Name: culture methods to determine the limit of detection and survival in transport media of campylobacter jejuni in human fecal specimens
Uploaded: 2020-03-10T12:30:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens at JoVE.com

Disse undersøgelser blev finansieret af TECHLAB, Inc.

1. Optælling af Campylobacter i konstruerede humane fækale prøver
BEMÆRK: Alle trin udføres ved hjælp af steril teknik og materialer på en engangsbeskyttelsesplade i en desinficeret laminarflowsikkerhedshætte.
FORSIGTIG: Live Campylobacter er smitsomme og kan forårsage sygdom, herunder diarré. Bær handsker, en laboratoriekittel og sikkerhedsbriller, når du håndterer bakterier. Mundrør må ikke udgå. Bortskaf alt materiale, der har kontaktet bakterier i korrekte beholdere til biologisk fare.
<ol><li>Vækst i bestanden kultur af bakterier<ol>
<li>Opnå stammer af C. jejuni (ATCC-33560) eller C. coli (ATCC 33559) (Materialetabel) som tørrede eller frosne kulturer og rehydrere eller tø bakterier i henhold til producentens anvisninger. Stribe de rehydrerede bakterier på en Campylobacter-specifikkeagar plade til at starte kulturen. Pladen 48 timer ved 37 °C inkuberes i en anaerob krukke indeholdende et mikroabt gasgenererende brev.</li>
		<li>Den følgende dag forberedes 100 ml hjerne-hjerte-infusion (BHI) vækstbouillon indeholdende 0,5% trypticase, 0,5% proteasepepton, 0,0125% natriumpyruvat og 0,0125% natriumbisulfit.</li>
		<li>Fornedsiv BHI-bouillonen ved løst at dække kolben og anbringe den i en anaerob krukke med et brev, der vil producere et mikroaerofile miljø. Lad bouillon prereduc natten over ved 37 °C. På samme måde formindskes Campylobacter-specifikkeplader, der skal anvendes til kolonitællinger i trin 1.1.10 og 1.2.2.</li>
		<li>Da Campylobacter er følsomme over for luft, skal du samle alle materialer, før du vaccinerer bouillon og ikke dawdle mens håndtering kulturer. Når ferkulere er klar til at pode, tilsættes føtal kvægserum (FBS) til forreduceret bouillon til 4% af det samlede volumen. 1 ml forreduceret bouillon bevares for at fungere som blindi målinger af optisk massefylde ved 600 nm (OD600).</li>
		<li>3 ml forreduceret bouillon indeholdende FBS fjernes, og der anvendes bouillon til at skrabe startpladen, der indeholder Campylobacter-kulturen. Skrab forsigtigt pladen med en podeløkke, og overfør derefter bakteriegyllen til et sterilt rør.</li>
		<li>Innokulere 100 ml forreduceret bouillon med ca. 3 ml bakteriegylle og inkubermed moderat omrystning ved 115 omdrejninger i 37 °C i anaerob krukke indeholdende et gasgenererende brev.</li>
		<li>Overvåg bakteriens vækst spektrofotometrisk ved turbiditet ved OD600. Brug den reserverede bouillon som en tom. Hvis den anaerobe krukke åbnes, skal det gasproducerende brev udskiftes.</li>
		<li>Stop bouilloninkubationen efter 48−72 timer, eller før OD600-værdien når ~0,4. BEMÆRK: Denne OD600 svarer typisk til 107 til 108 CFU/ml. Se tabel 1 for at se typiske resultater.</li>
		<li>For at fastslå antallet af bakterier i ren stamkultur udføres otte 10 gange fortyndingsserier på 100 μL bouillon i 900 μL fortyndingsbuffer (Materialetabel). Efter at 100 μL bouillon er fjernet for den første fortynding, returneres kolben til anaerob krukke med frisk gasgenererende pose for at afvente brug i spiking fækal pool.</li>
		<li>Brug sterile plating perler til at sprede 100 μL af de 10-5 til 10-7 fortyndinger på duplikere prereduced Campylobacter-specifikke plader fra trin 1.1.3. Etiketplader med anvendt fortynding, anbring dem i en anden anaerob krukke med gasgenererende pose og inkuberes ved 37 °C i 48−72 timer. BEMÆRK: Se figur 1 og figur 2 for fortyndingsskema og fotografier af kolonier.</li>
		<li>Efter vækst skal du vælge pladen med mellem 30−300 kolonier at tælle. Udnyt optællingerne til at bestemme CFU/ml af bestanden bouillon kultur ved hjælp af Ligning 1: CFU/ml på lager = Gennemsnit # af kolonier på udvalgte (dublerede) analyseplader ▲ (ml belagt x fortynding af plade) [Ligning 1] 
</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse og optælling af konstruerede kliniske fækale prøver<ol>
<li>Umiddelbart efter at pladerne til analytiske tællinger er fremstillet i trin 1.1.10, foretages et andet sæt bouillonfortyndinger ved at forberede 10 serielle 2-folds fortyndinger fra bouillon og en Campylobacter-negativ fækal pool (NFP). For eksempel fremstilles den første fortynding ved at blande lige store mængder bouillon og NFP (f.eks. 0,1 ml hver) og foretage efterfølgende fortyndinger ved at overføre et udpeget volumen af bouillon og NFP-blanding til et rør med samme udpegede volumen NFP. Tilføj en kontrolplade med bouillon, der ikke indeholder Campylobacter tilføjet til fækal pool for at hjælpe med at identificereikke-Campylobacter kolonier.<ol>
<li>Gør NFP fra afidentificeret, diarré patient overvågning prøver eller sund donor afføring, der tidligere er blevet testet og fundet at være Campylobacter-negativved metoder såsom en Campylobacter enzym immunoassay og ved 16S rRNA qPCR.</li>
		</ol>
</li>
		<li>T-streak 10 μL af hver Campylobacter/afføringsfortynding på dublerede forreducerede Campylobacter-specifikkeagarplader. Pladerne anbringes i anaerob krukke med et gasgenererende brev og inkuberes ved 37 °C i 48 ± 2 timer.</li>
		<li>Undersøg de stribede plader visuelt for kolonier, der ligner dem fra rene Campylobacter kulturer. BEMÆRK: Den tredje kvadrant er typisk der, hvor disse vil blive fundet. Se figur 1 og figur 2 for fortyndingsskema og billeder af kolonistørrelse, farve og morfologi.</li>
		<li>Vælg flere Campylobacter-lignendekolonier og Gram plet. Ved hjælp af mikroskopi med en olie nedsænkning linse, undersøge en tyndt stribet område for gram-negative buede, spiral, eller cigar-formede små bakterier. BEMÆRK: Campylobacter er Gram-negative og kræver grundlæggende fuchsin som en modplet (i stedet for den typiske safranin) skal visualiseres præcist. Klassiske mågevingede bakterier kan ses, men er ikke et krav. Se figur 2 for repræsentativ mikrograf.</li>
		<li>Hvis en af de dublerede plader ved en bestemt fortynding har 1 eller flere Campylobacter kolonier til stede, mener, at fortynding fækal-kultur positiv.</li>
		<li>Overvej den sidste fortynding, der indeholder en synlig Campylobacter-lignendegram-negative koloni grænsen for kultur detektion. Brug ligning 2 til at beregne CFU/ml af den positive fortynding i konstrueret klinisk fækal prøve: CFU/ml i fækal prøve = Analytisk CFU/ml ▲ Fortynding med sidste positive koloni [Ligning 2] BEMÆRK: Se tabel 2 for at få typiske resultater.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Levedygtighed Bestemmelse af Campylobacter Lagret i Transport Media
<ol><li>Der blandes 1 ml Campylobacter-bouillonkultur (trin 1.1.8) med 1 ml NFP, og forbered 10 dobbelt dobbelt seriel fortyndinger i NFP. Yderligere fortynde hver fortynding yderligere 1:4 i Cary-Blair medier, ligesom en klinisk prøve udarbejdet i transportmedier behandles.</li>
	<li>De 20 fortyndingsrør og en negativ kontrol i Cary-Blair-mediet opbevares i udjævnede rør ved 2-8 °C i 96 timer, og kolonier tælles fra hver fortynding, der forekommer ved tid nul og hver 24. For koloni optælling, prøve bouillon: fækale rør og setup fækal kultur til koloni optælling af hver fortynding, i to eksemplarer.</li>
	<li>Hver dagsplade 10 μL portioner af fækale fortyndinger på Campylobacter-selektiv agar og inkubering ved 37 °C i 48 timer, som beskrevet ovenfor i trin 1.1.9−1.2.7.</li>
	<li>Der udføres et samtidigt analytisk kimtal for den oprindelige bakteriebestand (fra trin 1.1.8 eller en nydyrket bouillonbestand) som beskrevet ovenfor (trin 1.1.9−1.1.11). CFU/ml for den oprindelige bakteriestamme (ligning 1) beregnes for at beregne koncentrationen af bakterier i transportmedietfækalprøven og dens fortyndinger (ligning 2).</li>
</ol>3. Ikke-kulturanalyser til kontrol af kulturresultater
<ol><li>Brug et enzymimmunassay (VV), der giver minimale falske positive resultater12 og udfør er i overensstemmelse med vejledningen til indsætning af emballagen for at verificere kulturresultaterne.</li>
	<li>Brug en molekylær analyse, der kan detektere 16S rRNA-genet eller et andet gen af en bred vifte af Campylobacter arter13. Bekræft, at den molekylære analyse reagerer med arter som C. upsaliensis eller C. lari, der vokser dårligt på standard antibiotikaholdige agar14. Følg producentens anvisninger for ekstraktion af DNA fra fækale prøver og udførelse af testen. BEMÆRK: Tovejs DNA-sekvensering af 16S amplicon kan anvendes til at bekræfte arten af Campylobacter i en positiv prøve. Artsspecifik PCR (se tabel 3 for målgener) kan også anvendes til at identificere arter, der er til stede i diske eller positive prøver15.</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Annual Summaries of Foodborne Outbreaks Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html">https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html</a> (2018)</li><li>Kaakoush, N. O., Casta&#241;o-Rodr&#237;guez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Epidemiology+of+Campylobacter+Infection.">Global Epidemiology of Campylobacter Infection.</a> Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 687-720 (2015).</li><li>Pitkanen, T. a., H, M. L., Rose, J. B., Jimenez-Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global Water Pathogen Project. , (2017).</li><li>Fitzgerald, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+Evaluation+of+Clinical+Diagnostic+Methods+for+Detection+and+Isolation+of+Campylobacter+spp.+from+Stool.">Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1209-1215 (2016).</li><li>Kirkpatrick, B. D., Tribble, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+human+Campylobacter+jejuni+infections.">Update on human Campylobacter jejuni infections.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 27 (1), 1-7 (2011).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+Trends+of+Infection+with+Pathogens+Transmitted+Commonly+Through+Food+-+Foodborne+Diseases+Active+Surveillance+Network,+10+U.S.+Sites,+2006-2013.">Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006-2013.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 63, 328-332 (2014).</li><li>Jaime, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+upsaliensis:+Another+Pathogen+for+Consideration+in+the+United+States.">Campylobacter upsaliensis: Another Pathogen for Consideration in the United States.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (11), 59-60 (2002).</li><li>Bullman, S., O'Leary, J., Corcoran, D., Sleator, R., Lucey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-based+detection+of+non-culturable+and+emerging+campylobacteria+in+patients+preseting+with+gastroenteritis.">Molecular-based detection of non-culturable and emerging campylobacteria in patients preseting with gastroenteritis.</a> Epidemiology and Infection. 140, 684-688 (2012).</li><li>Giltner, C. L., Saeki, S., Bobenchik, A. M., Humphries, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Campylobacter+Antigen+by+Enzyme+Immunoassay+Leads+to+Increased+Positivity+Rates.">Rapid Detection of Campylobacter Antigen by Enzyme Immunoassay Leads to Increased Positivity Rates.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 618-620 (2013).</li><li>M'ikanatha, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+stool+specimens+for+Campylobacter+spp.,+Pennsylvania,+USA.">Culturing stool specimens for Campylobacter spp., Pennsylvania, USA.</a> Emerging Infectious Disease. 18, 484-487 (2012).</li><li>Al Amri, A., Senok, A. C., Ismaeel, A. Y., Al-Mahmeed, A. E., Botta, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+direct+identification+of+Campylobacter+spp.+in+human+and+chicken+stools.">Multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools.</a> Journal of Medical Microbiology. 56 (10), 1350-1355 (2007).</li><li>Buss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+culture+fails+to+correctly+detect+Campylobacter+in+30%+of+positive+patient+stool+specimens+compared+to+non-cultural+methods.">Campylobacter culture fails to correctly detect Campylobacter in 30% of positive patient stool specimens compared to non-cultural methods.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38, 1087-1093 (2019).</li><li>Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Multiplex+Real-Time+PCR+Assay+for+Detecting+Major+Bacterial+Enteric+Pathogens+in+Fecal+Specimens:+Intestinal+Inflammation+and+Bacterial+Load+Are+Correlated+in+Campylobacter+Infections.">Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).</li><li>Couturier, B. A., Hale, D. C., Couturier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Campylobacter+upsaliensis+with+Persistent+Bloody+Diarrhea.">Association of Campylobacter upsaliensis with Persistent Bloody Diarrhea.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3792-3794 (2012).</li><li>Chaban, B., Musil, K. M., Himsworth, C. G., Hill, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cpn60-Based+Real-Time+Quantitative+PCR+Assays+for+the+Detection+of+14+Campylobacter+Species+and+Application+to+Screening+of+Canine+Fecal+Samples.">Development of cpn60-Based Real-Time Quantitative PCR Assays for the Detection of 14 Campylobacter Species and Application to Screening of Canine Fecal Samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 3055-3061 (2009).</li><li>Allos, B., Blaser, M. J., Mandell, G. L., Bennett, J. E., Dolin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed. , 2793-2802 (2009).</li><li>Anderson, N. W., Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+BD+MAX+Enteric+Bacterial+Panel+to+Routine+Culture+Methods+for+Detection+of+Campylobacter,+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+(O157),+Salmonella,+and+Shigella+Isolates+in+Preserved+Stool+Specimens.">Comparison of the BD MAX Enteric Bacterial Panel to Routine Culture Methods for Detection of Campylobacter, Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157), Salmonella, and Shigella Isolates in Preserved Stool Specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1222-1224 (2014).</li><li>Wasfy, M., Oyofo, B., Elgindy, A., Churilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+preservation+media+for+storage+of+stool+samples.">Comparison of preservation media for storage of stool samples.</a> Journal of Clinical Microbiology. 33 (8), 2176-2178 (1995).</li><li>Bess&#232;de, E., Delcamp, A., Sifre, E., Buissonniere, A., M&#233;graud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Methods+for+Detection+of+Campylobacters+in+Stool+Samples+in+Comparison+to+Culture.">New Methods for Detection of Campylobacters in Stool Samples in Comparison to Culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 49 (3), 941-944 (2011).</li><li>Bess&#232;de, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Diagnostic+Accuracy+of+Two+Immunochromatographic+Tests+Detecting+Campylobacter+in+Stools+and+Their+Role+in+Campylobacter+Infection+Diagnosis.">Evaluation of the Diagnostic Accuracy of Two Immunochromatographic Tests Detecting Campylobacter in Stools and Their Role in Campylobacter Infection Diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), (2018).</li><li>Shane, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Diseases+Society+of+America+Clinical+Practice+Guidelines+for+the+Diagnosis+and+Management+of+Infectious+Diarrhea.">Infectious Diseases Society of America Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Infectious Diarrhea.</a> Clinical Infectious Diseases. 65 (12), 1963-1973 (2017).</li><li>Toledo, Z., Simaluiza, R. J., Astudillo, X., Fern&#225;ndez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+and+antimicrobial+susceptibility+of+thermophilic+Campylobacter+species+isolated+from+healthy+children+attending+municipal+care+centers+in+Southern+Ecuador.">Occurrence and antimicrobial susceptibility of thermophilic Campylobacter species isolated from healthy children attending municipal care centers in Southern Ecuador.</a> Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 59, 77-77 (2017).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symptomatic+and+asymptomatic+Campylobacter+infections+associated+with+reduced+growth+in+Peruvian+children.">Symptomatic and asymptomatic Campylobacter infections associated with reduced growth in Peruvian children.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (1), 2036 (2013).</li></ol>

Forfatterne er ansatte i TECHLAB, Inc., der producerer QUIK CHEK™ kit, der anvendes som sammenligningsmateriale i denne artikel.

De kulturmetoder, der er beskrevet her, er bygget på enkle, udbredte teknikker og materialer, der findes i de fleste laboratorier10. Det er kombinationen af analytiske og konstruerede prøver, der giver nye oplysninger om en klinisk relevant detektionstærskel for fækale kulturer. Derudover styrker afgørelsen af kulturresultater med 5 separate analyser konklusionerne om, at Campylobacter fækal kultur fejlidentificerer en betydelig del af patientprøver. VI og molekylære analyser er nyttige som kontroller, fordi de hver især er baseret på et andet princip (antigeninteraktion med antistof vs. DNA-forstærkning) og, hvad der er vigtigt, ikke er afhængige af bakteriers levedygtighed. Bemærk, at Den EIA-analyse, der anvendes til disse undersøgelser, er godt valideret og har vist sig at være helt enig i 4 molekylære test12.
Kultur Campylobacter spp. er særligt generende, med følsomhed rapporteret til at variere fra 60-76%19,20, og som det fremgår af sin ~ 30% sats for manglende påvisning af sande-positive prøver her. Personalet kan forvente, at kontrol VV og molekylære tests ofte vil give positive resultater, når kulturdata er negative.
Det mest kritiske skridt i protokollen er identifikationen af pin-point kolonier blandt konkurrerende fækal flora. Det er ikke usædvanligt, da fortyndinger i nærheden af detektionstærsklen, at have skøn over antal kolonier, der veksler mellem nul og ikke nul (f.eks. 2, 0, 1, 0, 0). Det er vigtigt at erkende, at kulturtærskler vil være en række koncentrationer, ikke en specifik CFU/ml. Ikke desto mindre, skønpå ~ 1 x 106 CFU / ml afføring som en nedre grænse for dyrkning afsløring sammenligner godt med rapporter om, at smittede mennesker kaste 106 til 109Campylobacter per gram afføring21. Ændringer i antibiotika eller agar plader og variationer uundgåelige i de enkelte fækale prøver vil uden tvivl ændre tærskelværdier. Denne protokol skulle muliggøre forbedringer i vækstmediet.
Disse første oplysninger om en grænse for dyrkningsdetektion gør det muligt at fastsætte klinisk relevante tærskler for diagnostiske test og lægger det mikrobiologiske fundament, der er nødvendigt for at løse uundersøgte spørgsmål om ikke-symptomatisk transport22,23 af Campylobacter, eller hvis bakteriel belastning korrelerer med symptomer eller alvorlige sequelae.

Usa Centers for Disease Control (CDC) offentliggjorde for nylig, at Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) overvågningsprogram rapporterede 9.723 tilfælde af laboratoriediagnosticerede Campylobacter infektioner i 20181. Dette repræsenterer en stigning på 12 % i Campylobacter-sagsrapporter i 2015−20171. På verdensplan, Campylobacter spp. er blandt de mest almindelige bakterielle tarminfektioner2. Ikke desto mindre er antallet af Campylobacter-baseredetarmsygdomme, der opstår hvert år, mistænkt for at være underrapporteret3. Denne undervurdering er forudsigelig, fordi de fleste patienter kan komme sig med kun moderat ubehag og ingen medicinsk behandling. Men for patienter med mere alvorlige symptomer, eller som har en højere risiko for alvorlig sygdom, og som derefter søger lægehjælp, afføring kultur er den mest almindelige metode til at vurdere, om Campylobacter er patogen, der forårsager deres nød4.
For Campylobacter spp., afføring kultur er særligt generende. De mest almindelige patogene organismer, C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis, og C. lari, er mikroaerofile5. Det betyder, at bakterierne vil dø tilfældigt, ukendte satser, når de udsættes for luft. Tiden mellem prøveindsamling og kulturopsætning bliver således en ukontrolleret variabel i evnen til at detektere levedygtig campylobacter spp. af kultur.
For direkte kultur af fækale prøver, den langsomme vækst i Campylobacter er også et problem. Campylobacter kolonier er meget små, selv efter 48 h inkubation og kan nemt dækkes af konkurrerende organismer i fækal matrix. Plader, der indeholder antibiotika, som de fleste stammer af C. jejuni og C. coli er resistente er meget udbredt, som antibiotika hæmmer væksten af mange (men ikke alle) konkurrerende fækale bakterier, så bedre visualisering af Campylobacter kolonier 6. Men andre Campylobacter arter som C. lari og C. upsaliensis er følsomme over for nogle af disse antibiotika, og enten vokse dårligt eller slet ikke. Dette bidrager til underrapportering af Campylobacter infektioner fra disse antibiotika-følsomme arter7.
Der er en tredje grund til, at en kultur for Campylobacter kan være unøjagtig. Bakterierne, når de er stressede, kan forblive levedygtige, men kan blive "ikke-skyldmes"8. Dette betyder pr. definition, at kulturen ikke registrerer de bakterier, der findes i prøven. Hvor ofte dette sker, er ikke kendt8.
I betragtning af disse potentielle problemer med kultur, vi brugte flere sammenligning referencemetoder, således at defekte kultur resultater ikke gøre en enkelt komparator assay synes unøjagtige9. De anvendte dyrkningsmetoder (f.eks. 
De kulturprotokoller, der er beskrevet her, blev udviklet, fordi det laveste antal Campylobacter jejuni, der kunne påvises af kultur i menneskelig afføring, ikke var kendt. Selv om der er offentliggjort skøn for antallet af kolonidannende enheder (CFU) til stede i fjerkræ afføring11, disse resultater kan ikke sidestilles med menneskelig afføring, som Campylobacter spp. er commensals i kyllinger, og ikke forårsager diarré. Denne grundlæggende information er nødvendig for at fastslå antallet af Campylobacter bakterier, der vil producere symptomer på gastroenteritis hos mennesker og til at sammenligne virulens mellem stammer eller arter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anaerobic 3.5L Jar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HP0031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>AG701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Protease Peptone</td>
			<td>Life Technologies Corp</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fuchsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B12544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase Peptone</td>
			<td>Life Technologies Corp</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. coli Type strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>33559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. jejuni Type strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>33560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CampyGen gas generating system sachet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CN0025A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campylobacter QUIK CHEK</td>
			<td>TechLab, Inc.</td>
			<td>T5047 / T31025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary-Blair transport medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-005-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coli Roller Sterile plating beads</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Buffer</td>
			<td>Anaerobe Systems</td>
			<td>AS-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc</td>
			<td>SFBM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>243973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9090-0460</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture methods to determine the limit of detection and survival in transport media of campylobacter jejuni in human fecal specimens

En kultur fra menneskelig afføring til diagnosticering af Campylobacter-baseredetarmsygdom tager flere dage, en ventetid, der skatter styrke af lægen og patienten. En kultur er også tilbøjelig til falske negative resultater fra tilfældigt tab af levedygtighed under prøvehåndtering, overvækst af andre fækale flora, og dårlig vækst af flere patogene Campylobacter arter på traditionelle medier. Disse problemer kan forvirre kliniske beslutninger om patientbehandling og har begrænset området fra at besvare grundlæggende spørgsmål om Campylobacter vækst og infektioner. Vi beskriver en procedure, der anslår den nedre grænse for bakterietal, der kan påvises ved en kultur, og en metode til kvantificering af C. jejunis overlevelse i medier, der anvendes til transport af denne skrøbelige organisme. Kendskab til disse oplysninger, bliver det muligt at fastsætte klinisk relevante detektiontærskler for diagnostiske tests og løse uundersøgte spørgsmål om, hvorvidt ikke-symptomatisk kolonisering er udbredt, hvis co-infektion med andre enteriske patogener er fælles, eller hvis bakteriel belastning korrelerer med symptomer eller alvorlige sequelae. Undersøgelsen omfattede også test af 1.552 prospektivt indsamlet patient diarré fækal prøver, der oprindeligt blev klassificeret af konventionel kultur og yderligere testet af et nyt enzym immunoassay. Positive og discrepant prøver blev derefter screenet af fire molekylære metoder til at tildele sand-positiv eller sand-negativ status. De fem ikke-kulturmetoder viste fuldstændig enighed om alle 48 positive og ufortensprøver, mens de ikke-kultiverede 14 (28 %). De prøver, der fejlagtigt blev identificeret ved dyrkning, omfattede 13 falske negative og 1 falsk positiv prøve. Denne grundlæggende protokol kan bruges med flere Campylobacter spp. og vil gøre det muligt antallet af Campylobacter bakterier, der producerer symptomer på gastroenteritis hos mennesker, der skal bestemmes, og for prævalens satser, der skal opdateres.

Identifikation Campylobacter spp. kolonier blandt konkurrerende fækale flora kræver ivrigsyn og betydelig dømmekraft. Det laveste antal kolonier, der kan påvises ved dyrkning, er ikke undersøgt, selv om prøver fra patienter er blevet anslået til at rumme 106−109 CFU/ml16,17. Patientprøver kan dog ikke anvendes kvantitativt, da der ikke findes nogen uafhængig metode til at fastsætte nøjagtige bakterietal. For at overvinde denne begrænsning foretages der to samtidige målinger med en bakteriebestand. En test anvendes til visuel påvisning af Campylobacter kolonier fra serielle fortyndinger af bestanden bakterier i en fækal matrix, simulerekliniske prøver; den anden anvendes analytisk til at kvantificere cfu/ml, der findes i den bakteriebestand, der anvendes til spiking (figur 2A).
Registreringstærsklerne for Campylobacter vil ikke blive defineret værdier. Dette kan forventes, fordi hver fækal matrix er kompleks og unik, og væksten af bakterier er variabel. Et vigtigt parameter for succes er at identificere de lokalisere størrelse kolonier blandt de konkurrerende fækale flora. Figur 2C og figur 2Dindeholder en repræsentativ plade med spidsafføringskultur . Den negative kontrol plade uden tilsat Campylobacter er vigtigt at hjælpe med at identificere andre fækale flora. Gram farvning mange kandidater også tog øjet til at skelne de korrekte blanke kolonier og den mellemliggende lyserøde farve fuchsin-farvede gram-negative bakterier og bekræfter morfologi af bakterier i de udvalgte kolonier (Figur 2B). Syv uafhængige forsøg blev udført ved hjælp af 5 C. jejuni og 2 C. coli bouillon, og gav tærskler, der overlappede og strakte sig fra 0,3−5 x 106 CFU/ml. Se tabel 2 for at få oplysninger om typiske data. Detektionsgrænserne var i gennemsnit 2 x 106 for C. jejuni og 1,2 x 106 CFU/ml for C. coli. Dette indikerer, at kulturen sandsynligvis kan detektere ~1−2 x 106C. jejuni eller C. coli pr. gram fækal prøve på standard antibiotisk holdige Campylobacter-specifik agar, der anvendes af mange kliniske laboratorier. Der er flere specialiserede agarer med forskellige antibiotika, der kan give forskellige tærskler for koloni detektion. De metoder, der er beskrevet her, bør tilskynde til mere kvantitative og sammenlignende undersøgelser for at forbedre kulturens nøjagtighed og udvide de nye mediers alsidighed. For eksempel blev 152 kolonier talt på den første 10-5 plade og 144 kolonier på den anden 10-5 plade. Gennemsnittet mellem de to plader er 148 kolonier. Pladerne blev podet med 0,1 ml (100 μL) på 10-5 fortynding, hvilket ved ligning 1 svarer til 148 x 106 (14,8 x 107)CFU/ml i den rene kulturbestand. Når fækal fortyndinger blev foretaget, blev kulturen spiked i negativ fækal pool på en 1:1 forhold. Ved ligning 2svarer det første punkt (plade "a") på fækalkurven derfor til 14,8 x 107 divideret med 2 og er lig med 7,4 x 107 CFU/ml. Dette "a" rør bruges til at lave yderligere 9 fortyndinger. I figur 1er den sidste fortynding med en synlig gram-negativ koloni med Campylobacter-lignendemorfologi på pladen "g". Dette svarer til 1,1 x 106 CFU/ ml for fækal kultur tærskel for detektion i dette eksempel.
Selvom vedvarende levedygtighed er nøglen til kulturens nøjagtighed, er det problematisk at bevare Campylobacters levedygtighed under håndtering og forsendelse af prøver fra patienter til klinikker til referencelaboratorier. Typisk opbevaring er at opbevare prøver i almindelige nøddebere med lufteksponering og uden særlig atmosfære. Prøver i transportmedier (også kendt som konserverede prøver) menes at have bedre overlevelse, men der er få rapporter, der giver kvantitative data18.
Kombinationen af ovennævnte analyse- og konstruerede prøvemetoder blev igen anvendt til at opnå levedygtighed og overlevelsestid skønnene over C. jejuni i transportmedier. En bakteriebouillon blev brugt til at forberede ti dublerede 2-fold til 1024-fold prøve fortyndinger i fækal matrix. Den oprindelige bouillon blev fundet ved de analytiske tal at have en koncentration på 4,8 x 107 CFU / ml. På plader lavet på dag 0 blev C. jejuni påvist (2 dage senere) på pladen stribet med den 32-foljering, svarende til 1,5 x 106 CFU/ml. Men på pladerne lavet efter nedkøling af Cary Blair fækalprøven i 24 timer, kun den 2-fold fortynding (svarende til 2,4 x 107 CFU / ml) voksede synlige kolonier. Der blev ikke set yderligere tab af levedygtighed ud til 96 timer, hvor undersøgelsen blev stoppet. Dette tab af rentabilitet svarer til en 16-fold (94%) tab af culturable organismer på mindre end 24 timer og indikerer, at selv med køling, afføring i Cary Blair medium med mindre end 107 CFU/ml C. jejuni kan blive savnet af kultur.
I modsætning til kulturresultaterne påviste VV'en tilstedeværelsen af C. jejuni ved den 256 gange dobbelte fortynding på det første tidspunkt og i hele testperioden på 4 dage. C. jejuni detektionstærsklen for denne EIA ved hjælp af spidse fækale prøver er 8,4 x 104 CFU/ml. Denne tærskel ligger under fecalkulturens og giver mulighed for en mere følsom og stabil påvisning af C. jejuni.
At teste evnen af kultur til at opdage Campylobacter spp. i en egentlig klinisk indstilling, 1.552 kliniske afføring prøver var karakteriseret ved 6 procedurer: fækal kultur, en ny immunoassay for Campylobacter spp., og 4 molekylære metoder. Alle prøver blev prospektivt indsamlet og i første omgang klassificeret efter konventionel kultur på 3 laboratorier i USA, og derefter krydstjekket af VVM. Alle dyrkningspositive eller EIA/kultur-discrepant prøver blev derefter screenet af de molekylære metoder12. Prøverne fik tildelt en sand-positiv eller sand negativ status baseret på resultaterne af de 5 ikke-dyrkningsmetoder. De fem ikke-kulturmetoder viste fuldstændig enighed om alle 48 positive og ufortensprøver, mens kulturfejl identificerede 14 (28 %). De prøver, der fejlagtigt blev identificeret ved dyrkning, omfattede 13 falske negative og 1 falsk positiv prøve.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60457/60457fig1a.jpg"> Figur 1: Ordning for samtidig fremstilling af analytiske og spidse fækale prøver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60457/60457fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60457/60457fig2a.jpg"> Figur 2: Identifikation af C. jejuni kolonier fra rene og fækale kulturer. (A) Fotografi af C. jejuni kolonier fra ren bakteriekultur efter 72 timers inkubation. (B) Gram plet af C. jejuni fra ren bakteriekultur, olie-nedsænkning 400x forstørrelse. (C) Fotografi af C. jejuni-positive spidse fækale kultur efter 48 h inkubation. (D) Udvidet areal i rubrik i (C), 10x forstørrelse. Hvide pile angiver pin-point størrelse gram-negative C. jejuni kolonier. Den sorte pilespids angiver en koloni, der er lidt større, gram-positiv, og ikke C. jejuni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60457/60457fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Kulturer</td>
			<td>OD600 @ T0</td>
			<td>OD600 @ T Endelig1</td>
			<td>Endelig CFU/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. jejuni</td>
			<td>0.146</td>
			<td>0.321</td>
			<td>1,28 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. coli</td>
			<td>0.245</td>
			<td>0.508</td>
			<td>4,50 x 108
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Typisk vækst og CFU/ml af C. jejuni- og C. coli-bestandene. 1C. jejunikulturen blev stoppet efter 48 timers inkubation. C. coli-kulturen blev stoppet efter 54 timers inkubation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Fortyndingsrør til fækal udstilsprøve</td>
			<td>Antal Campylobacter-lignendekolonier</td>
			<td>Antal Gram-negative kolonier1</td>
			<td>Kultur positiv?</td>
			<td>Beregnet CFU/ml af spids prøve</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="10">
C. jejuni (1,28 x 108 CFU/ml lager)</td>
			<td>(2 gange) en</td>
			<td>Tæt</td>
			<td>2.
</td>
			<td>Ja</td>
			<td>6.40 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4 gange) b</td>
			<td>20+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Ja</td>
			<td>3,20 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(8 gange) c</td>
			<td rowspan="3">4-10</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Ja</td>
			<td>1,60 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(16 gange) d</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Ja</td>
			<td>8.00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(32 gange) e</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Ja</td>
			<td>4,00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(64 gange) f</td>
			<td rowspan="4">1-3</td>
			<td>1 af 2</td>
			<td>Ja</td>
			<td>2.00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(128 gange) g</td>
			<td>2 af 3</td>
			<td>Ja</td>
			<td>1,00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>
3(256 gange) h
</td>
			<td>1 af 2</td>
			<td>Ja</td>
			<td>5.00 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(512 gange) i</td>
			<td>0 af 1</td>
			<td>Nej</td>
			<td>2,50 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(1024 gange) j</td>
			<td>0</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Nej</td>
			<td>Nfp</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="10">
C. coli (4,50 x 108 CFU/ml lager)</td>
			<td>(2 gange) en</td>
			<td rowspan="2">Tæt</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Ja</td>
			<td>2,25 x 108
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4 gange) b</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Ja</td>
			<td>1,13 x 108
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(8 gange) c</td>
			<td>50+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Ja</td>
			<td>5,63 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(16 gange) d</td>
			<td>30+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Ja</td>
			<td>2,81 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(32 gange) e</td>
			<td>10+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Ja</td>
			<td>1,41 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(64 gange) f</td>
			<td rowspan="2">3-8</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Ja</td>
			<td>7.03 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(128 gange) g</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Ja</td>
			<td>3,52 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>
3(256 gange) h
</td>
			<td rowspan="2">1-3</td>
			<td>1 af 3</td>
			<td>Ja</td>
			<td>1,76 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(512 gange) i</td>
			<td>0 af 1</td>
			<td>Nej</td>
			<td>8,79 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(1024 gange) j</td>
			<td>0</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Nej</td>
			<td>Nfp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Typisk antal kolonier på plader af spidse fækale prøver. 1 Gram negative kolonier blandt Campylobacter-lignendekolonier, 2nd = ikke bestemt, 3Data i fed type indikerer sidste positive fortynding.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Arter</td>
			<td>Genmål</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. jejuni</td>
			<td>hipO delte et sted</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. coli</td>
			<td>cadF (cadF)</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. upsaliensis</td>
			<td>kr.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. lari (C. lari)</td>
			<td>kr.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. helveticus</td>
			<td>kr.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. foster</td>
			<td>kr.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. hyointestinalis</td>
			<td>kr.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. concisus</td>
			<td>kr.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Gener, der er nyttige til påvisning af individuelle Campylobacter arter qPCR.

Watch this Scientific Journal Video about Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens at JoVE.com

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Selv om afføringskultur for Campylobacter er upræcis, betragtes den stadig som guldstandarden for identifikation. Metoder til bestemmelse af detektionsgrænsen og overlevelse i transportmedier af C. jejuni i human afføring er beskrevet og sammenlignet med en ny immunassay med bedre nøjagtighed.

Kultur metoder til at bestemme grænsen for påvisning og overlevelse i Transport Media af Campylobacter Jejuni i Human Fecal Prøver

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Vanskeligheden ved Campylobacter kultur har hæmmet grundlæggende undersøgelser såsom hvor få bakterier er nødvendige for at producere sygdom. Disse kombinerede analytiske og konstruerede prøver, der anvendes her, kan løse dette problem. Denne teknik gør det muligt at korrelere kliniske relevante patientsymptomer med et positivt fækalt kulturresultat og for første gang et faktisk antal bakterier.Lære, hvor mange bakterier korrelerer med sygdom vil give diagnostik, et vigtigt mål for påvisning og en solid metode til at sammenligne virulens mellem stammer eller arter af Campylobacter. Campylobacter kultur er ligetil, men det kræver hurtig og organiseret forberedelse til at opretholde kvantitative levedygtighed. Der er også behov for betydelig dømmekraft for at identificere Campylobacter kolonier blandt konkurrerende fækale flora på en plade.Før du starter en C.jejuni eller C.coli kultur, sat på handsker, en laboratoriekittel, og sikkerhedsbriller, og placere en engangs beskyttende ark i en desinficeret laminar flow sikkerhed hætte. Ved hjælp af steril teknik streak hver hydreret eller optøet bakterielager på en Campylobacter specifikke agar plade og placere pladen ved 37 grader Celsius i 48 timer i en anaerob krukke, der indeholder en mikroaerobe atmosfære gas genererer brev. 24 timer senere, løst dække en kolbe af BHI bouillon og placere kolben i en ny anaerob krukke med et brev, der vil producere en mikroaerobe miljø for en overnatning inkubation på 37 grader Celsius.Den næste morgen bruge tre milliliter af den fornedrerede bouillon og en podning loop til at skrabe starteren plade Campylobacter kultur. Gyllen overføres til et sterilt rør, og de resterende 97 milliliter af den fornedrerede bouillon med de tre milliliter skrabet gylle anbringes. Placer bouillon i krukken med gasposen og inkuber kulturen ved 37 grader Celsius og 115 omdrejninger i minuttet på en rystende inkubator i 48 til 72 timer, indtil kulturen når en optisk tæthed ved 600 nanometer på højst 4.For at fastslå antallet af bakterier i denne rene bestand kultur udføre otte 10-fold fortynding serie af 100 mikroliter bouillon i 900 mikroliter af fortynding. Brug sterile plating perler, spredes 100 mikroliter af den ene gange 10 til den negative femtedel til 10 til de negative syvende fortyndinger på duplikerede pre-reduceret Campylobacter specifikke plader og etiket plader med fortynding koncentration, før du placerer pladerne i en anden anaerobe krukke med en gasgenererende pose i 48 til 72 timer ved 37 grader Celsius. Ved afslutningen af vækstperioden skal du vælge plader med mellem 30 og 300 kolonier til optælling.Efter optælling bruge tællerne til at bestemme kolonien danner enheder pr milliliter af bestanden bouillon kultur i henhold til formlen. Det er afgørende, at den analytiske koloni tæller er korrekte, da dette understøtter alle de trin ved hjælp af spidse fækal pool. Umiddelbart efter plating for at tælle som påvist, bland lige store mængder bouillon og Campylobacter negativ fækal pool og gøre ni efterfølgende togange fortyndinger i negativ fækal pool, tilføje en kontrol plade med bouillon indeholder ingen Campylobacter til fækal pool for at hjælpe med at identificere de ikke-Campylobacter kolonier.Streak 10 mikroliter af hver Campylobacter afføring fortynding på duplikerede pre-reduceret Campylobacter specifikke agar plader og inkubere pladerne i anaerob krukke med en gasgenererende pose ved 37 grader Celsius i ca 48 timer. I slutningen af inkubationen visuelt undersøge stribede plader for kolonier, der ligner dem fra ren Campylobacter kulturer. For at bekræfte, at kolonierne er faktisk Campylobacter vælge flere Campylobacter som kolonier for gram farvning og visualisere en tyndt stribet område ved lys mikroskopi ved hjælp af en olie nedsænkning linse til at identificere gram-negative buede, spiral, eller cigar formet små bakterier.En negativ kontrol plade uden tilsat Campylobacter er vigtigt for at hjælpe med at identificere andre fækale flora. Overvej den sidste fortynding, der indeholder en visuel Campylobacter-lignende gram-negativ koloni grænsen for kultur detektion. Og brug formlen til at beregne kolonien danner enheder pr. milliliter af den positive fortynding i konstrueret klinisk fækal prøve.At bestemme levedygtigheden af Campylobacter lagret i transport medium mix en milliliter Campylobacter bouillon kultur med en milliliter negativ fækal pool og forberede 10 dobbelte dobbelte dobbelte seriel fortyndinger i negativ fækal pool. Yderligere fortynde hver fortynding på en yderligere en til fire forholdet i Cary-Blair medium og gemme de 20 fortynding rør og en negativ kontrol i Cary-Blair medium i cap rør på to til otte grader Celsius i 96 timer. Starter ved tid nul og hver 24 timer derefter streak 10 mikroliter aliquots af hver fortynding på Campylobacter selektiv agar plader og inkubere pladerne ved 37 grader Celsius i 48 timer.Da der ikke findes nogen uafhængig metode til at fastslå nøjagtige bakterietal fra patientprøver, kan der foretages to samtidige målinger med et rent bakterielager. En test anvendes til visuel påvisning af Campylobacter kolonier fra serielle fortyndinger af bestanden bakterier i en fækal matrix, simulerer kliniske prøver. Den anden test anvendes analytisk, kvantificere kolonien danner enheder pr milliliter til stede i samme bakterier bestand kultur, der anvendes til spiking.Et centralt parameter for succes er at identificere de lokalisere mellemstore kolonier blandt de konkurrerende fækale flora, som illustreret ved denne repræsentative plade af spidsafføring kultur. Her kan typiske data fra syv uafhængige eksperimenter observeres. Det er ikke nok blot at identificere kolonier, der ligner Campylobacter inden for fækale kulturer.Alle kolonier skal bekræftes med gram plet eller mere avancerede metoder. Vi bruger et enzym immunoassay, der er mere præcis end kultur til at opdage ualmindelige arter som C.upsaliensis eller C.lari, som vokser dårligt på standard antibiotika, der indeholder agar. Denne teknik danner et nødvendigt grundlag for at studere ting som den ikke-symptomatisk transport af Campylobacter, og om høje bakteriebelastninger sætter en patient i højere risiko for alvorlige konsekvenser af Campylobacter infektion.Bær altid personlige værnemidler, når du arbejder med bakterier, som ofte er smitsomme og kan være farlige, og med den negative fækale pulje, som kan indeholde ukendte patogener, selv når de indsamles fra raske donorer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total protein Udvinding og 2-D gelelektroforese Metoder til<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Metoder til at hæmme bakteriel Pyomelanin Produktion og Bestem den tilsvarende stigning i Følsomhed over for oxidativt stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Humane placenta og decidua Organ kulturer til at studere Infektioner på Maternal-føtal interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Påvisning af respiratoriske patogener i Animal Prøver af Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Real-time skælven-induceret konvertering Assay til påvisning af CWD prioner i Fecal materiale

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspression og oprensning af mennesket<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...