Name: real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis
Uploaded: 2019-12-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis at JoVE.com

Vi tackar Yumiko Iwamoto för att stödja produktionen av videon. Vi är också tacksamma för att Akihiro Isomura för diskussion och stöd för bildanalys, Hitoshi Miyachi för tekniska stöd för generering av transgena djur, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus medicinsk vetenskap), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) och OUIN kunitaki (Andor Japan) för teknisk support och diskussioner om Mareld Imaging system. Detta arbete stöddes av kärnforskning för Evolutionell vetenskap och teknik (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid för vetenskaplig forskning om innovativa områden (MEXT 24116705 för H.S. och MEXT 16H06480 för R.K.), Grant-in-Aid för vetenskaplig forskning (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. och H.S.), och plattform för dynamiska förhållningssätt till levande system från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik, Japan.

Alla förfaranden inklusive djur försökspersoner har godkänts av institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Institutet för Frontier Life och medicinska vetenskaper, Kyoto University.
1. bioluminescens reportrar
Obs: luciferas reporter är lämplig för att mäta den snabba dynamiken i Promotorns aktivitet genom att fixera nedbrytnings signalen. Dessutom möjliggör luciferas fusion reporter övervakning av proteindynamiken i den enskilda cellen. Bå...

<ol>
	<li>Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+factors+in+cortical+development.">Basic helix-loop-helix factors in cortical development.</a> Neuron. 39, 13-25 (2003).</li><li>Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+intermediate+progenitor+cells+in+cerebral+cortex+development.">Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development.</a> Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li><li>Paridaen, J. T., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+during+development+of+the+vertebrate+central+nervous+system.">Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system.</a> EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).</li><li>Taverna, E., G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis:+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex.">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+vertebrate+neural+development.">Notch signaling in vertebrate neural development.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).</li><li>Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+in+the+Vertebrate+Nervous+System:+An+Old+Dog+with+New+Tricks.">Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks.</a> Neuron. 69, 840-855 (2011).</li><li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling:+a+simple+pathway+becomes+complex.">Notch signalling: a simple pathway becomes complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).</li><li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+in+context.">Notch signalling in context.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Canonical+Notch+Signaling+Pathway:+Unfolding+the+Activation+Mechanism.">The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism.</a> Cell. 137, 216-233 (2009).</li><li>Ishibashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+expression+of+helix-loop-helix+factor+HES-1+prevents+mammalian+neural+differentiation+in+the+central+nervous+system.">Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system.</a> The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).</li><li>Ohtsuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hes1+and+Hes5+as+notch+effectors+in+mammalian+neuronal+differentiation.">Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation.</a> The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).</li><li>Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Basic+Helix-Loop-Helix+Genes+Hes1+and+Hes5+in+Expansion+of+Neural+Stem+Cells+of+the+Developing+Brain.">Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).</li><li>Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hes+gene+family:+repressors+and+oscillators+that+orchestrate+embryogenesis.">The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis.</a> Development. 134, 1243-1251 (2007).</li><li>Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+in+Notch+Signaling+Regulate+Maintenance+of+Neural+Progenitors.">Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors.</a> Neuron. 58, 52-64 (2008).</li><li>Imayoshi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors.">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li><li>Shimojo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis.">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes and Development. 30, 102-116 (2016).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+expression+of+the+bHLH+factor+Hes1+regulated+by+a+negative+feedback+loop.">Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.</a> Science. 298, 840-843 (2002).</li><li>Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Notch+signaling+in+neural+progenitor+cells+and+a+revised+view+of+lateral+inhibition.">Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition.</a> Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+pulsing+in+genetic+circuits.">Functional roles of pulsing in genetic circuits.</a> Science. 342, 1193-1200 (2013).</li><li>Purvis, J. E., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+decoding+cellular+information+through+signaling+dynamics.">Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics.</a> Cell. 152, 945-956 (2013).</li><li>Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+26S+proteasome+activity+and+inhibition+in+living+mice.">Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice.</a> Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).</li><li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Cellular+Clocks+in+the+Suprachiasmatic+Nucleus.">Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus.</a> Science. 302, 1408-1412 (2003).</li><li>Kiyohara, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMAL1+C+terminus+regulates+the+circadian+transcription+feedback+loop.">The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).</li><li>Behar, M., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+temporal+codes+of+intra-cellular+signals.">Understanding the temporal codes of intra-cellular signals.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Gene+Expression+in+a+Single+Cell.">Stochastic Gene Expression in a Single Cell.</a> Science. 297, 1183-1186 (2002).</li><li>Nelson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+in+NF-kappaB+signaling+control+the+dynamics+of+gene+expression.">Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression.</a> Science. 306, 704-708 (2004).</li><li>Purvis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+dynamics+control+cell+fate.">p53 dynamics control cell fate.</a> Science. 336, 1440-1444 (2012).</li><li>Hansen, A. S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+decoding+of+transcription+factor+dynamics+involves+a+trade-off+between+noise+and+control+of+gene+expression.">Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression.</a> Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).</li><li>Hansen, A. S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+Determinants+of+Promoter+Threshold+and+Activation+Timescale.">cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale.</a> Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).</li><li>Johnson, H. E., Toettcher, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Dynamics+Control+Cell+Fate+in+the+Early+Drosophila+Embryo.">Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+Progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: Progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Nakajima, Y., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+assays:+multicolor+luciferase+assay,+secreted+luciferase+assay+and+imaging+luciferase+assay.">Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).</li><li>Nakajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+beetle+luciferase+for+high-resolution+bioluminescence+imaging.">Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Stacer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+reporter+for+dual+luciferase+imaging+in+living+animals.">NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals.</a> Molecular Imaging. 12, (2013).</li></ol>

Komponenterna i notch signalering visar oscillatoriska uttryck i Synchrony under somitogenesis men av Synchrony under neurogenes, vilket leder till svårigheterna att fånga uttrycket dynamik genom statisk analys i det senare fallet. Sålunda, realtid övervakning krävs för att avslöja uttrycket dynamik av notch signalering komponenter, såsom Hes1 och Dll1. Eftersom perioderna av uttrycken för Hes1 och Dll1 svängningar är extremt korta, är cirka 2-3 h, snabb respons och instabi...

Däggdjurs hjärnan består av ett stort antal olika typer av nervceller och gliaceller. Alla celler genereras från neurala stamceller/progenitorceller (NPCs), som först föröka sig för att utöka deras antal, sedan börja differentiera till nervceller, och slutligen ge upphov till gliaceller1,2,3,4,5. När celler har differentierat till nervceller, de kan inte föröka sig eller ökar deras antal, och, därför, underhåll av NPC tills senare stadier är viktigt. Notch signalering via cell-cell interaktioner spelar en viktig roll för att upprätthålla NPCs6,7. Notch ligander interagera med membranprotein, notch, på ytan av angränsande celler och aktiverar notch protein. Efter aktiveringen, proteolys av notch protein uppstår, därmed släppa den intracellulära domänen av notch (NiCd) från cellmembranet i Nucleus8,9,10. I kärnan binder NICD till Promotorns regioner Hes1 och Hes5 (Hes1/5) och aktiverar uttrycket för dessa gener. Hes1/5 Tryck igen uttrycket av proneural gener Ascl1 och Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Eftersom proneural gener inducerar neuronala differentiering, Hes1/5 spela viktiga roller i att upprätthålla NPC. Dessutom, som proneural gener kan aktivera uttrycket av notch ligand delta-like1 (Dll1), Hes1/5 också trycka uttrycket av Dll1. Därför, uttrycket av Dll1 leder till angränsande celler är negativa för Dll1 via notch signalering. På detta sätt, celler hämmar angränsande celler från att följa deras samma öde, ett fenomen som kallas den laterala hämning8. I hjärnans utveckling, lateral hämning spelar en roll i att generera olika olika celltyper.
Real tids avbildning på singelcellsnivå avslöjar dynamiska uttryck av komponenterna i notch signalering i NPCs15,16,17. Notch signalering aktiverar uttrycket av Hes1, men Hes1 protein binder till sin egen promotor och ÅTERTRYCKER sitt eget uttryck. Dessutom är Hes1 ett extremt instabilt protein, som bryts ned av den ubiquitin-Proteasome vägen; Därför är repressionen av dess egna tillskyndare endast kortlivad och därefter börjar transkription igen. På detta sätt, uttrycket av Hes1 oscillerar på både transkription och translationella nivåer i en 2 h cykel18. Oscillatoriska uttrycket av Hes1, i sin tur, inducerar oscillerande uttrycket av nedströms målgener, såsom Ascl1, Neurog2, och Dll1, via periodiskt förtryck15,16,17,19. Medan proneural gener kan inducera neuronala differentiering, deras oscillatoriska uttryck är inte tillräckligt för neuronala differentiering; snarare deras ihållande uttryck är avgörande för neuronala differentiering. Det oscillatoriska uttrycket av proneural gener är viktigt för att upprätthålla NPC snarare än för att inducera neuronala differentiering14,15,16. Uttrycket av Dll1 oscillerar vid både transkription och translationella nivåer under olika morfogenes, såsom neurogenes och somitogenesis. Det dynamiska uttrycket av Dll1 är viktigt för den normala morfogenes och stadigt uttryck för Dll1 inducerar defekter i neurogenes och somitogenesis17. Dessa fynd visar den viktiga funktion som dynamiken i genuttryck och proteinkinetik har på regleringen av olika utvecklings händelser (dvs., olika uttrycks dynamik producerar olika utgångar i cellulära beteenden).
För att analysera dynamiken i notch signalering, är den statiska analysen av vävnader och celler otillräckliga eftersom de ständigt förändras. Real tids avbildning av enstaka celler är ett kraftfullt verktyg för att avslöja dynamiken i genuttryck. Det dynamiska uttrycket av notch signalmolekyler genomgår snabba cykliska svar under perioden 2-3 h. Detta snabba periodiska uttryck presenterar två svåra problem för realtids övervakningen: (1) molekylernas uttryck dämpas till låga nivåer, och (2) snabb omsättning kräver snabba svars reportrar. För att övervinna dessa problem, utvecklade vi tidigare en Mareld realtid Imaging Method20. Eftersom Mareld reporter har en högre känslighet och kortare mogning tid än fluorescerande reportrar, denna strategi gör att vi kan övervaka den snabba dynamiken i levande celler. Med Realtidsvisualisering fann vi att fler gener uppvisade ett dynamiskt uttryck än vi tidigare trott. Dessutom har antalet rapporter som visar uttryck och proteindynamik i levande celler och betydelsen av dessa dynamik i olika biologiska händelser ökat, vilket tyder på en grundläggande roll för dynamiken i genuttryck21,22.
I denna rapport beskriver vi ett sätt att visualisera uttrycket av notch ligand Dll1 i NPCs i både separerade kulturer och i kortikala segment kulturer. För att övervaka dynamiken i Dll1 transkription på enstaka cell nivåer, genererade vi dissocierade kulturer av NPC som härrör från den embryonala telencephalon av transgena möss som transporterar pDll1-UB-Fluc reporter, en Dll1 promotor driven destabiliserat luciferas reporter. För att övervaka Dll1 proteindynamik in vivo introducerade vi Dll1-Fluc fusion reporter i NPCs i cortex och visualiserade uttrycket av reportern i NPCs i kortikala segment kulturer. Real tid Imaging gjorde det möjligt för oss att fånga de olika funktionerna i genuttryck och proteindynamik i levande celler vid hög temporala upplösning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioluminescence Imaging System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled water circulator (chiller)</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>Model: F12-ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Model: iKon-M 934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>Model: INU-ONICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination device</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>Model: pE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>MOLECULAR DEVICES</td>
			<td>Model: 40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix gas controller</td>
			<td>Tokken</td>
			<td>Model: TK-MIGM OLO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Model: UPLFLN 40X O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Model: SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for NPC dissociation culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock solution: 1 &#956;g/ml in 0.1% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01493-85</td>
			<td>Stock solution: 100mM in 0.9% saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003172</td>
			<td>Stock solution: 1000U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cystein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003178</td>
			<td>Stock solution: 7U/ml in EBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptmycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6281</td>
			<td>40 mg/ml in DW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for in utero electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>181228T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>7-mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Neppagene</td>
			<td>CUY21 EDIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauzes</td>
			<td>Kawamoto co.</td>
			<td>7161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro capillary</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentbarbital</td>
			<td>Kyoritsuseiyaku</td>
			<td>Somnopentyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needle</td>
			<td>Akiyama MEDICAL MFG. CO</td>
			<td>F17-40B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Seractal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparations for Slice culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>664160-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic petri dish</td>
			<td>greiner</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>INOX No.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro surgical knife</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>19 Gauge V-Lance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-gas incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-5MUV-PJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2/B27 media</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>ref. NPC dissociatioin culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring-shaped forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber cutting board</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time bioluminescence imaging of notch signaling dynamics during murine neurogenesis

Notch signalering reglerar upprätthållandet av neurala stamceller/progenitorceller av cell-cell interaktioner. Komponenterna i notch signalering uppvisar dynamiskt uttryck. Notch signalering effektor Hes1 och notch ligand delta-like1 (Dll1) uttrycks i en oscillerande sätt i neurala stamceller/progenitorceller. Eftersom perioden av oscillatoriska uttrycket av dessa gener är mycket kort (2 h), är det svårt att övervaka deras cykliska uttryck. För att undersöka sådana snabba förändringar i genuttrycket eller proteindynamiken krävs snabba responsreportrar. På grund av dess snabba mognad kinetik och hög känslighet, den Mareld reporter luciferas är lämplig för att övervaka snabba genuttryck förändringar i levande celler. Vi använde en destabiliserat luciferas reporter för övervakning av arrangören aktivitet och en luciferas-smält reporter för visualisering av proteindynamik vid enkel cells upplösning. Dessa Mareld reportrar visar snabb omsättning och genererar mycket svaga signaler; Därför har vi utvecklat en mycket känslig Mareld Imaging system för att upptäcka sådana svaga signaler. Dessa metoder gör det möjligt för oss att övervaka olika gener uttrycks dynamik i levande celler och vävnader, som är viktig information för att hjälpa till att förstå de faktiska cellulära tillstånd.

Uttryck för generna Hes1/7 Exhibit 2 h svängning cykel i olika cellinjer och under somitogenesis. Dessutom är perioden av svängning mycket kort och både deras mRNAs och proteiner är extremt instabila med halveringstiden på cirka 20 min. Om du använder en långsam responsreporter, kan vi inte spåra sådana snabba dynamik, och om du använder en stabil reporter, det ackumuleras gradvis medan genuttrycket oscillerar. Således måste reportern snabbt brytas ned för att övervaka den snabba omsättningen av...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis at JoVE.com

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Neurala Stem/progenitorceller uppvisar olika uttrycks dynamik av notch signalering komponenter som leder till olika resultat av cellulära händelser. Sådana dynamiska uttryck kan avslöjas genom realtidsövervakning, inte av statisk analys, med hjälp av en mycket känslig Mareld Imaging system som möjliggör visualisering av snabba förändringar i genuttryck.

Real tid bioluminescence avbildning av notch signalering dynamik under Murine neurogenes

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor om betydelsen av genuttryck dynamik i cellproliferation och differentiering, särskilt dynamiken i Notch signalering molekyler i neurala stamceller. Den största fördelen med denna teknik är att vi kan övervaka genuttryck både in vitro och in vivo med en mycket hög precision genom live avbildning. Demonstrerar proceduren blir Hiromi Shimojo, den biträdande professorn från mitt laboratorium som utvecklade denna nya teknik.För Dll1 F luciferase reporter introduktion i NPC, bekräfta en brist på svar på pedal reflex i en embryonala dag 12,5 till 14,5 gravid mus innan du gör en två till tre centimeter snitt genom buken, längs mittlinjen. Placera PBS-indränkt gasbindning runt snittet, och använd ringformade tlyktor för att försiktigt extrahera rätt livmoderhorn. Efter att ha räknat embryon, använd en mikro kapillär för att injicera en till två mikroliter av blandade Dll1 F luciferase reporter DNA i ventrikeln av telencephalon av varje embryo.En lyckad injektion kommer att resultera i iakttagandet av blått färgämne över ytan av livmodern. För elektroporation, blöt livmodern och elektroden med PBS, och försiktigt greppa huvudet på det första embryot. Ställ den positivt laddade elektroden på den sida av halvklotet där DNA injicerades, och ge fem 30-till 50-volts, 50-millisekkunderspulser, med en sekunds paus mellan pulser, kontrollera att bubblor genereras från negativt laddade elektrod.När alla embryon har injicerats, tillbaka den vänstra livmodern horn till buken, och använda en 17-millimeters nål för att stänga snittet med en 4-0 siden sutur, placera varma PBS i bukhålan innan du slutför stängningen. För att inrätta en dissocierad NPC kultur, placera först livmodern från en embryonal dag 12,5 till 14,5 gravid Dll1 ubiquitinated luciferase transgenic mus till en 10-centimeter Petriskål som innehåller 25 milliliter av iskalla PBS, och använda mikro sax och fina kraftknäckor för att ta bort embryon från livmodern. Efter halshuggning av embryon, placera huvudena i en ny 10-centimeter Petriskål som innehåller iskall DMEM/F12, och ta bort epidermis och brosk som omger varje hjärna.Överför hjärnorna till en 35-millimeters skål under ett dissekerande mikroskop som innehåller tre milliliter iskall N2B27 medium. Ta bort höger och vänster telencephalon från diencephalon. Använd fina tlys för att avlägsna hjärnhinnorna som täcker ytan av telencephalon och för att dissekera den dorsolaterala delen av cortex från telencephalon.När alla de neurala vävnader av intresse har isolerats, använd en P1000 pipetter för att överföra proverna till enskilda 1,5-milliliter rör, och använda en P200 pipetter för att aspirera något extra medium från varje rör. Tillsätt 100 mikroliter papainlösning per cortexpar, och placera proverna på 24 grader Celsius i 15 minuter. I slutet av inkubationen, försiktigt pipettera proverna 10 gånger med en ny P1000 pipetter, och tillbaka rören till 24 grader Celsius i ytterligare 15 minuter.Vid slutet av inkuberingen pipettera försiktigt proverna igen innan de uppsamlade vävnaderna samlas upp genom centrifugeringen. Aspirera supernatanterna, och försiktigt resuspend varje pellet med en milliliter av DMEM/F12 medium. Centrifugera proverna tre gånger som bara visats, försiktigt resuspending varje pellet med en färsk milliliter medium efter varje centrifugering.Efter den sista centrifugeringen, resuspend pellets i 500 mikroliter av N2B27 medium kompletteras med en millimolar luciferin, och utsäde en gånger 10 till de sex cellerna från varje prov på enskilda poly-L-lysin-belagda glas botten rätter. Placera sedan plattorna i cellkulturinkubatorn i en timme. När cellerna har anslutit sig till skålen, tillsätt två milliliter färska N2B27 medium plus en millimolar luciferin till varje tallrik.För att visualisera luciferas reporteruttryck i NPC-dissociationkulturer väljer du oljebadsmålet och placerar provskålen på mikroskopstadiet. Visa fältet manuellt för att bestämma den bästa positionen för visning av cellerna, och fokusera på de celler av intresse. Klicka på Live för att förvärva testbilden, och använd programmet Flerdimensionell förvärv för att köra förvärvet av time-lapse genom tvådimensionell luminecis och förvärv av bright-field i 24 timmar.För att förbereda utveckla cortex skiva kulturer, en dag efter reporter injektion, skörda embryonala dagen 13,5 till 14,5 embryo hjärnor som visat, och placera skålen som innehåller hjärnorna på scenen i en fluorescens stereoskopiska mikroskop. Bekräfta att varje cortex uttrycker den injicerade fluorescerande reportern under lämpligt excitationsljus, och överför hjärnorna till en silikongummi skärbräda fylld med 30 milliliter DMEM/F12 medium, bubblade med 100%syregas. Använd en mikrokirurgisk kniv och fina tärna för att skära gränsen mellan den mediala och laterala delen av dorsala telencephalon, och separera vävnaden i två halvklot.Använd sedan kniven för att skära cortex som ränder för att få kortikala skivor, överföra skivor i medium från skärbrädan till en ny 35-millimeters Petriskål som de förvärvas. När alla skivor har samlats in, placera den skurna ytan av varje skiva på en kultur infoga som i ett glas botten skålen innehåller berikat medium, justera orienteringen av varje skiva med fina tämpningar vid behov. Ta sedan bort eventuellt överskottsmedium med en pipett och placera skålen i en multi-gasinkubator inställd på 40%syre, 5% koldioxid och 37 grader Celsius i 30 minuter.I slutet av inkubationen, tillsätt 300 mikroliter av berikat medium kompletterat med en millimolar luciferin till odlingsfatet. För att visualisera luciferas reporteruttrycket inom segmentkulturerna väljer du 40x-målet och placerar provskålen på mikroskopstadiet. Förvärva en testbild av fluorescensen, och ställ in position och fokusplanet till den region av intresse som finns under belysningen av lämpligt excitationsljus.Kör sedan time-lapse förvärvet av tredimensionell luminescens, fluorescens och ljusa fält förvärv för 24 timmar. För att övervaka promotorn aktivitet oscillerande genen Dll1, ubiquitinated luciferase, en destabiliserad luciferas reporter med en halveringstid på cirka 10 minuter, kan användas. Som en fluorescerande reporter kan luciferasreportern användas för att övervaka ett proteins uttrycksdynamik genom att vara sammansmält till den genkodande sekvensen av intresse.För att visualisera reporteruttryck på encellsnivå i vävnadskulturer kan reportergenen transiently transekteras till NPCs via in utero-elektroporering som visats. Dessutom mikroskop-baserade avbildning möjliggör förvärv av bright-field, fluorescens, och chemiluminescence bilder. Reportern av Dll1 promotor verksamhet uppvisar en oscillatory uttryck i NPCs härrör från telencephalon av Dll1 ubiquitinated F luciferase reporter möss, med destabiliserade luciferase reporter som anger en skarp upp och ner reglering av uttrycket av promotor verksamhet.I intilliggande förbättrade gröna fluorescerande protein-positiva celler som bär Hes1 reporter och mCherry-positiva celler uttrycker Dll1 protein reporter som fick kontakt med varandra under observation, Hes1 reporter uttryck verkar starta ca 60 minuter efter kontakt, vilket tyder på att tidsfördröjningen för överföring av Notch signalering mellan de intilliggande cellerna är ungefär en timme. Vidare, under signalöverföring, uppvisar Dll1 proteinuttryck en dynamisk flyttning. Vid förvärv av bioluminescensavbildning, håll mikroskoprummet helt mörkt, eftersom främmande ljus kan förhindra ett optimalt förvärv.Den senaste utvecklingen inom optogenetiken gör att vi kan kontrollera genuttryck med ljus. Med denna teknik kan vi samtidigt införa olika mönster av genuttryck och övervaka luciferas reporter svar.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Developmental Biology

Unit 2

Unit 1

Cell Signaling Pathways

Alternative Signaling Routes in Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Studera Wnt Signaling Under Mönstring av ledande Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Mätning och Real Time Visualisering av somatiska Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Stimulering av Notch signalering i mus osteoklastprekursorer

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flera Photon Time Lapse Imaging att visualisera utvecklingen i realtid: visualisering av migrera Neural Crest celler hos zebrafiskar embryon

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Realtid mätning av epiteliala barriären permeabilitet i Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Avbildning av muskel-senan morfogenes i Drosophila puppor

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levande cellen avbildning av kromosomsegregering under Mitos

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

Neurogenes med P19 embryonala cancerceller

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging och analys av vävnadsorientering och tillväxtdynamik i utvecklande Drosophila Epithelia under pupal stadier

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Realtidsavbildning av CCL5-inducerad migrering av periosteal skelettstamceller hos möss

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...