Name: culture methods to determine the limit of detection and survival in transport media of campylobacter jejuni in human fecal specimens
Uploaded: 2020-03-10T12:30:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens at JoVE.com

Disse studiene ble finansiert av TECHLAB, Inc.

1. Opplisting av Campylobacter i contrived humane fekale prøver
MERK: Alle trinn utføres ved hjelp av steril teknikk og materialer på et engangsbeskyttelsesark i en desinfisert lamitarstrømningssikkerhetshette.
FORSIKTIG: Live Campylobacter er smittsomme og kan forårsake sykdom, inkludert diaré. Bruk hansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer bakterier. Ikke munn rør. Kast alt materiale som har kontaktet bakterier i riktig biohazard beholdere.
<ol><li>Vekst av lagerkultur av bakterier<ol>
<li>Få stammer av C. jejuni (ATCC-33560) eller C. coli (ATCC 33559)(Materialbord) som tørkede eller frosne kulturer og rehydrere eller tine bakterier i henhold til produsentens instruksjoner. Strekk de rehydrerte bakteriene på en Campylobacter-spesifikk agarplate for å starte kulturen. Inkuber platen 48 timer ved 37 °C i en anaerob krukke som inneholder en mikroaerob atmosfære gassgenererende dosepose.</li>
		<li>På følgende dag, forberede 100 ml hjerne-hjerte infusjon (BHI) vekst kjøttkraft som inneholder 0,5% trypticase, 0,5% protease peptone, 0,0125% natriumpyruvat, og 0,0125% natriumbisulfitt.</li>
		<li>Forred BHI buljongen ved å dekke kolben løst og plassere den i en anaerob krukke med en pose som vil produsere et mikroaerofilt miljø. La kjøttkraft forminske over natten ved 37 °C. På samme måte, prereduce Campylobacter-spesifikke plater som skal brukes til koloni teller i trinn 1.1.10 og 1.2.2.</li>
		<li>Som Campylobacter er følsomme for luft, samle alle materialer før inokulering kjøttkraft og ikke dawdle mens du håndterer kulturer. Når du er klar til å inokulere, legg til føtal storfeserum (FBS) for å forminske kjøttkraft til 4% av det totale volumet. Oppbevar 1 ml forhåndsredusert kjøttkraft for å fungere som en blank i målinger av optisk tetthet ved 600 nm (OD600).</li>
		<li>Fjern 3 ml forhåndsredusert kjøttkraft som inneholder FBS og bruk buljong til å skrape startplaten som inneholder Campylobacter-kulturen. Skrap platen forsiktig med en inokulerende sløyfe, og overfør deretter bakterieslammen til et sterilt rør.</li>
		<li>Inokuler 100 ml forhåndsredusert kjøttkraft med ca. 3 ml bakteriell slam og inkubat med moderat risting ved 115 rpm ved 37 °C i en anaerob krukke som inneholder en gassgenererende dosepose.</li>
		<li>Overvåk veksten av bakteriene spektrotometralt ved turbiditet ved OD600. Bruk den reserverte kjøttkraft som en tom. Hvis den anaerobe krukken åpnes, skift ut den gassgenererende posen.</li>
		<li>Stopp buljonginkubasjon etter 48-72 timer eller før OD600-verdien når ~0,4. MERK: Denne OD600 tilsvarer vanligvis 107 til 108 CFU/ml. Se tabell 1 for typiske resultater.</li>
		<li>For å etablere antall bakterier i ren lagerkultur, utfør åtte 10-fold fortynningsserie på 100 μL kjøttkraft i 900 μL fortynningsbuffer (Materialtabell). Etter at 100 μL kjøttkraft er fjernet for første fortynning, returner kolbe til anaerob krukke med fersk gassgenererende pose for å vente bruk i spiking fekal basseng.</li>
		<li>Bruk sterile plating perler for å spre 100 μL av 10-5 til 10-7 fortynninger på dupliserte prereduced Campylobacter-spesifikke plater fra trinn 1.1.3. Etikettplater med fortynning som brukes, legg dem i en annen anaerob krukke med gassgenererende dosepose og inkuber ved 37 °C i 48–72 timer. MERK: Se figur 1 og figur 2 for fortynningsordning og fotografier av kolonier.</li>
		<li>Etter vekst velger du platen med mellom 30−300 kolonier å telle. Bruk tellingene til å bestemme CFU/ ml av lagerbuljongkulturen ved hjelp av Ligning 1: CFU/ml på lager = Gjennomsnittlig # av kolonier på utvalgte (dupliserte) analytiske plater ÷ (ml belagt x fortynning av plate) [Ligning 1] 
</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse og opplisting av kontrivede kliniske fekale prøver<ol>
<li>Umiddelbart etter at platene for analytiske tellinger er utarbeidet i trinn 1.1.10, lage et andre sett med lager kjøttkraft fortynninger ved å forberede 10 seriell 2-fold fortynninger fra lagerbuljongen og en Campylobacter-negativ fekal pool (NFP). For eksempel forberede den første fortynningen ved å blande like volumer av kjøttkraft og NFP (f.eks. 0,1 ml hver) og lage påfølgende fortynninger ved å overføre et utpekt volum av kjøttkraft og NFP-blanding til et rør med et likt utpekt volum NFP. Legg til en kontrollplate med kjøttkraft som ikke inneholder Campylobacter lagt til det fekale bassenget for å identifisere ikke-Campylobacter kolonier.<ol>
<li>Gjør NFP fra de-identifiserte, diaré pasient overvåkingsprøver eller sunn donor avføring som tidligere har blitt testet og funnet å være Campylobacter-negativ ved metoder som en Campylobacter enzyme immunoassay og av 16S rRNA qPCR.</li>
		</ol>
</li>
		<li>T-strek 10 μL av hver Campylobacter/avføringfortynning på dupliserte forhåndsreduserte Campylobacter-spesifikke agarplater. Plasser platene i den anaerobe krukken med en gassgenererende dosepose og inkuber ved 37 °C i 48 ± 2 timer.</li>
		<li>Undersøk de stripete platene visuelt for kolonier som ligner de fra rene Campylobacter kulturer. MERK: Den tredje kvadranten er vanligvis der disse vil bli funnet. Se Figur 1 og Figur 2 for fortynningsskjema og bilder av kolonistørrelse, farge og morfologi.</li>
		<li>Velg flere Campylobacter-som kolonier og Gram flekk. Ved hjelp av mikroskopi med en oljenedsenking linse, undersøke et tynt stripete område for gram-negative buet, spiral, eller sigar-formet små bakterier. MERK: Campylobacter er Gram-negativ og krever grunnleggende fuchsin som en motflekk (i stedet for den typiske safranin) for å bli visualisert nøyaktig. Klassiske måkevingede bakterier kan ses, men er ikke et krav. Se figur 2 for representativ mikrograf.</li>
		<li>Hvis en av de dupliserte platene ved en bestemt fortynning har 1 eller flere Campylobacter kolonier til stede, bør du vurdere at fortynning fekal-kultur positiv.</li>
		<li>Tenk på den siste fortynningen som inneholder en synlig Campylobacter-som gram-negativ koloni grensen for kulturdeteksjon. Bruk formel 2 til å beregne CFU/ml av positiv fortynning i kontrived klinisk fekal prøve: CFU/ml i fekal prøve = Analytisk CFU/ml ÷ Fortynning med siste positive koloni [Ligning 2] MERK: Se tabell 2 for typiske resultater.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Levedyktighet fastsettelse av Campylobacter lagret i Transport Media
<ol><li>Bland 1 ml Campylobacter buljongkultur (trinn 1.1.8) med 1 ml NFP og klargjør 10 dupliserte todelte seriefortynninger i NFP. Ytterligere fortynning hver fortynning ytterligere 1:4 i Cary-Blair media, akkurat som en klinisk prøve utarbeidet i transportmedier behandles.</li>
	<li>Oppbevar de 20 fortynningsrørene og en negativ kontroll i Cary-Blair-mediet i avgrensede rør ved 2–8 °C i 96 timer og telle kolonier fra hver fortynning som skjer ved tid null og hver 24 timer. For kolonitelling, prøv buljongen: fekale rør og oppsett fekal kultur for kolonitelling av hver fortynning, i duplikat.</li>
	<li>Hver dag plate 10 μL porsjoner av fekal fortynninger på Campylobacter-selektiv agar og inkubasjon ved 37 °C i 48 timer, som beskrevet ovenfor i trinn 1.1.9−1.2.7.</li>
	<li>Utfør et samtidig analytisk plateantall av det opprinnelige bakteriebestanden (fra trinn 1.1.8 eller en nydyrket buljong) som beskrevet ovenfor (trinn 1.1.9−1.1.11). Beregn CFU/ml av den opprinnelige bakteriebestanden (Ligning 1) for å beregne konsentrasjonen av bakterier i transportmediafekalprøven og dens fortynninger (Ligning 2).</li>
</ol>3. Ikke-kulturanalyser for å verifisere kulturresultater
<ol><li>Bruk en enzymimmunoassay (EIA) som gir minimale falske positive resultater12 og utfør i henhold til instruksjonene for pakkeinnsats for å verifisere kulturresultater.</li>
	<li>Bruk en molekylær analyse som kan oppdage 16S rRNA genet eller annet gen av et bredt spekter av Campylobacter arter13. Bekreft at molekylær analyse reagerer med arter som C. upsaliensis eller C. lari som vokser dårlig på standard antibiotikaholdig agar14. Følg produsentens instruksjoner for ekstraksjon av DNA fra fekale prøver og utføre testen. MERK: Toveis DNA-sekvensering av 16S amplicon kan brukes til å bekrefte arten av Campylobacter i en positiv prøve. Artsspesifikk PCR (se tabell 3 for målgener) kan også brukes til å identifisere arter som finnes i diskrebukse eller positive prøver15.</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Annual Summaries of Foodborne Outbreaks Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html">https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html</a> (2018)</li><li>Kaakoush, N. O., Casta&#241;o-Rodr&#237;guez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Epidemiology+of+Campylobacter+Infection.">Global Epidemiology of Campylobacter Infection.</a> Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 687-720 (2015).</li><li>Pitkanen, T. a., H, M. L., Rose, J. B., Jimenez-Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global Water Pathogen Project. , (2017).</li><li>Fitzgerald, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+Evaluation+of+Clinical+Diagnostic+Methods+for+Detection+and+Isolation+of+Campylobacter+spp.+from+Stool.">Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1209-1215 (2016).</li><li>Kirkpatrick, B. D., Tribble, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+human+Campylobacter+jejuni+infections.">Update on human Campylobacter jejuni infections.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 27 (1), 1-7 (2011).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+Trends+of+Infection+with+Pathogens+Transmitted+Commonly+Through+Food+-+Foodborne+Diseases+Active+Surveillance+Network,+10+U.S.+Sites,+2006-2013.">Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006-2013.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 63, 328-332 (2014).</li><li>Jaime, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+upsaliensis:+Another+Pathogen+for+Consideration+in+the+United+States.">Campylobacter upsaliensis: Another Pathogen for Consideration in the United States.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (11), 59-60 (2002).</li><li>Bullman, S., O'Leary, J., Corcoran, D., Sleator, R., Lucey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-based+detection+of+non-culturable+and+emerging+campylobacteria+in+patients+preseting+with+gastroenteritis.">Molecular-based detection of non-culturable and emerging campylobacteria in patients preseting with gastroenteritis.</a> Epidemiology and Infection. 140, 684-688 (2012).</li><li>Giltner, C. L., Saeki, S., Bobenchik, A. M., Humphries, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Campylobacter+Antigen+by+Enzyme+Immunoassay+Leads+to+Increased+Positivity+Rates.">Rapid Detection of Campylobacter Antigen by Enzyme Immunoassay Leads to Increased Positivity Rates.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 618-620 (2013).</li><li>M'ikanatha, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+stool+specimens+for+Campylobacter+spp.,+Pennsylvania,+USA.">Culturing stool specimens for Campylobacter spp., Pennsylvania, USA.</a> Emerging Infectious Disease. 18, 484-487 (2012).</li><li>Al Amri, A., Senok, A. C., Ismaeel, A. Y., Al-Mahmeed, A. E., Botta, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+direct+identification+of+Campylobacter+spp.+in+human+and+chicken+stools.">Multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools.</a> Journal of Medical Microbiology. 56 (10), 1350-1355 (2007).</li><li>Buss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+culture+fails+to+correctly+detect+Campylobacter+in+30%+of+positive+patient+stool+specimens+compared+to+non-cultural+methods.">Campylobacter culture fails to correctly detect Campylobacter in 30% of positive patient stool specimens compared to non-cultural methods.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38, 1087-1093 (2019).</li><li>Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Multiplex+Real-Time+PCR+Assay+for+Detecting+Major+Bacterial+Enteric+Pathogens+in+Fecal+Specimens:+Intestinal+Inflammation+and+Bacterial+Load+Are+Correlated+in+Campylobacter+Infections.">Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).</li><li>Couturier, B. A., Hale, D. C., Couturier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Campylobacter+upsaliensis+with+Persistent+Bloody+Diarrhea.">Association of Campylobacter upsaliensis with Persistent Bloody Diarrhea.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3792-3794 (2012).</li><li>Chaban, B., Musil, K. M., Himsworth, C. G., Hill, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cpn60-Based+Real-Time+Quantitative+PCR+Assays+for+the+Detection+of+14+Campylobacter+Species+and+Application+to+Screening+of+Canine+Fecal+Samples.">Development of cpn60-Based Real-Time Quantitative PCR Assays for the Detection of 14 Campylobacter Species and Application to Screening of Canine Fecal Samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 3055-3061 (2009).</li><li>Allos, B., Blaser, M. J., Mandell, G. L., Bennett, J. E., Dolin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed. , 2793-2802 (2009).</li><li>Anderson, N. W., Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+BD+MAX+Enteric+Bacterial+Panel+to+Routine+Culture+Methods+for+Detection+of+Campylobacter,+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+(O157),+Salmonella,+and+Shigella+Isolates+in+Preserved+Stool+Specimens.">Comparison of the BD MAX Enteric Bacterial Panel to Routine Culture Methods for Detection of Campylobacter, Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157), Salmonella, and Shigella Isolates in Preserved Stool Specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1222-1224 (2014).</li><li>Wasfy, M., Oyofo, B., Elgindy, A., Churilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+preservation+media+for+storage+of+stool+samples.">Comparison of preservation media for storage of stool samples.</a> Journal of Clinical Microbiology. 33 (8), 2176-2178 (1995).</li><li>Bess&#232;de, E., Delcamp, A., Sifre, E., Buissonniere, A., M&#233;graud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Methods+for+Detection+of+Campylobacters+in+Stool+Samples+in+Comparison+to+Culture.">New Methods for Detection of Campylobacters in Stool Samples in Comparison to Culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 49 (3), 941-944 (2011).</li><li>Bess&#232;de, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Diagnostic+Accuracy+of+Two+Immunochromatographic+Tests+Detecting+Campylobacter+in+Stools+and+Their+Role+in+Campylobacter+Infection+Diagnosis.">Evaluation of the Diagnostic Accuracy of Two Immunochromatographic Tests Detecting Campylobacter in Stools and Their Role in Campylobacter Infection Diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), (2018).</li><li>Shane, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Diseases+Society+of+America+Clinical+Practice+Guidelines+for+the+Diagnosis+and+Management+of+Infectious+Diarrhea.">Infectious Diseases Society of America Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Infectious Diarrhea.</a> Clinical Infectious Diseases. 65 (12), 1963-1973 (2017).</li><li>Toledo, Z., Simaluiza, R. J., Astudillo, X., Fern&#225;ndez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+and+antimicrobial+susceptibility+of+thermophilic+Campylobacter+species+isolated+from+healthy+children+attending+municipal+care+centers+in+Southern+Ecuador.">Occurrence and antimicrobial susceptibility of thermophilic Campylobacter species isolated from healthy children attending municipal care centers in Southern Ecuador.</a> Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 59, 77-77 (2017).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symptomatic+and+asymptomatic+Campylobacter+infections+associated+with+reduced+growth+in+Peruvian+children.">Symptomatic and asymptomatic Campylobacter infections associated with reduced growth in Peruvian children.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (1), 2036 (2013).</li></ol>

Forfatterne er ansatte i TECHLAB, Inc. som produserer QUIK CHEK™ settet som brukes som komparator i denne artikkelen.

Kulturmetodene som er beskrevet her er bygget på enkle, mye brukte teknikker og materialer som er tilgjengelige i de fleste laboratorier10. Det er kombinasjonen av analytiske og contrived prøver som gir ny informasjon om en klinisk relevant deteksjonsterskel for fekale kulturer. I tillegg styrker bedømmelsen av kulturresultater med 5 separate analyser konklusjonene om at Campylobacter fekal kultur feilidentifiserer en betydelig del av pasientprøver. EIA og molekylære analyser er nyttige som kontroller fordi de er hver basert på et annet prinsipp (antigeninteraksjon med antistoff vs. DNA-forsterkning) og, viktigst, ikke stole på levedyktighet av bakterier. Vær oppmerksom på at EIA-analysen som brukes til disse studiene er godt validert og har vist seg å være helt enig med 4 molekylære tester12.
Kultur av Campylobacter spp. er spesielt plagsom, med følsomhet rapportert å variere fra 60-76%19,20, og som tydelig fra sin ~ 30% rate av unnlatelse av å oppdage sanne positive prøver her. Personell kan forvente at kontroll-EIA- og molekylære tester ofte vil gi positive resultater når kulturdata er negative.
Det mest kritiske trinnet i protokollen er identifisering av pin-point kolonier blant konkurrerende fekal flora. Det er ikke uvanlig, som fortynninger nær deteksjonsterskelen, å ha vekslende null- og ikke-null kolonitellingsestimater (f.eks. 2, 0, 1, 0, 0). Det er viktig å erkjenne at kulturterskler vil være en rekke konsentrasjoner, ikke en bestemt CFU/ml. Likevel, anslaget på ~ 1 x 106 CFU / ml avføring som en lavere grense for kulturdeteksjon sammenligner godt med rapporter om at smittede mennesker kaster 106 til 109Campylobacter per gram avføring21. Endringer i antibiotika eller agarplater og variasjoner uunngåelig i individuelle fekale prøver vil utvilsomt endre terskelverdier. Denne protokollen bør muliggjøre forbedringer i vekstmedier.
Denne første informasjonen om en grense for kulturdeteksjon gjør det mulig å sette klinisk relevante terskler for diagnostiske tester, og legger det mikrobiologiske grunnlaget som er nødvendig for å løse ustuderte problemer med ikke-symptomatisk vogn22,23 av Campylobacter, eller hvis bakteriell belastning korrelerer med symptomer eller alvorlig sekvele.

United States Centers for Disease Control (CDC) publiserte nylig at overvåkingsprogrammet Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) rapporterte 9723 tilfeller av laboratoriediagnostiserte Campylobacter-infeksjoner i 20181. Dette representerer en 12% økning i Campylobacter saksrapporter over 2015−20171. Over hele verden er Campylobacter spp. blant de vanligste bakterielle tarminfeksjonene2. Likevel er antall Et Campylobacter-basertetarmsykdommer som oppstår hvert år, mistenkes å være underrapportert3. Denne underestimeringen er forutsigbar fordi de fleste pasienter bare kan gjenopprette med moderat ubehag og ingen medisinsk behandling. Men for pasienter med mer alvorlige symptomer eller som har høyere risiko for alvorlig sykdom, og som deretter søker medisinsk behandling, er avføringskultur den vanligste metoden for å vurdere om Campylobacter er patogenet som forårsaker deres nød4.
For Campylobacter spp., avføring kultur er spesielt plagsom. De vanligste patogene organismene, C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis og C. lari, er mikroaerofile5. Dette betyr at bakteriene vil dø tilfeldig, ukjent rater når de utsettes for luft. Tiden mellom prøveinnsamling og kulturoppsett blir dermed en ukontrollert variabel i evnen til å oppdage levedyktig Campylobacter spp. etter kultur.
For direkte kultur av fekale prøver er den langsomme veksten av Campylobacter også et problem. Campylobacter kolonier er svært små selv etter 48 timer inkubasjon og kan lett dekkes av konkurrerende organismer i fekal matrise. Plater som inneholder antibiotika som de fleste stammer av C. jejuni og C. coli er resistente er mye brukt, da antibiotika hemmer veksten av mange (men ikke alle) konkurrerende fekale bakterier, slik at bedre visualisering av Campylobacter kolonier6. Imidlertid er andre Campylobacter arter som C. lari og C. upsaliensis følsomme for noen av disse antibiotika, og enten vokse dårlig eller ikke i det hele tatt. Dette bidrar til underrapportering av Campylobacter infeksjoner fra disse antibiotikafølsomme arter7.
Det er en tredje grunn til at en kultur for Campylobacter kan være unøyaktig. Bakteriene, når de er stresset, kan forbli levedyktige, men kan bli "ikke-kulerbare"8. Dette betyr per definisjon at kulturen ikke vil oppdage bakteriene som finnes i prøven. Hvor ofte dette skjer er ikke kjent8.
Gitt disse potensielle problemene med kultur, brukte vi flere sammenligningsreferansemetoder slik at feil kulturresultater ikke gjorde en eneste komparatoranalyse vises unøyaktig9. Kulturmetodene som brukes (f.eks. Campylobacter-selektive plater, transportmedium, gassgenererende poser) ble valgt fordi de brukes mye i kliniske laboratorier for avføringsprøvekultur10.
Kulturprotokollene som er beskrevet her ble utviklet fordi det laveste antallet Campylobacter jejuni som kunne oppdages av kultur i menneskelig avføring ikke var kjent. Selv om estimater er publisert for antall kolonidannende enheter (CFU) til stede i fjærfe avføring11, disse resultatene kan ikke likestilles med menneskelig avføring, som Campylobacter spp. er kommensals i kyllinger, og ikke forårsake diaré. Denne grunnleggende informasjonen er nødvendig for å etablere antall Campylobacter bakterier som vil produsere symptomer på gastroenteritt hos mennesker og for å sammenligne virulens mellom stammer eller arter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anaerobic 3.5L Jar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HP0031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>AG701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Protease Peptone</td>
			<td>Life Technologies Corp</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fuchsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B12544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase Peptone</td>
			<td>Life Technologies Corp</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. coli Type strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>33559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. jejuni Type strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>33560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CampyGen gas generating system sachet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CN0025A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campylobacter QUIK CHEK</td>
			<td>TechLab, Inc.</td>
			<td>T5047 / T31025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary-Blair transport medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-005-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coli Roller Sterile plating beads</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Buffer</td>
			<td>Anaerobe Systems</td>
			<td>AS-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc</td>
			<td>SFBM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>243973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9090-0460</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture methods to determine the limit of detection and survival in transport media of campylobacter jejuni in human fecal specimens

En kultur fra menneskelig avføring for diagnose av Campylobacter-baserttarmsykdom tar flere dager, en ventetid som skatter styrke av legen og pasienten. En kultur er også utsatt for falske negative resultater fra tilfeldig tap av levedyktighet under prøvehåndtering, overvekst av annen fekal flora og dårlig vekst av flere patogene Campylobacter arter på tradisjonelle medier. Disse problemene kan forvirre kliniske beslutninger om pasientbehandling og har begrenset feltet fra å svare på grunnleggende spørsmål om Campylobacter vekst og infeksjoner. Vi beskriver en prosedyre som estimerer den nedre grensen for bakterietall som kan oppdages av en kultur og en metode for å kvantifisere overlevelse av C. jejuni i media som brukes til transport av denne skjøre organismen. Å vite denne informasjonen, blir det mulig å sette klinisk relevante deteksjonsterskler for diagnostiske tester og løse ustuderte problemer med om ikke-symptomatisk kolonisering er utbredt, hvis samtidig infeksjon med andre enteriske patogener er vanlig, eller hvis bakteriell belastning korrelerer med symptomer eller alvorlig sekvele. Studien inkluderte også testing av 1552 prospektivt innsamlede pasientdiaréfekale prøver som i utgangspunktet ble klassifisert av konvensjonell kultur og videre testet av en ny enzymimmunoassay. Positive og discrepant prøver ble deretter screenet av fire molekylære metoder for å tildele sann-positiv eller sann-negativ status. De 5 ikke-kulturmetodene viste fullstendig enighet om alle 48 positive og diskrepantprøver, mens kulturen feilidentifiserte 14 (28%). Prøvene som ble feilaktig identifisert av kultur inkluderte 13 falske negative og 1 falsk positiv prøve. Denne grunnleggende protokollen kan brukes med flere Campylobacter spp. og vil tillate antall Campylobacter bakterier som produserer symptomer på gastroenteritt hos mennesker for å bli bestemt og for utbredelse srater som skal oppdateres.

Identifisere Campylobacter spp. kolonier blant konkurrerende fekal flora krever ivrig syn og betydelig dømmekraft. Det laveste antallet kolonier som kan oppdages av kultur er ikke undersøkt, selv om prøver fra pasienter er estimert til å ha 106-109 CFU/ml16,17. Imidlertid kan pasientprøver ikke brukes kvantitativt, da det ikke finnes noen uavhengig metode for å etablere nøyaktige bakterietall. For å overvinne denne begrensningen, er to samtidige målinger gjort med en bakteriell lager. En test brukes til visuell påvisning av Campylobacter kolonier fra serielle fortynninger av lagerbakterier i en fekal matrise, simulere kliniske prøver; den andre brukes analytisk for å kvantifisere CFU/ml tilstede i bakteriebestandskulturen som brukes til spiking (figur 2A).
Deteksjonsterskler for Campylobacter vil ikke bli definert verdier. Dette forventes fordi hver fekal matrise er kompleks og unik, og veksten av bakterier er variabel. En viktig parameter for suksess er å identifisere de nøyaktige størrelseskoloniene blant den konkurrerende fekale floraen. En representativ plate av piggete avføringskultur er vist i figur 2C og figur 2D. Den negative kontrollplaten uten ekstra Campylobacter er viktig for å identifisere annen fekal flora. Gram farging mange kandidater trener også øyet for å skille de riktige blanke koloniene og den mellomliggende rosa fargen på fuchsin-farget gram-negative bakterier og bekrefter morfologien til bakteriene i de valgte koloniene (Figur 2B). Syv uavhengige eksperimenter ble utført ved hjelp av 5 C. jejuni og 2 C. coli buljonger, og ga terskler som overlappet og strakte seg fra 0,3-5 x 106 CFU/ml. Se tabell 2 for vanlige data. Deteksjonsgrensene var i gjennomsnitt 2 x 106 for C. jejuni og 1,2 x 106 CFU/ml for C. coli. Dette indikerer at kultur sannsynligvis kan oppdage ~ 1-2 x 106C. jejuni eller C. coli per gram fekal prøve på standard antibiotikaholdig Campylobacter-spesifikk agar som brukes av mange kliniske laboratorier. Det er flere spesialiserte agars med ulike antibiotika som kan gi forskjellige terskler for kolonideteksjon. Metodene som er beskrevet her bør oppmuntre til mer kvantitative og komparative studier for å forbedre nøyaktigheten av kultur og utvide allsidigheten til nye medier. For eksempel ble 152 kolonier regnet på de første 10-5 plate og 144 kolonier på den andre 10-5 plate. Gjennomsnittet mellom de to platene er 148 kolonier. Platene ble inokulert med 0,1 ml (100 μL) på 10-5 fortynning, som ved ligning 1 tilsvarer 148 x 106 (14,8 x 107) CFU/ml i den rene kulturbeholdningen. Når fekal fortynninger ble gjort, ble kulturen spiked inn i negativt fekal basseng på et 1:1-forhold. Derfor, av Ligning 2, det første punktet (plate "a") på fekal kurve tilsvarer 14,8 x 107 delt på 2 og tilsvarer 7,4 x 107 CFU / ml. Dette "a" røret brukes til å lage 9 ekstra fortynninger. I figur 1er den siste fortynningen med en synlig gramnegativ koloni med Campylobacter- som morfologi på plate "g". Dette tilsvarer 1,1 x 106 CFU/ml for den fekale kulturterskelen for deteksjon i dette eksemplet.
Selv om vedvarende levedyktighet er nøkkelen til kulturens nøyaktighet, er oppbevaring av levedyktigheten til Campylobacter spp. under håndtering og forsendelse av prøver fra pasienter til klinikker for å referere laboratorier er problematisk. Typisk lagring er å kjøle ned prøver i vanlige avkortet rør med lufteksponering og uten spesiell atmosfære. Prøver i transportmedier (også kjent som bevarte prøver) antas å ha bedre overlevelse, men det er få rapporter som gir kvantitative data18.
Kombinasjonen av analytiske og kontrivede prøvemetoder vist ovenfor ble brukt igjen for å oppnå levedyktighet og overlevelsestidestimater av C. jejuni i transportmedier. En bakteriell lagerbuljong ble brukt til å forberede ti dupliserte 2-fold til 1024-fold prøvefortynninger i fekal matrise. Den første kjøttkraft ble funnet av analytiske teller å ha en konsentrasjon på 4,8 x 107 CFU / ml. På plater laget på dag 0 ble C. jejuni oppdaget (2 dager senere) på platen stripete med 32-fold fortynning, tilsvarende 1,5 x 106 CFU / ml. Men på platene laget etter å ha kjølt cary Blair fecal prøve i 24 timer, bare 2-fold fortynning (tilsvarende 2,4 x 107 CFU / ml) vokste synlige kolonier. Ingen ytterligere tap av levedyktighet ble sett ut til 96 timer, da studien ble stoppet. Dette tapet av levedyktighet tilsvarer en 16 ganger (94%) tap av kulturable organismer på mindre enn 24 timer og indikerer at selv med kjøling kan avføring i Cary Blair medium med mindre enn 107 CFU / ml C. jejuni bli savnet av kultur.
I motsetning til resultatene av kulturen oppdaget EIA tilstedeværelsen av C. jejuni ved 256-foldfortynning på det første tidspunktet og gjennom hele 4 dagers testperiode. C. jejuni deteksjonterskelen for denne EIA ved hjelp av piggete fekale prøver er 8,4 x 104 CFU / ml. Denne terskelen er under den av fekal kultur og gir mer følsom og stabil påvisning av C. jejuni.
For å teste kulturens evne til å oppdage Campylobacter spp. i en faktisk klinisk setting, ble 1552 kliniske avføringsprøver preget av 6 prosedyrer: fekal kultur, en ny immunoassay for Campylobacter spp., og 4 molekylære metoder. Alle prøver ble prospektivt samlet inn og opprinnelig klassifisert av konvensjonell kultur ved 3 laboratorier i USA, og deretter krysssjekket av EIA. Enhver kultur-positiv eller EIA / kultur-discrepant prøver ble deretter screenet av molekylære metoder12. Prøvene ble tildelt en sann positiv eller sann negativ status basert på resultatene av de 5 ikke-kulturmetodene. De 5 ikke-kulturmetodene viste fullstendig enighet om alle 48 positive og diskrepantprøver, mens kultur feilidentifiserte 14 (28%). Prøvene som ble feilaktig identifisert av kultur inkluderte 13 falske negative og 1 falsk positiv prøve.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60457/60457fig1a.jpg"> Figur 1: Ordning for samtidig fremstilling av analytiske og piggete fekale prøver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60457/60457fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60457/60457fig2a.jpg"> Figur 2: Identifikasjon av C. jejunikolonier fra rene og fekale kulturer. (A) Fotografi av C. jejuni kolonier fra ren bakteriell kultur etter 72 timers inkubasjon. (B) Gram flekk av C. jejuni fra ren bakteriell kultur, olje-nedsenking 400x forstørrelse. (C) Fotografi av C. jejuni-positivpiggete fekal kultur etter 48 h inkubasjon. (D) Forstørret område i boks i (C), 10x forstørrelse. Hvite piler indikerer pin-point størrelse gram-negative C. jejuni kolonier. Det svarte pilhodet indikerer en koloni som er litt større, gram-positiv, og ikke C. jejuni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60457/60457fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Kulturer</td>
			<td>OD600 @ T0</td>
			<td>OD600 @ T Final1</td>
			<td>Endelig CFU/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. jejuni (andre kan være på vei til 191</td>
			<td>0.146</td>
			<td>0.321</td>
			<td>1,28 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. coli (andre kan være på</td>
			<td>0.245</td>
			<td>0.508</td>
			<td>4,50 x 108
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Typisk vekst og CFU/ml C. jejuni- og C. coli-bestandene. 1C. jejuni kultur ble stoppet etter 48 timer inkubasjon. C. coli kultur ble stoppet etter 54 timer inkubasjon.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Fortynningsrør for piggete fekal prøve</td>
			<td>Antall Campylobacter-som kolonier</td>
			<td>Antall Gram-negative kolonier1</td>
			<td>Kultur positiv?</td>
			<td>Beregnet CFU/ml piggete prøve</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="10">
C. jejuni (1,28 x 108 CFU/ml lager)</td>
			<td>(2 ganger) en</td>
			<td>Tett</td>
			<td>2.
</td>
			<td>ja</td>
			<td>6,40 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4 ganger) b</td>
			<td>20+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>ja</td>
			<td>3,20 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(8 ganger) c</td>
			<td rowspan="3">4-10</td>
			<td>Nd</td>
			<td>ja</td>
			<td>1,60 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(16 ganger) d</td>
			<td>Nd</td>
			<td>ja</td>
			<td>8,00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(32 ganger) e</td>
			<td>Nd</td>
			<td>ja</td>
			<td>4,00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(64 ganger) f</td>
			<td rowspan="4">1-3</td>
			<td>1 av 2</td>
			<td>ja</td>
			<td>2,00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(128 ganger) g</td>
			<td>2 av 3</td>
			<td>ja</td>
			<td>1,00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>
3(256 ganger) h
</td>
			<td>1 av 2</td>
			<td>ja</td>
			<td>5,00 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(512 ganger) i</td>
			<td>0 av 1</td>
			<td>nei</td>
			<td>2,50 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(1024 ganger) j</td>
			<td>0</td>
			<td>Nd</td>
			<td>nei</td>
			<td>Nfp</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="10">
C. coli (4,50 x 108 CFU/ml lager)</td>
			<td>(2 ganger) en</td>
			<td rowspan="2">Tett</td>
			<td>Nd</td>
			<td>ja</td>
			<td>2,25 x 108
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4 ganger) b</td>
			<td>Nd</td>
			<td>ja</td>
			<td>1,13 x 108
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(8 ganger) c</td>
			<td>50+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>ja</td>
			<td>5,63 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(16 ganger) d</td>
			<td>30+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>ja</td>
			<td>2,81 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(32 ganger) e</td>
			<td>Over 10 år</td>
			<td>Nd</td>
			<td>ja</td>
			<td>1,41 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(64 ganger) f</td>
			<td rowspan="2">3-8</td>
			<td>Nd</td>
			<td>ja</td>
			<td>7,03 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(128 ganger) g</td>
			<td>Nd</td>
			<td>ja</td>
			<td>3,52 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>
3(256 ganger) h
</td>
			<td rowspan="2">1-3</td>
			<td>1 av 3</td>
			<td>ja</td>
			<td>1,76 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(512 ganger) i</td>
			<td>0 av 1</td>
			<td>nei</td>
			<td>8,79 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(1024 ganger) j</td>
			<td>0</td>
			<td>Nd</td>
			<td>nei</td>
			<td>Nfp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Typisk antall kolonier på plater av piggete fekale prøver. 1 Gram negative kolonier blant Campylobacter-som kolonier, 2nd = ikke bestemt, 3Data i fet skrift indikerer siste positive fortynning.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Arter</td>
			<td>Genmål</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. jejuni (andre kan være på vei til 191</td>
			<td>hipO (andre er i 20</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. coli (andre kan være på</td>
			<td>CadF (andre kan være på samme</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. upsaliensis (andre betydninger)</td>
			<td>2007: 2000: 2000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. LARi (andre kan være på stedet)</td>
			<td>2007: 2000: 2000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. helveticus (andre er)</td>
			<td>2007: 2000: 2000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. foster</td>
			<td>2007: 2000: 2000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. hyointestinal</td>
			<td>2007: 2000: 2000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. konsis</td>
			<td>2007: 2000: 2000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Gener som er nyttige for påvisning av individuelle Campylobacter arter qPCR.

Watch this Scientific Journal Video about Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens at JoVE.com

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Selv om avføringskulturen for Campylobacter er upresis, regnes det fortsatt som gullstandarden for identifikasjon. Metoder for å bestemme grensen for deteksjon og overlevelse i transportmedier av C. jejuni i menneskelig avføring er beskrevet og sammenlignet med en ny immunoanalyse med bedre nøyaktighet.

Kultur metoder for å bestemme grensen for deteksjon og overlevelse i Transport Media av Campylobacter Jejuni i Human Fecal Specimens

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Vanskeligheten med Campylobacter kultur har hemmet grunnleggende studier som hvor få bakterier som trengs for å produsere sykdom. Disse kombinerte analytiske og kontrivede prøvene som brukes her, kan løse dette problemet. Denne teknikken gjør at kliniske relevante pasientsymptomer kan korreleres med et positivt fekal kulturresultat og for første gang et faktisk antall bakterier.Å lære hvor mange bakterier som korrelerer med sykdom vil gi diagnostikk, et viktig mål for deteksjon og en solid metode for å sammenligne virulens mellom stammer eller arter av Campylobacter. Campylobacter kultur er grei, men det krever rask og organisert forberedelse for å opprettholde kvantitativ levedyktighet. Betydelig dom er også nødvendig for å identifisere Campylobacter kolonier blant konkurrerende fekal flora på en tallerken.Før du starter en C.jejuni- eller C.coli-kultur, ta på deg hansker, en laboratoriefrakk og vernebriller, og plasser et engangsbeskyttelsesark i en desinfisert laminær strømningssikkerhetshette. Ved hjelp av steril teknikk strek hver hydrert eller tint bakteriell lager på en Campylobacter spesifikk agar plate og plassere platen på 37 grader Celsius i 48 timer i en anaerob krukke som inneholder en mikroaerobe atmosfære gass generere pose. 24 timer senere, løst dekke en flaske BHI kjøttkraft og plassere kolben i en ny anaerob krukke med en pose som vil produsere et mikroaerobt miljø for en overnatting inkubasjon på 37 grader Celsius.Neste morgen bruker tre milliliter av den forhåndsreduserte kjøttkraft og en inoculating loop for å skrape startplaten av Campylobacter kultur. Overfør slammet til et sterilt rør, og inokuler de resterende 97 milliliter av den forhåndsreduserte kjøttkraft med de tre milliliter skrapt slurry. Legg buljongen i krukken med gassposen og inkuber kulturen ved 37 grader Celsius og 115 omdreininger per minutt på en ristende inkubator i 48 til 72 timer, til kulturen når en optisk tetthet på 600 nanometer på ikke mer enn 4.For å etablere antall bakterier i denne rene lagerkulturen utføre åtte 10-fold fortynning serie på 100 mikroliter kjøttkraft i 900 mikroliter fortynning. Ved hjelp av sterile plating perler, spre 100 mikroliter av en gang 10 til den negative femte til 10 til de negative syvende fortynninger på dupliserte forhåndsreduserte Campylobacter spesifikke plater og etikettplater med fortynning konsentrasjon før du plasserer platene i en annen anaerob krukke med en gassgenererende pose i 48 til 72 timer ved 37 grader Celsius. På slutten av vekstperioden velger du plater med mellom 30 og 300 kolonier for telling.Etter telling bruk tellingene til å bestemme kolonien forming enheter per milliliter av lager kjøttkraft kultur i henhold til formelen. Det er avgjørende at de analytiske kolonitellingene er nøyaktige, da dette underbygger alle trinnene ved hjelp av piggete fekal basseng. Umiddelbart etter plating for telling som demonstrert, bland like mengder kjøttkraft og Campylobacter negativt fekalt basseng og lag ni påfølgende to ganger fortynninger i negativt fekalt basseng, og legg til en kontrollplate med kjøttkraft som ikke inneholder Campylobacter til fekalbassenget for å identifisere de ikke-Campylobacter koloniene.Strek 10 mikroliter av hver Campylobacter krakk fortynning på dupliserte forhåndsreduserte Campylobacter spesifikke agarplater og inkuber platene i anaerob krukke med en gassgenererende pose ved 37 grader Celsius i ca 48 timer. På slutten av inkubasjonen visuelt undersøke stripete plater for kolonier som ligner de fra rene Campylobacter kulturer. For å bekrefte at koloniene faktisk er Campylobacter velge flere Campylobacter som kolonier for gram farging og visualisere et tynt stripete område ved lys mikroskopi ved hjelp av en olje nedsenking linse for å identifisere gram-negative buet, spiral, eller sigar formet små bakterier.En negativ kontrollplate uten tilsatt Campylobacter er viktig for å bidra til å identifisere annen fekal flora. Tenk på den siste fortynningen som inneholder en visuell Campylobacter-lignende gram-negativ koloni grensen for kulturdeteksjon. Og bruk formelen til å beregne kolonidannende enheter per milliliter av den positive fortynningen i kontrived klinisk fekal prøve.For å bestemme levedyktigheten til Campylobacter lagret i transportmiddel blanding en milliliter Campylobacter kjøttkraft kultur med en milliliter negativt fecal basseng og forberede 10 dupliserte to ganger seriell fortynninger i negativ fecal basseng. Ytterligere fortynne hver fortynning på en ekstra en til fire ratio i Cary-Blair medium og lagre 20 fortynning rør og en negativ kontroll i Cary-Blair medium i cap rør på to til åtte grader Celsius i 96 timer. Starter på tid null og hver 24 timer deretter strek 10 mikroliter aliquots av hver fortynning på Campylobacter selektive agar plater og inkubere platene på 37 grader Celsius i 48 timer.Siden det ikke finnes noen uavhengig metode for å etablere nøyaktige bakterietall fra pasientprøver, kan to samtidige målinger gjøres med en ren bakteriebestand. En test brukes til visuell påvisning av Campylobacter kolonier fra seriell fortynning av lagerbakterier i en fekal matrise, simulere kliniske prøver. Den andre testen brukes analytisk, kvantifiserer kolonidannende enheter per milliliter tilstede i samme bakterielagerkultur som brukes til spiking.En viktig parameter for suksess er å identifisere de nøyaktige koloniene blant den konkurrerende fekale floraen, som illustrert av denne representative platen av piggete avføringskultur. Her kan typiske data fra syv uavhengige eksperimenter observeres. Bare identifisere kolonier som ligner Campylobacter i fekale kulturer er ikke nok.Alle koloniene bør bekreftes med gram flekk eller mer avanserte metoder. Vi bruker et enzym immunanalyse som er mer nøyaktig enn kultur for å oppdage uvanlige arter som C.upsaliensis eller C.lari, som vokser dårlig på standard antibiotika som inneholder agar. Denne teknikken legger et nødvendig grunnlag for å studere ting som ikke-symptomatisk transport av Campylobacter og om høye bakterielle belastninger setter en pasient i høyere risiko for alvorlige konsekvenser av Campylobacter infeksjon.Bruk alltid PPE når du arbeider med bakterier, som ofte er smittsomme og kan være farlige, og med det negative fekale bassenget som kan inneholde ukjente patogener selv når de samles inn fra friske donorer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Totalt Protein Extraction og 2-D-gel-elektroforese Metoder<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Metoder for å hemme bakterie Pyomelanin Produksjon og Bestem tilsvarende økning i Følsomhet for oksidativt stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Menneskemorkake og decidual orgel kulturer å studere Infeksjoner ved maternal-føtal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Høy throughput Påvisning av respiratoriske patogener i dyr eksemplarer av nanoskala PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Sanntid skjelvende-indusert konvertering analysen for påvisning av CWD prioner i Fecal materiale

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspresjon og rensing av menneske<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...