Name: culture methods to determine the limit of detection and survival in transport media of campylobacter jejuni in human fecal specimens
Uploaded: 2020-03-10T12:30:00
Duration: 8 min 23 s
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Estos estudios fueron financiados por TECHLAB, Inc.

1. Enumeración de Campylobacter en especímenes fecales humanos contrived
NOTA: Todos los pasos se llevan a cabo utilizando técnicas estériles y materiales en una lámina protectora desechable dentro de una campana de seguridad de flujo laminar desinfectada.
ADVERTENCIA: Campylobacter vivo son infecciosos y pueden causar enfermedades, incluyendo diarrea. Use guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad siempre que manipule bacterias. No entube la boca. Deseche todo el material que haya contactado con bacterias en recipientes de riesgo biológico adecuados.
<ol><li>Crecimiento del cultivo de bacterias<ol>
<li>Obtener cepas de C. jejuni (ATCC-33560) o C. coli (ATCC 33559)(Tabla de materiales)como cultivos secos o congelados y rehidratar o descongelar bacterias de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Raya las bacterias rehidratadas en una placa de agar específica de Campylobacterpara iniciar el cultivo. Incubar la placa 48 h a 37oC en un tarro anaeróbico que contenga un sobre generador de gas de atmósfera microaeróbica.</li>
		<li>Al día siguiente, prepare 100 ml de caldo de crecimiento de infusión cerebro-corazón (BHI) que contenga 0,5% de trippticasa, 0,5% peptona de proteasa, 0,0125% piruvato sódico y 0,0125% bisulfito sódico.</li>
		<li>Prereduzca el caldo BHI cubriendo el matraz holgadamente y colocándolo en un frasco anaeróbico con un sobre que producirá un ambiente microaerofílico. Deje que el caldo se prereduzca durante la noche a 37 oC. Del mismo modo, prereducir las placas específicas de Campylobacterque se utilizarán para los recuentos de colonias en los pasos 1.1.10 y 1.2.2.</li>
		<li>Como Campylobacter son sensibles al aire, reúna todos los materiales antes de inocular el caldo y no se desanime mientras maneja cultivos. Cuando esté listo para inocular, agregue suero bovino fetal (FBS) al caldo prereducido al 4% del volumen total. Conservar 1 ml de caldo prereducido para servir como blanco en mediciones de densidad óptica a 600 nm (OD600).</li>
		<li>Retire 3 ml de caldo prereducido que contenga FBS y use caldo para raspar la placa de arranque que contiene el cultivo Campylobacter. Raspar suavemente la placa con un bucle inoculante, y luego transferir la suspensión bacteriana a un tubo estéril.</li>
		<li>Inocular los 100 ml de caldo prereducido con aproximadamente 3 ml de lodo bacteriano e incubar con agitación moderada a 115 rpm a 37 oC en frasco anaeróbico que contenga un sobre generador de gas.</li>
		<li>Monitorear el crecimiento de las bacterias espectrofotométricamente por turbidez en OD600. Utilice el caldo reservado como blanco. Si se abre el frasco anaeróbico, sustituya el sobre generador de gas.</li>
		<li>Detener la incubación de caldo después de 48-72 h o antes de que el valor de OD600 alcance 0,4. NOTA: Este OD600 normalmente equivale a 107 a 108 CFU/mL. Consulte la Tabla 1 para ver los resultados típicos.</li>
		<li>Para establecer el número de bacterias en el cultivo de material puro, realice ocho series de dilución de 10 veces de 100 l de caldo en 900 ml de tampón de dilución(Tabla de materiales). Después de retirar los 100 ml de caldo para la primera dilución, vuelva a colocar el matraz en un frasco anaeróbico con sobre de generación de gas fresco para esperar su uso en la piscina fecal.</li>
		<li>Utilice perlas de chapado estériles para esparcir 100 sL de las diluciones de 10-5 a 10-7 en placas específicas de Campylobacterprereducidas duplicadas del paso 1.1.3. Etiquetar las placas con dilución utilizada, colocarlas en un segundo frasco anaeróbico con sobre generador de gas e incubar a 37 oC durante 48 x 72 h. NOTA: Consulte la Figura 1 y la Figura 2 para el esquema de dilución y fotografías de colonias.</li>
		<li>Después del crecimiento, elija la placa con entre 30 y 300 colonias para contar. Utilice los recuentos para determinar la CFU/ml del cultivo de caldo de caldo utilizando la Ecuación 1: CFU/ml en stock - Promedio de las colonias en las placas analíticas elegidas (duplicadas) (ml chapado x dilución de placa) [Ecuación 1] 
</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación y enumeración de muestras fecales clínicas contderivas<ol>
<li>Inmediatamente después de que las placas para recuentos analíticos se preparen en el paso 1.1.10, haga un segundo conjunto de diluciones de caldo de caldo preparando 10 diluciones seriales de 2 veces del caldo de caldo y una piscina fecal negativa Campylobacter(NFP). Por ejemplo, prepare la primera dilución mezclando volúmenes iguales de caldo y NFP (por ejemplo, 0,1 ml cada uno) y realice diluciones posteriores transfiriendo un volumen designado de caldo y mezcla de PNF en un tubo con un Volumen designado igual de NFP. Agregue una placa de control con caldo que no contenga Campylobacter añadido a la piscina fecal para ayudar a identificar colonias que no seande Campylobacter.<ol>
<li>Hacer que el PNV de muestras de vigilancia de pacientes desidentificadas y diarreicas o heces de donantes saludables que hayan sido previamente probadas y que se haya encontrado que Son Campylobacter-negativos por métodos como un inmunoensayo enzimático de la enzima Campylobacter y por 16S rRNA qPCR.</li>
		</ol>
</li>
		<li>De 10 ol de cada dilución de Campylobacter/stoolen placas de agar específicas de Campylobacterprereducidas duplicadas. Colocar las placas en el frasco anaeróbico con un sobre generador de gas e incubar a 37 oC durante 48 o2 h.</li>
		<li>Examine visualmente las placas con rayas en busca de colonias que se asemejan a las de las culturas puras de Campylobacter. NOTA: El tercer cuadrante es típicamente donde se encuentran. Consulte la Figura 1 y la Figura 2 para ver el esquema de dilución y las imágenes del tamaño, el color y la morfología de la colonia.</li>
		<li>Seleccione varias colonias Campylobacter-como y la mancha de Gram. Usando microscopía con una lente de inmersión en aceite, examine un área delgadamente rayada en busca de bacterias pequeñas curvadas, espirales o en forma de cigarro gramnegativas. NOTA: Campylobacter son Gram-negativos y requieren fucsina básica como una contramancha (en lugar de la safranina típica) para visualizarse con precisión. Las bacterias clásicas de alas de gaviota se pueden ver, pero no son un requisito. Consulte la Figura 2 para ver el micrografo representativo.</li>
		<li>Si cualquiera de las placas duplicadas en una dilución específica tiene 1 o más colonias de Campylobacter presentes, considere que la dilución de la cultura fecal es positiva.</li>
		<li>Considere la última dilución que contiene una colonia visible Campylobacter-como gram-negativa el límite de la detección de cultivos. Utilice la Ecuación 2 para calcular la CFU/ml de la dilución positiva en muestras fecales clínicas contderivas: CFU/ml en la muestra fecal - CFU/ml analíticos - Dilución con la última colonia positiva [Ecuación 2] NOTA: Consulte la Tabla 2 para ver los resultados típicos.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Determinación de la viabilidad de Campylobacter almacenado en medios de transporte
<ol><li>Mezclar 1 ml de cultivo de caldo Campylobacter (paso 1.1.8) con 1 ml de NFP y preparar 10 diluciones seriales dobles duplicadas en NFP. Diluir aún más cada dilución 1:4 adicional en los medios de Cary-Blair, del mismo modo que se trata un espécimen clínico preparado en medios de transporte.</li>
	<li>Almacene los 20 tubos de dilución y un control negativo en el medio de Cary-Blair en tubos tapados a 2 o8 oC durante 96 h y cuente las colonias de cada dilución que se produzca en el momento cero y cada 24 h. Para el conteo de colonias, pruebe el caldo: tubos fecales y configure el cultivo fecal para el conteo de colonias de cada dilución, por duplicado.</li>
	<li>Cada día placa 10 porciones de las diluciones fecales en Campylobacter-agar selectivo e incubar a 37 oC durante 48 h, como se describe anteriormente en los pasos 1.1.9-1.2.7.</li>
	<li>Realizar un recuento simultáneo de placas analíticas del material bacteriano original (del paso 1.1.8 o un caldo recién cultivado) como se describió anteriormente (pasos 1.1.9-1.1.11). Calcular la CFU/ml de lapoblaciónbacteriana original ( Ecuación 1 ) para calcular la concentración de bacterias en la muestra fecal de medios de transporte y sus diluciones (Ecuación 2).</li>
</ol>3. Ensayos no culturales para verificar los resultados de la cultura
<ol><li>Utilice un inmunoensayo enzimático (EIA) que dé resultados falsos positivos mínimos12 y realice de acuerdo con las instrucciones de inserción del envase para verificar los resultados del cultivo.</li>
	<li>Utilice un ensayo molecular que pueda detectar el gen 16S rRNA u otro gen de una amplia gama de especies13de Campylobacter. Confirmar que el ensayo molecular reacciona con especies como C. upsaliensis o C. lari que crecen mal en el agar estándar que contiene antibióticos14. Siga las instrucciones del fabricante para extraer ADN de muestras fecales y realizar la prueba. NOTA: La secuenciación bidireccional del ADN del amplicon 16S se puede utilizar para confirmar las especies de Campylobacter en un espécimen positivo. La PCR específica de las especies (véase la Tabla 3 para los genes diana) también puede utilizarse para identificar especies presentes en especímenes discretos o positivos15.</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Annual Summaries of Foodborne Outbreaks Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html">https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html</a> (2018)</li><li>Kaakoush, N. O., Casta&#241;o-Rodr&#237;guez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Epidemiology+of+Campylobacter+Infection.">Global Epidemiology of Campylobacter Infection.</a> Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 687-720 (2015).</li><li>Pitkanen, T. a., H, M. L., Rose, J. B., Jimenez-Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global Water Pathogen Project. , (2017).</li><li>Fitzgerald, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+Evaluation+of+Clinical+Diagnostic+Methods+for+Detection+and+Isolation+of+Campylobacter+spp.+from+Stool.">Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1209-1215 (2016).</li><li>Kirkpatrick, B. D., Tribble, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+human+Campylobacter+jejuni+infections.">Update on human Campylobacter jejuni infections.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 27 (1), 1-7 (2011).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+Trends+of+Infection+with+Pathogens+Transmitted+Commonly+Through+Food+-+Foodborne+Diseases+Active+Surveillance+Network,+10+U.S.+Sites,+2006-2013.">Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006-2013.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 63, 328-332 (2014).</li><li>Jaime, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+upsaliensis:+Another+Pathogen+for+Consideration+in+the+United+States.">Campylobacter upsaliensis: Another Pathogen for Consideration in the United States.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (11), 59-60 (2002).</li><li>Bullman, S., O'Leary, J., Corcoran, D., Sleator, R., Lucey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-based+detection+of+non-culturable+and+emerging+campylobacteria+in+patients+preseting+with+gastroenteritis.">Molecular-based detection of non-culturable and emerging campylobacteria in patients preseting with gastroenteritis.</a> Epidemiology and Infection. 140, 684-688 (2012).</li><li>Giltner, C. L., Saeki, S., Bobenchik, A. M., Humphries, R. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Diseases+Society+of+America+Clinical+Practice+Guidelines+for+the+Diagnosis+and+Management+of+Infectious+Diarrhea.">Infectious Diseases Society of America Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Infectious Diarrhea.</a> Clinical Infectious Diseases. 65 (12), 1963-1973 (2017).</li><li>Toledo, Z., Simaluiza, R. J., Astudillo, X., Fern&#225;ndez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+and+antimicrobial+susceptibility+of+thermophilic+Campylobacter+species+isolated+from+healthy+children+attending+municipal+care+centers+in+Southern+Ecuador.">Occurrence and antimicrobial susceptibility of thermophilic Campylobacter species isolated from healthy children attending municipal care centers in Southern Ecuador.</a> Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 59, 77-77 (2017).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symptomatic+and+asymptomatic+Campylobacter+infections+associated+with+reduced+growth+in+Peruvian+children.">Symptomatic and asymptomatic Campylobacter infections associated with reduced growth in Peruvian children.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (1), 2036 (2013).</li></ol>

Los autores son empleados de TECHLAB, Inc. que produce el kit QUIK CHEK™ utilizado como comparador en este artículo.

Los métodos de cultivo descritos aquí se basan en técnicas y materiales simples y ampliamente utilizados disponibles en la mayoría de los laboratorios10. Es la combinación de muestras analíticas y inventadas que proporcionan nueva información de un umbral de detección clínicamente relevante para cultivos fecales. Además, la adjudicación de los resultados de la cultura con 5 ensayos separados fortalece las conclusiones de que el cultivo fecal de Campylobacter identifica erróneamente una parte significativa de los especímenes de pacientes. La EIA y los ensayos moleculares son útiles como controles porque cada uno se basa en un principio diferente (interacción de antígenos con amplificación de anticuerpos frente a ADN) y, lo que es más importante, no dependen de la viabilidad de las bacterias. Tenga en cuenta que el ensayo de EIA utilizado para estos estudios está bien validado y se ha demostrado que está totalmente de acuerdo con 4 pruebas moleculares12.
El cultivo de Campylobacter spp. es particularmente problemático, con sensibilidad reportada para oscilar entre 60-76%19,20, y como se evidencia de su tasa de fracaso del 30% en la detección de especímenes verdaderamente positivos aquí. El personal puede esperar que el control de la EIA y las pruebas moleculares con frecuencia produzcan resultados positivos cuando los datos de cultivo son negativos.
El paso más crítico en el protocolo es la identificación de colonias de punto pin entre la flora fecal competidora. No es inusual, como diluciones cerca del umbral de detección, tener estimaciones alternas de recuento de colonias cero y no cero (por ejemplo, 2, 0, 1, 0, 0). Es importante reconocer que los umbrales de cultivo serán una gama de concentraciones, no una CFU/ml específica. Sin embargo, la estimación de 1 x 106 heces de CFU/ml como límite inferior para la detección de cultivos se compara bien con los informes de que los seres humanos infectados arrojan de 106 a 109Campylobacter por gramo de heces21. Los cambios en los antibióticos o placas de agar y las variaciones inevitables en los especímenes fecales individuales sin duda cambiarán los valores umbral. Este protocolo debe permitir mejoras en los medios de crecimiento.
Esta primera información sobre un límite para la detección del cultivo permite establecer umbrales clínicamente relevantes para las pruebas diagnósticas, y establece los cimientos microbiológicos necesarios para abordar los problemas no estudiados del transporte no sintomático22,23 por Campylobacter,o si la carga bacteriana se correlaciona con síntomas o secuencias graves.

Los Centros para el Control y la Control de Enfermedades de los Estados Unidos (CDC) publicaron recientemente que el programa de vigilancia de la Red de Vigilancia Activa de Enfermedades transmitidas por los alimentos (FoodNet) reportó 9.723 casos de infecciones de Campylobacter diagnosticadas por laboratorio en 20181. Esto representa un aumento del 12% en los informes de casos de Campylobacter en 2015-20171. En todo el mundo, Campylobacter spp. se encuentran entre las infecciones intestinales bacterianas más comunes2. Sin embargo, se sospecha que el número de enfermedades intestinales basadas en Campylobacterque se producen cada año es subinformado3. Esta subestimación es predecible porque la mayoría de los pacientes pueden recuperarse con sólo molestias moderadas y sin tratamiento médico. Sin embargo, para los pacientes con síntomas más graves o que tienen un mayor riesgo de enfermedad grave, y que luego buscan atención médica, el cultivo de heces es el método más común para evaluar si Campylobacter es el patógeno que está causando su angustia4.
Para Campylobacter spp., el cultivo de heces es particularmente problemático. Los organismos patógenos más comunes, C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis, y C. lari, son microaerofílicos5. Esto significa que las bacterias morirán al azar, tasas desconocidas una vez expuestas al aire. El tiempo entre la recolección de muestras y la configuración del cultivo se convierte así en una variable incontrolada en la capacidad de detectar viable Campylobacter spp. por cultivo.
Para el cultivo directo de especímenes fecales, el lento crecimiento de Campylobacter también es un problema. Las colonias de Campylobacter son muy pequeñas incluso después de 48 h de incubación y pueden ser fácilmente cubiertas por organismos competidores en la matriz fecal. Las placas que contienen antibióticos a las que la mayoría de las cepas de C. jejuni y C. coli son resistentes son ampliamente utilizadas, ya que los antibióticos inhiben el crecimiento de muchas (pero no todas) bacterias fecales competidoras, permitiendo una mejor visualización de las colonias de Campylobacter 6. Sin embargo, otras especies de Campylobacter como C. lari y C. upsaliensis son sensibles a algunos de estos antibióticos, y crecen mal o no en absoluto. Esto contribuye a la subinformación de las infecciones de Campylobacter de estas especies sensibles a los antibióticos7.
Hay una tercera razón por la que una cultura de Campylobacter puede ser inexacta. Las bacterias, cuando se estresan, pueden seguir siendo viables, pero pueden llegar a ser "no culturables"8. Esto por definición significa que el cultivo no detectará las bacterias presentes en la muestra. La frecuencia con la que esto ocurre no se conoce8.
Dados estos posibles problemas con la cultura, utilizamos múltiples métodos de referencia de comparación para que los resultados de la referencia cultural defectuosos no hicieran que un solo ensayo de comparación pareciera inexacto9. Los métodos de cultivo utilizados (por ejemplo, Campylobacter-placas selectivas, medio de transporte, sobres generadores de gas) se eligieron porque se utilizan ampliamente en laboratorios clínicos para el cultivo de muestras de heces10.
Los protocolos de cultivo descritos aquí se desarrollaron porque no se conocía el menor número de Campylobacter jejuni que podían ser detectados por el cultivo en heces humanas. Aunque se han publicado estimaciones para el número de unidades formadoras de colonias (CFU) presentes en las heces de aves de corral11, estos resultados no se pueden equiparar a las heces humanas, ya que Campylobacter spp. son comensales en pollos, y no causan diarrea. Esta información fundamental es necesaria para establecer el número de bacterias Campylobacter que producirán síntomas de gastroenteritis en humanos y para comparar la virulencia entre cepas o especies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anaerobic 3.5L Jar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HP0031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>AG701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Protease Peptone</td>
			<td>Life Technologies Corp</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fuchsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B12544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase Peptone</td>
			<td>Life Technologies Corp</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. coli Type strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>33559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. jejuni Type strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>33560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CampyGen gas generating system sachet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CN0025A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campylobacter QUIK CHEK</td>
			<td>TechLab, Inc.</td>
			<td>T5047 / T31025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary-Blair transport medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-005-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coli Roller Sterile plating beads</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Buffer</td>
			<td>Anaerobe Systems</td>
			<td>AS-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc</td>
			<td>SFBM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>243973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9090-0460</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture methods to determine the limit of detection and survival in transport media of campylobacter jejuni in human fecal specimens

Un cultivo de heces humanas para el diagnóstico de la enfermedad intestinal basada en Campylobactertoma varios días, una espera que grava la fortaleza del médico y del paciente. Un cultivo también es propenso a resultados falsos negativos de la pérdida aleatoria de viabilidad durante la manipulación de muestras, el crecimiento excesivo de otras floras fecales y el pobre crecimiento de varias especies patógenas de Campylobacter en medios tradicionales. Estos problemas pueden confundir las decisiones clínicas sobre el tratamiento del paciente y han limitado el campo de responder preguntas fundamentales sobre el crecimiento de Campylobacter y las infecciones. Describimos un procedimiento que estima el límite inferior de números bacterianos que puede ser detectado por un cultivo y un método para cuantificar la supervivencia de C. jejuni en medios utilizados para el transporte de este organismo frágil. Conociendo esta información, es posible establecer umbrales de detección clínicamente relevantes para las pruebas diagnósticas y abordar problemas no estudiados de si la colonización no sintomática es frecuente, si la coinfección con otros patógenos entéricos es común, o si la carga bacteriana se correlaciona con síntomas o secuencias graves. El estudio también incluyó pruebas de 1.552 muestras fecales diarreicas de pacientes recogidas prospectivamente que fueron clasificadas inicialmente por cultivo convencional y probadas por un nuevo inmunoensayo enzimático. Los especímenes positivos y discretos fueron examinados por cuatro métodos moleculares para asignar un estado verdadero positivo o verdadero negativo. Los 5 métodos no cultivos mostraron un acuerdo completo sobre los 48 especímenes positivos y discretos, mientras que el cultivo identificó erróneamente 14 (28%). Los especímenes que fueron identificados incorrectamente por cultivo incluyeron 13 falsos negativos y 1 muestra de falsos positivos. Este protocolo básico se puede utilizar con múltiples Campylobacter spp. y permitirá determinar el número de bacterias Campylobacter que producen síntomas de gastroenteritis en humanos y actualizar las tasas de prevalencia.

Identificar las colonias de Campylobacter spp. entre la flora fecal competidora requiere una visión aguda y un juicio considerable. No se ha estudiado el menor número de colonias que pueden ser detectadas por cultivo, aunque se ha estimado que los especímenes de pacientes albergan 106x 109 CFU/ml16,17. Sin embargo, las muestras de pacientes no se pueden utilizar cuantitativamente, ya que no existe un método independiente para establecer números bacterianos precisos. Para superar esta limitación, se realizan dos mediciones simultáneas con un stock bacteriano. Una prueba se utiliza para la detección visual de colonias de Campylobacter a partir de diluciones en serie de las bacterias de la población en una matriz fecal, simulando muestras clínicas; el otro se utiliza analíticamente para cuantificar la CFU/ml presente en el cultivo de stock bacteriano utilizado para el pico(Figura 2A).
Los umbrales de detección de Campylobacter no serán valores definidos. Esto es de esperar porque cada matriz fecal es compleja y única, y el crecimiento de bacterias es variable. Un parámetro clave para el éxito es identificar las colonias de tamaño preciso entre la flora fecal competidora. En la Figura 2C y en la Figura 2Dse muestra una placa representativa del cultivo de heces con púas. La placa de control negativa sin Campylobacter añadido es importante para ayudar a identificar otra flora fecal. La tinción de Gram muchos candidatos también entrena el ojo para distinguir las colonias brillantes correctas y el color rosado intermedio de las bacterias gramnegativas teñidas de fucsion y confirma la morfología de las bacterias en las colonias seleccionadas(Figura 2B). Se realizaron siete experimentos independientes, utilizando caldos de 5 C. jejuni y 2 C. coli, y dieron umbrales que se superponían y abarcaban de 0,3 x 5 x 106 CFU/ml. Consulte la Tabla 2 para ver los datos típicos. Los límites de detección promediaron 2 x 106 para C. jejuni y 1,2 x 106 CFU/mL para C. coli. Esto indica que el cultivo probablemente puede detectar agar específico de Campylobacterque contiene antibióticos estándar utilizado por muchos laboratorios clínicos. Hay múltiples agars especializados con diferentes antibióticos que pueden dar diferentes umbrales para la detección de colonias. Los métodos descritos aquí deben fomentar estudios más cuantitativos y comparativos para mejorar la precisión de la cultura y ampliar la versatilidad de los nuevos medios. Por ejemplo, 152 colonias se contaron en el primer plato de 10-5 y 144 colonias en el segundo plato 10-5. El promedio entre las dos placas es de 148 colonias. Las placas fueron inoculadas con 0,1 ml (100 l) de dilución de 10-5, que por la ecuación 1 equivale a 148 x 106 (14,8 x 107) CFU/ml en el stock de cultivo puro. Cuando se hicieron las diluciones fecales, el cultivo se clavó en la piscina fecal negativa en una proporción de 1:1. Por lo tanto, por la Ecuación 2, el primer punto (placa "a") en la curva fecal corresponde a 14,8 x 107 dividido por 2 e es igual a 7,4 x 107 CFU/ml. Este tubo "a" se utiliza para hacer 9 diluciones adicionales. En la Figura 1,la última dilución con una colonia gramnegativa visible con la morfología de Campylobacter-como está en la placa "g". Esto equivale a 1.1 x 106 CFU/mL para el umbral de cultivo fecal de detección en este ejemplo.
A pesar de que la viabilidad sostenida es clave para la precisión del cultivo, la retención de la viabilidad de Campylobacter spp. durante la manipulación y el envío de especímenes de pacientes a clínicas para hacer referencia a laboratorios de referencia es problemática. El almacenamiento típico consiste en refrigerar las muestras en tubos tapados ordinarios con exposición al aire y sin atmósfera especial. Se cree que los especímenes en medios de transporte (también conocidos como muestras conservadas) tienen una mejor supervivencia, pero hay pocos informes que proporcionen datos cuantitativos18.
La combinación de métodos de muestra analíticos y inventados mostrados anteriormente se utilizó de nuevo para obtener estimaciones de tiempo de viabilidad y supervivencia de C. jejuni en medios de transporte. Se utilizó un caldo de caldo de caldo de caldo bacteriano para preparar diez diluciones de muestra duplicadas de 2 a 1024 veces en matriz fecal. El caldo inicial fue encontrado por los recuentos analíticos para tener una concentración de 4.8 x 107 CFU/mL. En las placas fabricadas el día 0, C. jejuni se detectó (2 días después) en la placa rayada con la dilución de 32 veces, equivalente a 1,5 x 106 CFU/ml. Sin embargo, en las placas hechas después de refrigerar la muestra fecal de Cary Blair durante 24 horas, sólo la dilución 2 veces (equivalente a 2,4 x 107 CFU/ml) creció colonias visibles. No se vio ninguna pérdida adicional de viabilidad a 96 horas, cuando el estudio se detuvo. Esta pérdida de viabilidad equivale a un 16 veces (94%) pérdida de organismos cultivables en menos de 24 horas e indica que, incluso con refrigeración, las heces en el medio de Cary Blair con menos de 107 CFU/ml C. jejuni pueden ser extrañadas por elcultivo.
A diferencia de los resultados del cultivo, la EIA detectó la presencia de C. jejuni en la dilución de 256 veces en el momento inicial y durante el período de prueba de 4 días. El umbral de detección de C. jejuni para esta EIA utilizando muestras fecales es de 8,4 x 104 CFU/ml. Este umbral está por debajo del de cultivo fecal y permite una detección más sensible y estable de C. jejuni.
Para probar la capacidad del cultivo para detectar Campylobacter spp. en un entorno clínico real, 1.552 muestras de heces clínicas se caracterizaron por 6 procedimientos: cultivo fecal, un nuevo inmunoensayo para Campylobacter spp., y 4 métodos moleculares. Todas las muestras fueron recogidas prospectivamente y clasificadas inicialmente por cultivo convencional en 3 laboratorios en los Estados Unidos, y luego cotebadas por EIA. Los métodos moleculares12examinaron todos los especímenes de cultivo positivo o EIA/cultura-discrepant. A los especímenes se les asignó un estado verdadero positivo o verdadero negativo basado en los resultados de los 5 métodos no de cultivo. Los 5 métodos no cultivos mostraron un acuerdo completo sobre los 48 especímenes positivos y discretos, mientras que el cultivo identificó erróneamente 14 (28%). Los especímenes que fueron identificados incorrectamente por cultivo incluyeron 13 falsos negativos y 1 muestra de falsos positivos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60457/60457fig1a.jpg"> Figura 1: Esquema para la preparación simultánea de muestras fecales analíticas y con púas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60457/60457fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60457/60457fig2a.jpg"> Figura 2: Identificación de colonias C. jejuni de cultivos puros y fecales. (A) Fotografía de las colonias C. jejuni del cultivo bacteriano puro después de 72 horas de incubación. (B) Mancha de Gram de C. jejuni del cultivo bacteriano puro, aumento de la inmersión en aceite 400x. (C) Fotografía de C. jejuni-cultivo fecal con púas positivas después de 48 h de incubación. (D) Área ampliada en caja en (C), aumento de 10x. Las flechas blancas indican colonias c. jejuni gramnegativas de tamaño de punto pin. La punta de flecha negra indica una colonia que es ligeramente más grande, gram-positiva, y no C. jejuni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60457/60457fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Culturas</td>
			<td>OD600 a T0</td>
			<td>OD600 a T Final1</td>
			<td>Final CFU/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. jejuni</td>
			<td>0.146</td>
			<td>0.321</td>
			<td>1.28 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. coli</td>
			<td>0.245</td>
			<td>0.508</td>
			<td>4.50 x 108
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Crecimiento típico y CFU/ml de c. jejuni y C. coli stocks. 1C. la cultura jejuni se detuvo después de 48 h de incubación. El cultivo de C. coli se detuvo después de 54 h de incubación.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Tubo de dilución para muestrafecal con púas</td>
			<td>Número de colonias Campylobacter-como</td>
			<td>Número de colonias Gram-negativas1</td>
			<td>¿Cultura positiva?</td>
			<td>CFU/ml calculado de muestra espigada</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="10">
C. jejuni (1.28 x 108 CFU/mL stock)</td>
			<td>(2 veces) a</td>
			<td>Denso</td>
			<td>nd2
</td>
			<td>Sí</td>
			<td>6.40 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4 veces) b</td>
			<td>20+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Sí</td>
			<td>3.20 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(8 veces) c</td>
			<td rowspan="3">4-10</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Sí</td>
			<td>1.60 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(16 veces) d</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Sí</td>
			<td>8.00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(32 veces) e</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Sí</td>
			<td>4.00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(64 veces) f</td>
			<td rowspan="4">1-3</td>
			<td>1 de 2</td>
			<td>Sí</td>
			<td>2.00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(128 veces) g</td>
			<td>2 de 3</td>
			<td>Sí</td>
			<td>1.00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>
3(256 veces) h
</td>
			<td>1 de 2</td>
			<td>Sí</td>
			<td>5.00 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(512 veces) i</td>
			<td>0 de 1</td>
			<td>No</td>
			<td>2.50 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(1024 veces) j</td>
			<td>0</td>
			<td>Nd</td>
			<td>No</td>
			<td>Pfn</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="10">
C. coli (4.50 x 108 CFU/mL stock)</td>
			<td>(2 veces) a</td>
			<td rowspan="2">Denso</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Sí</td>
			<td>2.25 x 108
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4 veces) b</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Sí</td>
			<td>1.13 x 108
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(8 veces) c</td>
			<td>50+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Sí</td>
			<td>5.63 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(16 veces) d</td>
			<td>30+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Sí</td>
			<td>2.81 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(32 veces) e</td>
			<td>10+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Sí</td>
			<td>1.41 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(64 veces) f</td>
			<td rowspan="2">3-8</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Sí</td>
			<td>7.03 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(128 veces) g</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Sí</td>
			<td>3.52 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>
3(256 veces) h
</td>
			<td rowspan="2">1-3</td>
			<td>1 de 3</td>
			<td>Sí</td>
			<td>1.76 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(512 veces) i</td>
			<td>0 de 1</td>
			<td>No</td>
			<td>8.79 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(1024 veces) j</td>
			<td>0</td>
			<td>Nd</td>
			<td>No</td>
			<td>Pfn</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Número típico de colonias en placas de muestras fecales espigadas. 1 Gramo de colonias negativas entre las colonias Campylobacter-como, 2o no determinadas, 3Los datos en negrita indican la última dilución positiva.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Especies</td>
			<td>Objetivo genético</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. jejuni</td>
			<td>hipO</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. coli</td>
			<td>cadF</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. upsaliensis</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. lari</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. helveticus</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. feto</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. hyointestinalis</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. concisus</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Genes útiles para la detección de especies individuales de Campylobacter qPCR.

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Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Aunque el cultivo de heces para Campylobacter es impreciso, todavía se considera el estándar de oro para la identificación. Se describen métodos para determinar el límite de detección y supervivencia en los medios de transporte de C. jejuni en heces humanas y se comparan con un nuevo inmunoensayo con mejor precisión.

Métodos de cultivo para determinar el límite de detección y supervivencia en los medios de transporte de Campylobacter Jejuni en especímenes fecales humanos

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

La dificultad del cultivo de Campylobacter ha inhibido estudios fundamentales como la menor cantidad de bacterias que se necesitan para producir enfermedades. Estas muestras analíticas y inventadas combinadas utilizadas aquí pueden abordar este problema. Esta técnica permite que los síntomas clínicos relevantes del paciente se correlacionen con un resultado positivo de cultivo fecal y, por primera vez, un número real de bacterias.Aprender cuántas bacterias se correlacionan con la enfermedad proporcionará diagnóstico, un objetivo importante para la detección y un método sólido para comparar la virulencia entre cepas o especies de Campylobacter. La cultura Campylobacter es sencilla, pero requiere una preparación rápida y organizada para mantener la viabilidad cuantitativa. También se necesita un juicio considerable para identificar las colonias de Campylobacter entre la flora fecal que compite en un plato.Antes de comenzar un cultivo de C.jejuni o C.coli, póngase guantes, una bata de laboratorio y gafas de seguridad, y coloque una hoja protectora desechable dentro de una capucha de seguridad de flujo laminar desinfectado. Usando una técnica estéril rayar cada caldo bacteriano hidratado o descongelado en una placa de agar específica de Campylobacter y colocar la placa a 37 grados Celsius durante 48 horas en un frasco anaeróbico que contiene un sobre generador de gas de atmósfera microaerbia. 24 horas más tarde, cubra libremente un matraz de caldo BHI y coloque el matraz en un frasco anaeróbico nuevo con un sobre que producirá un ambiente microeróbico para una incubación nocturna a 37 grados centígrados.A la mañana siguiente utilizar tres mililitros del caldo pre-reducido y un bucle de inoculación para raspar la placa de arranque de la cultura Campylobacter. Transfiera la suspensión a un tubo estéril e inocular los 97 mililitros restantes del caldo pre-reducido con los tres mililitros de lodos raspados. Coloque el caldo en el frasco con el sobre de gas e incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 115 revoluciones por minuto en una incubadora de temblores durante 48 a 72 horas, hasta que el cultivo alcance una densidad óptica a 600 nanómetros de no más de 4.Para establecer el número de bacterias en este cultivo de stock puro realizar ocho series de dilución 10 veces de 100 microlitros de caldo en 900 microlitros de dilución. Usando perlas de chapa estéril, esparza 100 microlitros de uno por 10 a la quinta negativa a la 10 a la séptima diluciones negativas en placas específicas de Campylobacter pre-reducidas duplicadas y placas de etiquetas con la concentración de dilución antes de colocar las placas en un segundo frasco anaerobio con un sobre generador de gas durante 48 a 72 horas a 37 grados Celsius. Al final del período de crecimiento seleccionar placas con entre 30 a 300 colonias para el conteo.Después de contar, utilice los recuentos para determinar las unidades formadoras de colonias por mililitro del cultivo del caldo de stock de acuerdo con la fórmula. Es fundamental que los recuentos de colonias analíticas sean precisos, ya que esto sustenta todos los pasos que utilizan la piscina fecal con púas. Inmediatamente después del chapado para contar como se ha demostrado, mezcle volúmenes iguales de caldo y campylobacter piscina fecal negativa y haga nueve diluciones dobles posteriores en la piscina fecal negativa, añadiendo una placa de control con caldo que no contenga Campylobacter a la piscina fecal para ayudar a identificar las colonias no campylobacter.Raya 10 microlitros de cada dilución de heces De Campylobacter en placas de agar específicas de Campylobacter pre-reducidas duplicadas e incubar las placas en frasco anaeróbico con un sobre generador de gas a 37 grados Celsius durante aproximadamente 48 horas. Al final de la incubación examina visualmente las placas rayadas en busca de colonias que se asemejan a las de las culturas puras de Campylobacter. Para confirmar que las colonias son en realidad Campylobacter seleccionar múltiples Campylobacter como colonias para la tinción de gramos y visualizar un área delgadamente rayada por microscopía de luz utilizando una lente de inmersión de aceite para identificar bacterias pequeñas curvas gram-negativas, espirales o en forma de cigarro.Una placa de control negativa sin Campylobacter añadido es importante para ayudar a identificar otras flora fecales. Considere la última dilución que contiene una colonia gramnegativa similar a Campylobacter el límite de la detección de cultivo. Y utilice la fórmula para calcular las unidades formadoras de colonias por mililitro de la dilución positiva en muestras fecales clínicas inventadas.Para determinar la viabilidad de Campylobacter almacenado en medio de transporte mezclar un mililitro de cultivo de caldo Campylobacter con un mililitro de piscina fecal negativa y preparar 10 diluciones seriales duplicadas dobles en piscina fecal negativa. Diluir aún más cada dilución en una proporción adicional de uno a cuatro en el medio Cary-Blair y almacenar los 20 tubos de dilución y un control negativo en el medio Cary-Blair en tubos de tapa a dos a ocho grados celsius durante 96 horas. A partir del tiempo cero y cada 24 horas a partir de entonces raya 10 microlitros alícuotas de cada dilución en placas de agar selectivo Campylobacter e incuba las placas a 37 grados Celsius durante 48 horas.Como no existe un método independiente para establecer números bacterianos precisos a partir de muestras de pacientes, se pueden realizar dos mediciones simultáneas con un stock bacteriano puro. Una prueba se utiliza para la detección visual de colonias de Campylobacter a partir de diluciones seriales de la bacteria en una matriz fecal, simulando muestras clínicas. La otra prueba se utiliza analíticamente, cuantificar las unidades formadoras de colonias por mililitro presente en el mismo cultivo de bacterias utilizado para el pico.Un parámetro clave para el éxito es identificar las colonias de tamaño preciso entre la flora fecal competidora, como lo ilustra esta placa representativa del cultivo de heces espiadas. Aquí, se pueden observar datos típicos de siete experimentos independientes. No basta con identificar colonias que se asemejan a Campylobacter dentro de las culturas fecales.Todas las colonias deben confirmarse con manchas de gramo o métodos más avanzados. Utilizamos un inmunoensayo enzimático que es más preciso que el cultivo para detectar especies poco comunes como C.upsaliensis o C.lari, que crecen mal con el agar que contiene antibióticos estándar. Esta técnica sienta una base necesaria para estudiar cosas como el transporte no sintomático de Campylobacter y si las altas cargas bacterianas ponen a un paciente en mayor riesgo de consecuencias graves de la infección por Campylobacter.Use siempre EPP cuando trabaje con bacterias, que a menudo son infecciosas y pueden ser peligrosas, y con la piscina fecal negativa que puede contener patógenos desconocidos incluso cuando se recogen de donantes sanos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Investigación

Inmunología e Infección

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

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Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para<em&gt; Burkholderia</em&gt; Especies

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

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