Name: real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis
Uploaded: 2019-12-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis at JoVE.com

Agradecemos Yumiko Iwamoto para apoiar a produção do vídeo. Também somos gratos a Akihiro Isomura pela discussão e apoio à análise de imagem, Hitoshi Miyachi por suportetécnico para a geração de animais transgênicos, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) e Ouin Kunitaki (Andor Japan) para o suporte técnico e discussões sobre o sistema de imagem de bioluminescência. Este trabalho foi apoiado pela Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. and MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS) 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. e H.S.) e Platform for Dynamic Approaches to Living System do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia, Japão.

Todo o procedimento, incluindo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee no instituto de Frontier Life and Medical Sciences, Universidade de Kyoto.
1. Repórteres de bioluminescência
NOTA: O repórter luciferase é adequado para medir a dinâmica rápida da atividade promotora, fundindo o sinal de degradação. Além disso, o repórter de fusão luciferase permite o monitoramento da dinâmica proteica na única célula. Ambo...

<ol>
	<li>Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+factors+in+cortical+development.">Basic helix-loop-helix factors in cortical development.</a> Neuron. 39, 13-25 (2003).</li><li>Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+intermediate+progenitor+cells+in+cerebral+cortex+development.">Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development.</a> Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li><li>Paridaen, J. T., Huttner, W. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+vertebrate+neural+development.">Notch signaling in vertebrate neural development.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).</li><li>Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+in+the+Vertebrate+Nervous+System:+An+Old+Dog+with+New+Tricks.">Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks.</a> Neuron. 69, 840-855 (2011).</li><li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling:+a+simple+pathway+becomes+complex.">Notch signalling: a simple pathway becomes complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).</li><li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+in+context.">Notch signalling in context.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMAL1+C+terminus+regulates+the+circadian+transcription+feedback+loop.">The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).</li><li>Behar, M., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+temporal+codes+of+intra-cellular+signals.">Understanding the temporal codes of intra-cellular signals.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Dynamics+Control+Cell+Fate+in+the+Early+Drosophila+Embryo.">Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+Progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: Progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Nakajima, Y., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+assays:+multicolor+luciferase+assay,+secreted+luciferase+assay+and+imaging+luciferase+assay.">Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).</li><li>Nakajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+beetle+luciferase+for+high-resolution+bioluminescence+imaging.">Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Stacer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+reporter+for+dual+luciferase+imaging+in+living+animals.">NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals.</a> Molecular Imaging. 12, (2013).</li></ol>

Os componentes da sinalização notch mostram expressões oscilatórias em sincronia durante a somitogênese, mas fora de sincronia durante a neurogênese, levando às dificuldades em capturar a dinâmica de expressão por análise estática neste último caso. Assim, o monitoramento em tempo real é necessário para revelar a dinâmica de expressão dos componentes de sinalização notch, como Hes1 e Dll1. Porque os períodos das expressões das oscilações de Hes1 e Dll1 são extrem...

O cérebro de mamíferoé composto por um grande número de vários tipos de neurônios e células gliais. Todas as células são geradas a partir de células de tronco neural /progenitoras (NPCs), que primeiro proliferam para expandir seus números, em seguida, começam a se diferenciar em neurônios e, finalmente, dar origem às células gliais1,2,3,4,5. Uma vez que as células se diferenciaram em neurônios, elas não podem proliferar ou aumentar seus números e, portanto, a manutenção de NPCs até estágios posteriores é importante. Notch sinalização através de interações célula-célula desempenha um papel importante na manutenção npcs6,7. Os ligantes de notch interagem com a proteína da membrana, Notch, na superfície das células vizinhas e ativa mproteína Notch. Após a ativação, ocorre a proteólese da proteína Notch, liberando assim o domínio intracelular de Notch (NICD) da membrana celular para o núcleo8,9,10. No núcleo, nicd liga-se às regiões promotorde Hes1 e Hes5 (Hes1/5)e ativa a expressão desses genes. Hes1/5 reprimir a expressão dos genes proneuris Ascl1 e Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Como os genes neurais induzem a diferenciação neuronal, Hes1/5 desempenha papéis essenciais na manutenção de NPCs. Além disso, como os genes proneuris podem ativar a expressão do Entalhe ligand Delta-like1 (Dll1), Hes1/5 também reprimir a expressão de Dll1. Portanto, a expressão de Dll1 leva a células vizinhas sendo negativa para Dll1 via sinalização Notch. Desta forma, as células inibem as células adjacentes de seguir seu mesmo destino, um fenômeno conhecido como a inibição lateral8. No cérebro em desenvolvimento, a inibição lateral desempenha um papel na geração de vários tipos de células diferentes.
Imagens em tempo real no nível único celular revela expressões dinâmicas dos componentes da sinalização Notch em NPCs15,16,17. Notch sinalização ativa a expressão de Hes1, mas a proteína Hes1 se liga ao seu próprio promotor e reprime sua própria expressão. Além disso, Hes1 é uma proteína extremamente instável, que é degradada pela via ubiquitina-proteasome; Portanto, a repressão de seu próprio promotor é de curta duração e, em seguida, a transcrição começa novamente. Desta forma, a expressão de Hes1 oscila tanto nos níveis de transcrição quanto translacional em um ciclo18de 2 h. A expressão oscilatória de Hes1, por sua vez, induz a expressão oscilatória dos genes-alvo a jusante, como Ascl1, Neurog2 e Dll1, via repressão periódica15,16,17, 19. Enquanto os genes neurais podem induzir diferenciação neuronal, sua expressão oscilatória não é suficiente para diferenciação neuronal; sim sua expressão sustentada é essencial para a diferenciação neuronal. A expressão oscilatória de genes proneuris é importante para a manutenção de NPCs em vez de induzir diferenciação neuronal14,15,16. A expressão de Dll1 oscila em ambos os níveis de transcrição e translação durante várias morfogêneses, como neurogênese e somitogênese. A expressão dinâmica do Dll1 é importante para a morgênese normal e expressão constante de Dll1 induz defeitos na neurogênese e somitogênese17. Estes resultados demonstram a função importante que a dinâmica da expressão do gene e da cinética da proteína tem no regulamento de vários eventos desenvolventes (isto é, dinâmica diferente da expressão produz saídas diferentes em comportamentos celulares).
Para analisar a dinâmica da sinalização notch, a análise estática de tecidos e células são insuficientes porque eles estão em constante mudança. Imagens em tempo real de células únicas é uma ferramenta poderosa para revelar a dinâmica na expressão gênica. A expressão dinâmica das moléculas de sinalização notch sofre respostas cíclicas rápidas no período de 2-3 h. Esta rápida expressão periódica apresenta dois problemas difíceis para o monitoramento em tempo real: (1) a expressão das moléculas é suprimida a níveis baixos, e (2) a rotatividade rápida requer repórteres de resposta rápida. Para superar esses problemas, anteriormente desenvolvemos um método de imagem em tempo real de bioluminescência20. Como o repórter de bioluminescência tem maior sensibilidade e menor tempo de maturação do que os repórteres fluorescentes, essa estratégia nos permite monitorar a dinâmica rápida nas células vivas. Usando a visualização em tempo real, descobrimos que mais genes exibiam expressão dinâmica do que pensávamos anteriormente. Além disso, o número de relatos que mostram expressão e dinâmica proteica em células vivas e o significado dessas dinâmicas em vários eventos biológicos tem aumentado, sugerindo um papel fundamental da dinâmica nas expressões gênicas21,22.
Neste relatório, descrevemos uma maneira de visualizar a expressão do Notch ligand Dll1 em NPCs em culturas dissociadas e em culturas de fatias corticais. Para monitorar a dinâmica da transcrição Dll1 em níveis de célulaúnica, geramos culturas dissociadas de NPCs derivadas da telencefalon embrionária de camundongos transgênicos carregando repórter pDll1-Ub-Fluc, um repórter lúciferase desestabilizado dirigido por promotor dll1. Para monitorar a dinâmica da proteína Dll1 in vivo, introduzimos o repórter de fusão Dll1-Fluc em NPCs no córtex e visualizamos a expressão do repórter em NPCs em culturas de fatias corticais. Imagens em tempo real nos permitiram capturar as várias características da expressão gênica e da dinâmica proteica em células vivas em alta resolução temporal.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioluminescence Imaging System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled water circulator (chiller)</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>Model: F12-ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Model: iKon-M 934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>Model: INU-ONICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination device</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>Model: pE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td>Model: 40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix gas controller</td>
			<td>Tokken</td>
			<td>Model: TK-MIGM OLO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: UPLFLN 40X O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Model: SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for NPC dissociation culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock solution: 1 &#956;g/ml in 0.1% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01493-85</td>
			<td>Stock solution: 100mM in 0.9% saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003172</td>
			<td>Stock solution: 1000U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cystein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003178</td>
			<td>Stock solution: 7U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptmycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6281</td>
			<td>40 mg/ml in DW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for in utero electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>181228T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>7-mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>CUY21 EDIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauzes</td>
			<td>Kawamoto co.</td>
			<td>7161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro capillary</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentbarbital</td>
			<td>Kyoritsuseiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needle</td>
			<td>Akiyama MEDICAL MFG. CO</td>
			<td>F17-40B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Seractal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Slice culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro surgical knife</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>19 Gauge V-Lance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5MUV-PJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2/B27 media</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>ref. NPC dissociatioin culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber cutting board</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis

A sinalização de notch regula a manutenção de células-tronco/progenitoras neurais por interações célula-célula. Os componentes da sinalização notch exibem expressão dinâmica. Notch sinalização efetor Hes1 e o Notch ligand Delta-like1 (Dll1) são expressos de forma oscilatória em células de tronco neural / progenitor. Como o período de expressão oscilatória desses genes é muito curto (2 h), é difícil monitorar sua expressão cíclica. Para examinar tais mudanças rápidas na expressão do gene ou na dinâmica da proteína, os repórteres rápidos da resposta são exigidos. Devido à sua rápida maturação cinética e alta sensibilidade, o repórter de bioluminescência luciferase é adequado para monitorar mudanças rápidas de expressão gênica nas células vivas. Usamos um repórter lúciferase desestabilizado para monitorar a atividade do promotor e um repórter luciferase fundido para visualização da dinâmica de proteínas na resolução de célulaúnica. Estes repórteres da bioluminescência mostram o retorno rápido e geram sinais muito fracos; Portanto, desenvolvemos um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível para detectar tais sinais fracos. Esses métodos nos permitem monitorar várias dinâmicas de expressão gênica em células vivas e tecidos, que são informações importantes para ajudar a entender os estados celulares reais.

Expressões dos genes Hes1/7 exibem 2 h ciclo de oscilação em várias linhas celulares e durante a somitogênese. Além disso, o período de oscilação é muito curto e tanto os seus mRNAs como as proteínas são extremamente instáveis, com a meia-vida de cerca de 20 min. Se usar um repórter de resposta lenta, não podemos rastrear uma dinâmica tão rápida, e se usar um repórter estável, ele gradualmente se acumula enquanto a expressão gênica oscila. Assim, o repórter deve ser rapidamente degradado p...

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Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Células de tronco neural/progenitor apresentam várias dinâmicas de expressão de componentes de sinalização notch que levam a diferentes resultados de eventos celulares. Essa expressão dinâmica pode ser revelada pelo monitoramento em tempo real, não pela análise estática, usando um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível que permite a visualização de mudanças rápidas nas expressões gênicas.

Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o significado da dinâmica da expressão genética na proliferação e diferenciação celular, particularmente a dinâmica das moléculas de sinalização notch em células-tronco neurais. A principal vantagem dessa técnica é que podemos monitorar a expressão genética tanto in vitro quanto in vivo com uma precisão muito alta por imagem ao vivo. Demonstrando o procedimento estará Hiromi Shimojo, professora assistente do meu laboratório que desenvolveu essa nova tecnologia.Para a introdução do repórter de luciferase Dll1 F no NPC, confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal em um dia embrionário de 12,5 a 14,5 camundongos grávidas antes de fazer uma incisão de dois a três centímetros através do abdômen, ao longo da linha média. Coloque gaze encharcada de PBS ao redor da incisão e use fórceps em forma de anel para extrair cuidadosamente o chifre uterino direito. Depois de contar os embriões, use um micro capilar para injetar um a dois microliters de DNA misto de repórter de luciferase Dll1 F no ventrículo do telencephalon de cada embrião.Uma injeção bem sucedida resultará na observância do corante azul sobre a superfície do útero. Para eletroporação, molhe o útero e o eletrodo com PBS, e segure suavemente a cabeça do primeiro embrião. Defina o eletrodo carregado positivamente ao lado do hemisfério em que o DNA foi injetado, e forneça cinco pulsos de 30 a 50 volts, 50 milissegundos, com uma pausa de um segundo entre os pulsos, verificando se as bolhas são geradas a partir do eletrodo carregado negativamente.Quando todos os embriões forem injetados, devolva o chifre uterino esquerdo ao abdômen, e use uma agulha de 17 milímetros para fechar a incisão com uma sutura de seda 4-0, colocando PBS quente na cavidade abdominal antes de completar o fechamento. Para criar uma cultura de NPC dissociada, primeiro coloque o útero de um dia embrionário de 12,5 a 14,5 camundongos transgênicos ubiquitinados Dll1 gestantes em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo 25 mililitros de PBS gelado, e use micro tesouras e fórceps finos para remover os embriões do útero. Depois de decapitar os embriões, coloque as cabeças em uma nova placa de Petri de 10 centímetros contendo DMEM/F12 gelado, e remova a epiderme e cartilagem ao redor de cada cérebro.Transfira os cérebros para uma antena de 35 milímetros sob um microscópio dissecando contendo três mililitros de meio N2B27 gelado. Remova o telencephalon direito e esquerdo do diencephalon. Use fórceps finos para remover as meninges que cobrem a superfície do telencephalon e para dissecar a parte dorsolateral do córtex do telencephalon.Quando todos os tecidos neurais de interesse tiverem sido isolados, use uma pipeta P1000 para transferir as amostras para tubos individuais de 1,5 mililitro, e use uma pipeta P200 para aspirar qualquer meio extra de cada tubo. Adicione 100 microliters de solução de papain por par de córtex, e coloque as amostras a 24 graus Celsius por 15 minutos. No final da incubação, pipeta suavemente as amostras 10 vezes com uma nova pipeta P1000, e devolva os tubos a 24 graus Celsius por mais 15 minutos.No final da incubação, pipeta suavemente as amostras novamente antes de coletar os tecidos digeridos por centrifugação. Aspire os supernantes e resuspenque suavemente cada pelota com um mililitro de meio DMEM/F12. Centrifugar as amostras mais três vezes como apenas demonstrado, reutilizando suavemente cada pelota com um mililitro fresco de médio após cada centrifugação.Após a última centrifugação, resuspenque as pelotas em 500 microliters de meio N2B27 suplementados com luciferina de um mililitro, e sementes uma vez 10 para as seis células de cada amostra em pratos individuais de fundo de vidro revestidos de poli-L-lysina. Em seguida, coloque as placas na incubadora de cultura celular por uma hora. Uma vez que as células tenham aderido ao prato, adicione dois mililitros de médio N2B27 fresco mais luciferina de um mililitro em cada placa.Para visualizar a expressão do repórter luciferase nas culturas de dissociação do NPC, selecione o objetivo de imersão do óleo e coloque o prato de amostra no estágio do microscópio. Consulte o campo manualmente para determinar a melhor posição para visualizar as células e concentre-se nas células de interesse. Clique em Live para adquirir a imagem de teste e use o programa de aquisição multidimensional para executar a aquisição de lapso de tempo por luminescência bidimensional e aquisições de campo brilhante por 24 horas.Para preparar o desenvolvimento de culturas de cortex, um dia após a injeção do repórter, colher o dia embrionário de 13,5 a 14,5 cérebros de embrião como demonstrado, e colocar o prato contendo o cérebro no palco de um microscópio estereoscópico fluorescence. Confirme que cada córtex expressa o repórter fluorescente injetado sob a luz de excitação apropriada, e transfira os cérebros para uma placa de corte de borracha de silicone preenchida com 30 mililitros de meio DMEM/F12, borbulhado com 100% de gás oxigênio. Use uma micro faca cirúrgica e fórceps finos para cortar a borda entre a porção medial e lateral do telencephalon dorsal, e separar o tecido em dois hemisférios.Em seguida, use a faca para cortar o córtex como listras para obter fatias corticais, transferindo as fatias em média da placa de corte para uma nova placa de Petri de 35 milímetros à medida que são adquiridas. Quando todas as fatias tiverem sido coletadas, coloque a superfície cortada de cada fatia sobre uma inserção de cultura colocada em um prato de fundo de vidro contendo meio enriquecido, ajustando a orientação de cada fatia com fórceps finos conforme necessário. Em seguida, remova qualquer excesso médio com uma pipeta, e coloque o prato em uma incubadora multi-gás definida para 40% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 30 minutos.Ao final da incubação, adicione 300 microliters de meio enriquecido suplementado com luciferina de um mililitro ao prato de cultura. Para visualizar a expressão do repórter luciferase dentro das culturas de fatia, selecione o objetivo de 40x e coloque o prato de amostra no estágio do microscópio. Adquira uma imagem de teste da fluorescência, e ajuste a posição e o plano de foco para a região de interesse sob a iluminação da luz de excitação apropriada.Em seguida, execute a aquisição de lapso de tempo por luminescência tridimensional, fluorescência e aquisições de campo brilhante por 24 horas. Para monitorar a atividade promotora do gene oscilante Dll1, pode ser utilizada uma luciferase desestabilizada com meia-vida de cerca de 10 minutos. Como um repórter fluorescente, o repórter da luciferase pode ser usado para monitorar a dinâmica de expressão de uma proteína, sendo fundido à sequência de codificação genética de interesse.Para visualizar a expressão de repórter no nível unicelular em culturas teciduais, o gene repórter pode ser transitoriamente transfectado em NPCs via na eletroporação uterida, como demonstrado. Além disso, a imagem baseada em microscópio permite a aquisição de imagens de campo brilhante, fluorescência e chemiluminescência. O repórter da atividade promotora DLL1 exibe uma expressão oscilatória em NPCs derivados da teleencefalo de ratos repórteres da Dll1 ubiquitinados F luciferase, com o repórter luciferase desestabilizado indicando uma regulação acentuada para cima e para baixo da expressão da atividade promotora.Em células positivas de proteína fluorescentes verdes adjacentes que carregam células hes1 repórter e mCherry-positive expressando repórter de proteína Dll1 que fez contato entre si durante a observação, a expressão do repórter Hes1 parece começar cerca de 60 minutos após o contato, sugerindo que o atraso de tempo para a transmissão da sinalização notch entre as células adjacentes é de cerca de uma hora. Além disso, durante a transmissão de sinal, a expressão proteica Dll1 apresenta uma translocação dinâmica. Ao adquirir a imagem de bioluminescência, mantenha a sala de microscópio completamente escura, pois a luz ímpar pode impedir uma aquisição ideal.Desenvolvimentos recentes na optogenética nos permitem controlar a expressão genética com luz. Com essa técnica, podemos simultaneamente introduzir vários padrões de expressão genética e monitorar as respostas dos repórteres da luciferase.

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Estudar Wnt Signaling Durante Padronização de conduzir Airways

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Biologia do Desenvolvimento

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Medição e visualização em tempo real de Reprogramação Somatic

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

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Estimulação da sinalização Notch no mouse osteoclastos Precursores

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Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

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In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

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Neurogênese usando células de Carcinoma embrionário P19

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Imagem em tempo real da migração induzida por CCL5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...