men Hes1 protein binder seg til sin egen promoter og fortrenger sitt eget uttrykk. Videre er Hes1 en ekstremt ustabil protein, som er degradert av ubiquitin-proteasomet veien; Derfor er undertrykkelse av sin egen promoter bare kortvarig og deretter transkripsjon starter igjen. På denne måten uttrykket av Hes1 svinger på både transkripsjon og translational nivåer i en 2 h syklus18. Den oscillasjon uttrykk for Hes1, i sin tur induserer oscillasjon uttrykk for nedstrøms mål gener, for eksempel Ascl1, Neurog2, og Dll1, via periodisk undertrykkelse15,16,17,19. Mens proneural gener kan indusere neuronal differensiering, er deres oscillasjon uttrykk ikke tilstrekkelig for neuronal differensiering; snarere deres vedvarende uttrykk er avgjørende for neuronal differensiering. Den oscillasjon uttrykk for proneural gener er viktig for å opprettholde NPCer snarere enn for inducing neuronal differensiering14,15,16. Uttrykket av Dll1 svinger på både transkripsjon og translational nivåer under ulike morphogenesis, slik som neurogenesis og somitogenesis. Den dynamiske uttrykk for Dll1 er viktig for normal morphogenesis og jevn uttrykk for Dll1 medfører defekter i neurogenesis og somitogenesis17. Disse funnene viser den viktige funksjonen som dynamikken i genet uttrykk og protein Kinetics har på regulering av ulike utviklingsmessige hendelser (dvs. ulike uttrykk dynamikk produsere ulike utganger i cellulære atferd).
Å analysere dynamikken i notch signalering, den statiske analyse av vev og celler er utilstrekkelig fordi de er i stadig endring. Real-Time Imaging av enkeltceller er et kraftig verktøy for å avdekke dynamikken i genet uttrykk. Den dynamiske uttrykk for notch signalering molekyler gjennomgår rask syklisk svar i perioden 2-3 h. Dette raske periodiske uttrykket presenterer to vanskelige problemer for sanntids overvåking: (1) uttrykket av molekylene er undertrykt til lave nivåer, og (2) rask omsetning krever rask respons journalister. For å overkomme disse problemene, har vi tidligere utviklet en bioluminesens sann tids avbildnings metode20. Fordi bioluminesens reporteren har en høyere følsomhet og kortere modningstid enn fluorescerende journalister, gjør denne strategien oss til å overvåke den raske dynamikken i levende celler. Ved hjelp av sanntids visualisering, fant vi ut at flere gener utstilt dynamiske uttrykk enn vi tidligere hadde trodd. I tillegg har antall rapporter som viser uttrykk og protein dynamikk i levende celler og betydningen av disse dynamikken i ulike biologiske hendelser økt, noe som tyder på en fundamental rolle av dynamikken i genuttrykk21,22.
I denne rapporten beskriver vi en måte å visualisere uttrykket av notch ligand Dll1 i NPCer i både dissosiert kulturer og i kortikale Slice kulturer. For å overvåke dynamikken i Dll1 transkripsjon på enkelt celle nivåer, genererte vi dissosiert kulturer av NPCer avledet fra den embryonale Telencephalon av transgene mus bærer PDll1-UB-svingninger reporter, en Dll1 promoter-drevet destabilisert luciferase reporter. For å overvåke Dll1 protein dynamikk in vivo introduserte vi Dll1-svingninger fusjons reporter til NPCer i cortex og visualisere uttrykket av reporteren i NPCer i kortikale skive kulturer. Real-Time Imaging aktivert oss å fange de ulike funksjonene i genuttrykk og protein dynamikk i levende celler ved høy Temporal oppløsning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioluminescence Imaging System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled water circulator (chiller)</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>Model: F12-ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Model: iKon-M 934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>Model: INU-ONICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination device</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>Model: pE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td>Model: 40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix gas controller</td>
			<td>Tokken</td>
			<td>Model: TK-MIGM OLO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: UPLFLN 40X O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Model: SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for NPC dissociation culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock solution: 1 &#956;g/ml in 0.1% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01493-85</td>
			<td>Stock solution: 100mM in 0.9% saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003172</td>
			<td>Stock solution: 1000U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cystein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003178</td>
			<td>Stock solution: 7U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptmycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6281</td>
			<td>40 mg/ml in DW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for in utero electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>181228T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>7-mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>CUY21 EDIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauzes</td>
			<td>Kawamoto co.</td>
			<td>7161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro capillary</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentbarbital</td>
			<td>Kyoritsuseiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needle</td>
			<td>Akiyama MEDICAL MFG. CO</td>
			<td>F17-40B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Seractal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Slice culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro surgical knife</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>19 Gauge V-Lance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5MUV-PJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2/B27 media</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>ref. NPC dissociatioin culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber cutting board</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis

Notch signalering regulerer vedlikehold av Neural Stem/stamceller ved celle-celle interaksjoner. Komponentene i notch signaliserer viser dynamisk uttrykk. Notch signalering effektor Hes1 og notch ligand delta-like1 (Dll1) uttrykkes på en oscillasjon måte i neural Stem/stamceller. Fordi perioden av oscillasjon uttrykk for disse genene er svært kort (2 h), er det vanskelig å overvåke deres sykliske uttrykk. For å undersøke slike raske endringer i genuttrykk eller protein dynamikk, er rask respons journalister nødvendig. På grunn av sin raske modning Kinetics og høy følsomhet, den bioluminesens reporter luciferase er egnet til å overvåke raske genuttrykk endringer i levende celler. Vi brukte en destabilisert luciferase reporter for overvåking arrangøren aktivitet og en luciferase-smeltet reporter for visualisering av protein dynamikk på én celle oppløsning. Disse bioluminesens journalistene viser rask omsetning og genererer svært svake signaler; Derfor har vi utviklet et svært følsomt bioluminesens bildesystem for å oppdage slike svake signaler. Disse metodene gjør oss i stand til å overvåke ulike genuttrykk dynamikk i levende celler og vev, som er viktig informasjon for å hjelpe forstå den faktiske cellulære stater.

Uttrykk av genene Hes1/7 Exhibit 2 h pendling syklus i ulike cellelinjer og under somitogenesis. Videre er perioden med pendling svært kort og både deres mRNAs og proteiner er ekstremt ustabile med halv livene til rundt 20 min. Hvis du bruker en langsom respons reporter, kan vi ikke spore slike rask dynamikk, og hvis du bruker en stabil reporter, akkumuleres det gradvis mens genet uttrykket svinger. Dermed må reporteren være raskt degradert til å overvåke den raske omsetningen av slike syklisk uttrykt gene...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis at JoVE.com

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Neural Stem/stamceller viser ulike uttrykk dynamikk av notch signalering komponenter som fører til ulike utfall av cellulære hendelser. Slike dynamiske uttrykk kan avsløres av sanntids overvåking, ikke av statisk analyse, ved hjelp av en svært følsom bioluminesens Imaging system som muliggjør visualisering av raske endringer i genuttrykk.

Real-Time bioluminesens Imaging av hakk signalering dynamikk under murine neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om betydningen av genuttrykksdynamikk i cellespredning og differensiering, spesielt dynamikken i Notch signaliseringmolekyler i nevrale stamceller. Den største fordelen med denne teknikken er at vi kan overvåke genuttrykk både in vitro og in vivo med svært høy presisjon ved levende bildebehandling. Viser prosedyren vil være Hiromi Shimojo, assisterende professor fra mitt laboratorium som utviklet denne nye teknologien.For Dll1 F luciferase reporter introduksjon i NPC, bekrefter mangel på respons på pedalrefleks i en embryonisk dag 12,5 til 14,5 gravid mus før du gjør en to til tre centimeter snitt gjennom magen, langs midtlinjen. Plasser PBS-gjennomvåt gasbind rundt snittet, og bruk ringformede tang for å forsiktig trekke ut høyre livmorhorn. Etter å ha talt embryoene, bruk en mikrokapillær til å injisere en til to mikroliter av blandet Dll1 F luciferase reporter DNA inn i ventrikkelen til telencephalon av hvert embryo.En vellykket injeksjon vil resultere i overholdelse av blått fargestoff over livmorens overflate. For elektroporasjon våt livmoren og elektroden med PBS, og ta forsiktig tak i hodet til det første embryoet. Sett den positivt ladede elektroden på siden av halvkule der DNA-et ble injisert, og gi fem 30-til 50-volts, 50-millisekundpulser, med en ett sekunds pause mellom pulser, og kontrollerer at bobler genereres fra den negativt ladede elektroden.Når alle embryoene er injisert, returnerer du venstre livmorhorn til magen, og bruk en 17-millimeters nål for å lukke snittet med en 4-0 silkesutur, og plasser varm PBS i bukhulen før du fullfører nedleggelsen. For å sette opp en dissosiert NPC kultur, først plassere livmoren fra en embryonisk dag 12,5 til 14,5 gravid Dll1 ubiquitinated luciferase transgen mus i en 10-centimeter Petri skål som inneholder 25 milliliter iskald PBS, og bruke mikro saks og fine tang for å fjerne embryoer fra livmoren. Etter halshugging av embryoene, legg hodene i en ny 10-centimeter petriskål som inneholder iskald DMEM / F12, og fjern epidermis og brusk rundt hver hjerne.Overfør hjernen til en 35-millimeters tallerken under et dissekerende mikroskop som inneholder tre milliliter iskaldt N2B27-medium. Fjern høyre og venstre telencephalon fra diencephalon. Bruk fine tang for å fjerne meningene som dekker overflaten av telencefalon og for å dissekere den dorsolaterale delen av cortex fra telencephalon.Når alle nevrale vev av interesse har blitt isolert, bruk en P1000 pipette for å overføre prøvene til individuelle 1,5-milliliter rør, og bruk en P200 pipette til å aspirere et ekstra medium fra hvert rør. Tilsett 100 mikroliter papainoppløsning per cortex-par, og legg prøvene ved 24 grader Celsius i 15 minutter. På slutten av inkubasjonen pipette forsiktig prøvene 10 ganger med en ny P1000 pipette, og returner rørene til 24 grader Celsius i ytterligere 15 minutter.På slutten av inkubasjonen pipettes prøvene forsiktig igjen før de samler opp det fordøyde vevet ved sentrifugering. Aspirer supernativa, og forsiktig resuspend hver pellet med en milliliter DMEM / F12 medium. Sentrifuger prøvene tre ganger til som nettopp demonstrert, forsiktig resuspending hver pellet med en frisk milliliter medium etter hver sentrifugering.Etter den siste sentrifugeringen, resuspend pellets i 500 mikroliter av N2B27 medium supplert med en millimolar luciferin, og frø en ganger 10 til de seks cellene fra hver prøve på individuelle poly-L-lysinbelagt glass bunnretter. Deretter plasserer platene i cellekulturinkubatoren i en time. Når cellene har holdt seg til parabolen, legg til to milliliter frisk N2B27 medium pluss en millimolar luciferin til hver plate.Hvis du vil visualisere luciferase reporteruttrykk i NPC-dissosiasjonskulturer, velger du oljesenkingsmålet og plasserer prøveretten på mikroskopstadiet. Vis feltet manuelt for å finne den beste plasseringen for visning av cellene, og fokuser på interessecellene. Klikk Live for å hente testbildet, og bruk programmet flerdimensjonalt anskaffelse til å kjøre tidsforløpsinnhentelsen med todimensjonale luminescence- og bright-field-anskaffelse i 24 timer.For å forberede utvikle cortex skive kulturer, en dag etter reporter injeksjon, høste embryonale dag 13,5 til 14,5 embryo hjerner som demonstrert, og plassere parabolen som inneholder hjernen på scenen av en fluorescens stereoskopisk mikroskop. Bekreft at hver cortex uttrykker den injiserte fluorescerende reporteren under riktig eksitasjonslys, og overfør hjernen til et silikongummi skjærebrett fylt med 30 milliliter DMEM / F12 medium, bobler med 100% oksygengass. Bruk en mikro kirurgisk kniv og fine tang for å kutte grensen mellom den mediale og laterale delen av dorsal telencephalon, og skille vevet i to halvkuler.Deretter bruker du kniven til å kutte cortex som striper for å få kortikale skiver, overføre skiver i medium fra skjærebrettet til en ny 35-millimeter Petriskål som de er kjøpt. Når alle skivene er samlet, plasser den kuttede overflaten av hver skive på en kulturinnsats satt inn i en glassbunnsfat som inneholder beriket medium, justere retningen på hver skive med fine tang etter behov. Fjern deretter overflødig medium med en pipette, og legg fatet i en multi-gass inkubator satt til 40% oksygen, 5% karbondioksid og 37 grader Celsius i 30 minutter.På slutten av inkubasjonen, tilsett 300 mikroliter beriket medium supplert med en millimolar luciferin til kulturretten. Hvis du vil visualisere luciferase-reporteruttrykket i skivekulturene, velger du 40x-målet og plasserer prøveretten på mikroskopstadiet. Få et testbilde av fluorescensen, og sett posisjonen og fokusplanet til interesseområdet under belysning av riktig eksitasjonslys.Deretter kjører du time-lapse oppkjøpet av tredimensjonale luminescens, fluorescens, og bright-field oppkjøp i 24 timer. For å overvåke promoteraktiviteten til det oscillerende genet Dll1, kan ubiquitinated luciferase, en destabilisert luciferase reporter med en halveringstid på ca. 10 minutter, brukes. Som en fluorescerende reporter kan luciferase-reporteren brukes til å overvåke uttrykksdynamikken til et protein ved å bli smeltet sammen til genkodingssekvensen av interesse.For å visualisere reporteruttrykk på encellenivå i vevskulturer, kan reportergenet midlertidig bli transfisert til NPCer via in utero elektroporasjon som demonstrert. I tillegg gjør mikroskopbasert bildebehandling oppkjøpet av bilder av lysfelt, fluorescens og kjemiluminescens. Reporteren av Dll1 promoter aktivitet viser en oscillatory uttrykk i NPCer avledet fra telencephalon av Dll1 ubiquitinated F luciferase reporter mus, med destabilisert luciferase reporter indikerer en skarp opp og ned regulering av uttrykket for promotor aktivitet.I tilstøtende forbedrede grønne fluorescerende proteinpositive celler som bærer Hes1 reporter og mCherry-positive celler som uttrykker Dll1 proteinreporter som tok kontakt med hverandre under observasjon, ser Hes1 reporteruttrykk ut til å starte omtrent 60 minutter etter kontakt, noe som tyder på at tidsforsinkelsen for overføring av Notch-signalering mellom de tilstøtende cellene er omtrent en time. Videre, under signaloverføring, viser Dll1 proteinuttrykk en dynamisk translokasjon. Når du anskaffer bioluminescensavbildningen, hold mikroskoprommet helt mørkt, da overflødig lys kan forhindre et optimalt oppkjøp.Den siste utviklingen innen optogenetikk gjør at vi kan kontrollere genuttrykket med lys. Med denne teknikken kan vi samtidig introdusere ulike mønster av genuttrykk og overvåke luciferase reporter svar.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Developmental Biology

Unit 2

Unit 1

Cell Signaling Pathways

Alternative Signaling Routes in Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Studerer Wnt signale Under fordelingen av Gjennomføre Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Real Time Kinetic Måling og visualisering av somatiske Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Stimulering av Notch signale i Muse osteoclast Prekursorer

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flere Foton tid forfalle Imaging se utvikling i sanntid: visualisering av migrere Neural Crest celler i sebrafisk embryo

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Sanntids måling av epitelial barriere permeabilitet i menneskelig Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

I Vivo Avbildning av muskel-sene Morphogenesis i Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle Imaging av kromosom segregering under mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

Neurogenesis bruke P19 embryo kreftceller

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Bildebehandling og analyse av vevsorientering og vekstdynamikk i developing Drosophila Epithelia under pupal stadier

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Sanntidsavbildning av CCL5-indusert migrasjon av periosteale skjelettstammeceller hos mus

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...