Name: culture methods to determine the limit of detection and survival in transport media of campylobacter jejuni in human fecal specimens
Uploaded: 2020-03-10T12:30:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens at JoVE.com

Bu çalışmalar TECHLAB, Inc. tarafından finanse edilmiştir.

1. Contrived İnsan Dışkı Örneklericampylobacter Numaralandırma
NOT: Tüm adımlar steril teknik ve malzemeler dezenfekte laminar akış güvenlik kaputu içinde tek kullanımlık koruyucu levha üzerinde yapılır.
DİkKAT: Canlı Campylobacter bulaşıcı dır ve ishal de dahil olmak üzere hastalığa neden olabilir. Bakterileri kullanırken eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü takın. Ağız pipet etmeyin. Bakterilerle temas eden tüm maddeleri uygun biyolojik tehlike kaplarında atın.
<ol><li>Bakterilerin stok kültürünün büyümesi<ol>
<li>C. jejuni (ATCC-33560) veya C. coli (ATCC 33559)(Malzeme Tablosu)suşlarını kurutulmuş veya dondurulmuş kültürler olarak elde edin ve üreticinin talimatlarına göre bakterileri rehydrate veya eritin. Rehydrated bakterileri campylobacter-spesifikagar plakasına koyve kültürü başlatın. Mikroaerobik atmosfer gaz üreten poşet içeren anaerobik bir kavanozda 37 °C'de plaka48 h kuluçka.</li>
		<li>Ertesi gün, beyin-kalp infüzyonu 100 mL hazırlamak (BHI) büyüme suyu içeren 0.5% triptikal, 0.5% proteaz pepton, 0.0125% sodyum pirüuvat, ve 0.0125% sodyum bisülfit.</li>
		<li>Önceden gevşek şişe kapsayan ve bir mikroaeroofilik ortam üretecek bir poşet ile anaerobik bir kavanoza yerleştirerek BHI suyu azaltmak. Suyu bir gecede 37 °C'de önceden azaltın. Benzer şekilde, 1.1.10 ve 1.2.2 adımlarında koloni sayımları için kullanılacak Campylobacter-spesifikplakaları önceden küçültün.</li>
		<li>Campylobacter havaya duyarlı olduğundan, et suyu aşılamadan önce tüm malzemeleri toplamak ve kültürleri işleme sırasında aylaklık etmeyin. Aşılamaya hazır olduğunuzda, fetal büyükbaş serumu (FBS) toplam hacmin %4'üne kadar azaltılmış et suyuna ekleyin. 600 nm (OD600)optik yoğunluk ölçümlerinde boş olarak hizmet vermek için önceden küçültülmüş et suyu 1 mL koruyun.</li>
		<li>FBS içeren önceden azaltılmış suyu 3 mL çıkarın ve Campylobacter kültürünü içeren başlangıç plakası kazımak için et suyu kullanın. Plakayı bir aşı halkası ile hafifçe kazıyın ve bakteriyel bulamacı steril bir tüpe aktarın.</li>
		<li>100 mL önceden küçültülmüş suyu yaklaşık 3 mL bakteriyel bulamaç ile aşılayın ve gaz üreten poşet içeren bir anaerobik kavanozda 37 °C'de 115 rpm'de orta sallayarak inkübatör.</li>
		<li>OD600'debakteri spektrofotometrik olarak bulanıklık la büyümesini izleyin. Ayrılmış suyu boş olarak kullanın. Anaerobik kavanoz açılırsa, gaz üreten poşeti değiştirin.</li>
		<li>48−72 h'den veya OD600 değeri ~0,4'e ulaşmadan önce et suyu kuluçkasını durdurun. NOT: Bu OD600 genellikle 107-10 8 CFU/mL eşittir. Tipik sonuçlar için Tablo 1'e bakın.</li>
		<li>Saf stok kültüründe bakteri sayısını belirlemek için, 900 μL seyreltme tamponu(Malzeme Tablosu)içinde 100 μL'lik 8 adet 10 kat seyreltme serisi gerçekleştirin. 100 μL'lik et suyu ilk seyreltme için çıkarıldıktan sonra, şişeyi taze gaz üreten poşetle anaerobik kavanoza geri döndürün.</li>
		<li>10-5 ila 10-7 seyreltmelerin 100 μL'sini, 1.1.3 adımdan çoğaltılmış önceden indirgenmiş Campylobacter-spesifikplakalara yaymak için steril kaplama boncukları kullanın. Kullanılan seyreltme li etiket plakaları, gaz üreten poşetli ikinci bir anaerobik kavanoza koyun ve 37 °C'de 48−72 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Seyreltme şeması ve kolonifotoğrafları için Şekil 1 ve Şekil 2'ye bakınız.</li>
		<li>Büyümeden sonra, saymak için 30−300 koloniler arasında plaka seçin. Denklem 1'i kullanarak stok suyu kültürünün CFU/mL'sini belirlemek için sayımları yararlanın: Stoktaki CFU/mL = Seçilen (yinelenen) analitik plakalar üzerindeki kolonilerin ortalama #ı ÷ (mL kaplamalı x plakaseyreltme) [Denklem 1] 
</li>
	</ol></li>
	<li>Contrived klinik dışkı örneklerinin hazırlanması ve numaralandırması<ol>
<li>Analitik sayımlar için plakalar adım 1.1.10'da hazırlandıktan hemen sonra, stok suyu ve Campylobacter-negatif dışkı havuzundan (NFP) 10 seri 2 kat seyreltme ler hazırlayarak ikinci bir stok suyu seyreltme seti yapın. Örneğin, eşit hacimlerde et suyu ve NFP'yi (örn. 0,1 mL) karıştırarak ilk seyreltmeyi hazırlayın ve belirlenen bir et suyu ve NFP karışımını eşit belirlenmiş hacimli NFP ile bir tüpe aktararak sonraki seyreltmeleri yapın. Olmayan Campylobacter kolonileri belirlemeye yardımcı olmak için dışkı havuzuna eklenen hiçbir Campylobacter içeren et suyu ile bir kontrol plakası ekleyin.<ol>
<li>NFP'yi daha önce test edilmiş ve Campylobacterenzim immünoassay ve 16S rRNA qPCR gibi yöntemlerle negatif olarak test edilmiş, ishal edilen hasta gözetim örneklerinden veya sağlıklı donör dışkılarından yapın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>T-streak 10 μL her Campylobacter/ dışkı seyreltme çoğaltılmış önceden indirgenmiş Campylobacter-özel agar plakaları üzerinde. Plakaları gaz üreten bir poşetle anaerobik kavanoza yerleştirin ve 37 °C'de 48 ± 2 saat boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Saf Campylobacter kültürlerinden benzer koloniler için çizgili plakaları görsel olarak inceleyin. NOT: Üçüncü çeyrek genellikle bunların bulunacağı yerdir. Seyreltme şeması ve koloni boyutu, renk ve morfolojigörüntüleri için Şekil 1 ve Şekil 2'ye bakınız.</li>
		<li>Koloniler ve Gram lekesi gibi birden fazla Campylobacterseçin. Bir yağ daldırma lens ile mikroskopi kullanarak, gram-negatif kavisli, spiral veya puro şeklinde küçük bakteriler için ince çizgili bir alan incelemek. NOT: Campylobacter Gram-negatif ve bir karşı leke olarak temel fuşin gerektirir (tipik safranin yerine) doğru görselleştirilmesi için. Klasik martı kanatlı bakteriler görülebilir ama bir gereklilik değildir. Temsili mikrograf için Şekil 2'ye bakınız.</li>
		<li>Belirli bir seyreltme de yinelenen plakalar biri 1 veya daha fazla Campylobacter kolonileri mevcut varsa, bu seyreltme dışkı kültürü olumlu düşünün.</li>
		<li>Görünür bir Campylobacteriçeren son seyreltme düşünün -gram-negatif koloni gibi kültür algılama sınırı. Kontrived klinik dışkı örneğinde pozitif seyreltmenin CFU/mL'sini hesaplamak için Denklem 2'yi kullanın: Dışkı örneğinde CFU/mL = Analitik CFU/mL ÷ Son pozitif koloni ile seyreltme [Denklem 2] NOT: Tipik sonuçlar için Tablo 2'ye bakınız.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ulaşım Medyasında Depolanan Campylobacter'in Canlılık Tayini
<ol><li>Mix 1 mL Campylobacter et suyu kültürü (adım 1.1.8) NFP 1 mL ile ve NFP 10 yinelenen iki kat seri seyreltme hazırlamak. Her seyreltme daha fazla seyreltmek için Cary-Blair medyasında 1:4 ilave, tıpkı taşıma medyasında hazırlanan bir klinik numunenin tedavi edilmesi gibi.</li>
	<li>Cary-Blair ortamlarında 20 seyreltme tüpünü ve negatif kontrolü 2−8 °C'de 96 saat boyunca saklayın ve sıfır zamanda ve her 24 saatte bir meydana gelen her seyreltme kolonisini depolayın. Koloni sayma için, her seyreltme koloni sayma için et suyu örnek: dışkı tüpleri ve kurulum dışkı kültürü, yinelenen.</li>
	<li>Her gün 1.1.9−1.2.7 adımlarında açıklandığı gibi, Campylobacter-selektif agar ve kuluçka 37 °C'de dışkı seyreltmelerinin 10 μL porsiyonlarını 48 saat boyunca tamamlayın.</li>
	<li>Yukarıda açıklandığı gibi orijinal bakteri stokunun (adım 1.1.8 veya taze olarak yetiştirilen bir et suyu stokundan) eşzamanlı analitik plaka sayımıyapın (adım 1.1.9−1.1.11) gerçekleştirin. Orijinal bakteri stokunun CFU/mL'sini(Denklem 1)hesaplayın ve taşıma ortamı dışkı örneğindeki bakterilerin konsantrasyonunu ve seyreltmelerini hesaplayın(Denklem 2).</li>
</ol>3. Kültür Dışı Kültür Sonuçlarının Doğrulanması Nasiması
<ol><li>En az yanlış pozitif sonuçlar12 veren bir enzim immünoassay (EIA) kullanın ve kültür sonuçlarını doğrulamak için paket ekleme talimatlarına göre gerçekleştirin.</li>
	<li>Campylobacter türlerinin geniş bir yelpazede 16S rRNA geni veya diğer gen tespit edebilirsiniz moleküler bir titre kullanabilirsiniz13. Moleküler testin C. upsaliensis veya C. lari gibi standart antibiyotik içeren agar14'tekötü büyüyen türlerle reaksiyona girer olduğunu doğrulayın. Dışkı örneklerinden DNA çıkarma ve testi gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarına uyun. NOT: 16S amplicon çift yönlü DNA sıralaması olumlu bir örnek campylobacter türünü doğrulamak için kullanılabilir. Türlere özgü PCR (hedef genler için Tablo 3'e bakınız) ayrık veya pozitif örneklerde bulunan türleri tanımlamak için de kullanılabilir15.</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Annual Summaries of Foodborne Outbreaks Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html">https://www.cdc.gov/fdoss/annual-reports/index.html</a> (2018)</li><li>Kaakoush, N. O., Casta&#241;o-Rodr&#237;guez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Epidemiology+of+Campylobacter+Infection.">Global Epidemiology of Campylobacter Infection.</a> Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 687-720 (2015).</li><li>Pitkanen, T. a., H, M. L., Rose, J. B., Jimenez-Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global Water Pathogen Project. , (2017).</li><li>Fitzgerald, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+Evaluation+of+Clinical+Diagnostic+Methods+for+Detection+and+Isolation+of+Campylobacter+spp.+from+Stool.">Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1209-1215 (2016).</li><li>Kirkpatrick, B. D., Tribble, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+human+Campylobacter+jejuni+infections.">Update on human Campylobacter jejuni infections.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 27 (1), 1-7 (2011).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+Trends+of+Infection+with+Pathogens+Transmitted+Commonly+Through+Food+-+Foodborne+Diseases+Active+Surveillance+Network,+10+U.S.+Sites,+2006-2013.">Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006-2013.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 63, 328-332 (2014).</li><li>Jaime, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+upsaliensis:+Another+Pathogen+for+Consideration+in+the+United+States.">Campylobacter upsaliensis: Another Pathogen for Consideration in the United States.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (11), 59-60 (2002).</li><li>Bullman, S., O'Leary, J., Corcoran, D., Sleator, R., Lucey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-based+detection+of+non-culturable+and+emerging+campylobacteria+in+patients+preseting+with+gastroenteritis.">Molecular-based detection of non-culturable and emerging campylobacteria in patients preseting with gastroenteritis.</a> Epidemiology and Infection. 140, 684-688 (2012).</li><li>Giltner, C. L., Saeki, S., Bobenchik, A. M., Humphries, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Campylobacter+Antigen+by+Enzyme+Immunoassay+Leads+to+Increased+Positivity+Rates.">Rapid Detection of Campylobacter Antigen by Enzyme Immunoassay Leads to Increased Positivity Rates.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 618-620 (2013).</li><li>M'ikanatha, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+stool+specimens+for+Campylobacter+spp.,+Pennsylvania,+USA.">Culturing stool specimens for Campylobacter spp., Pennsylvania, USA.</a> Emerging Infectious Disease. 18, 484-487 (2012).</li><li>Al Amri, A., Senok, A. C., Ismaeel, A. Y., Al-Mahmeed, A. E., Botta, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+direct+identification+of+Campylobacter+spp.+in+human+and+chicken+stools.">Multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. in human and chicken stools.</a> Journal of Medical Microbiology. 56 (10), 1350-1355 (2007).</li><li>Buss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+culture+fails+to+correctly+detect+Campylobacter+in+30%+of+positive+patient+stool+specimens+compared+to+non-cultural+methods.">Campylobacter culture fails to correctly detect Campylobacter in 30% of positive patient stool specimens compared to non-cultural methods.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 38, 1087-1093 (2019).</li><li>Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Multiplex+Real-Time+PCR+Assay+for+Detecting+Major+Bacterial+Enteric+Pathogens+in+Fecal+Specimens:+Intestinal+Inflammation+and+Bacterial+Load+Are+Correlated+in+Campylobacter+Infections.">Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).</li><li>Couturier, B. A., Hale, D. C., Couturier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Campylobacter+upsaliensis+with+Persistent+Bloody+Diarrhea.">Association of Campylobacter upsaliensis with Persistent Bloody Diarrhea.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3792-3794 (2012).</li><li>Chaban, B., Musil, K. M., Himsworth, C. G., Hill, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cpn60-Based+Real-Time+Quantitative+PCR+Assays+for+the+Detection+of+14+Campylobacter+Species+and+Application+to+Screening+of+Canine+Fecal+Samples.">Development of cpn60-Based Real-Time Quantitative PCR Assays for the Detection of 14 Campylobacter Species and Application to Screening of Canine Fecal Samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 3055-3061 (2009).</li><li>Allos, B., Blaser, M. J., Mandell, G. L., Bennett, J. E., Dolin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed. , 2793-2802 (2009).</li><li>Anderson, N. W., Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+BD+MAX+Enteric+Bacterial+Panel+to+Routine+Culture+Methods+for+Detection+of+Campylobacter,+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+(O157),+Salmonella,+and+Shigella+Isolates+in+Preserved+Stool+Specimens.">Comparison of the BD MAX Enteric Bacterial Panel to Routine Culture Methods for Detection of Campylobacter, Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157), Salmonella, and Shigella Isolates in Preserved Stool Specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1222-1224 (2014).</li><li>Wasfy, M., Oyofo, B., Elgindy, A., Churilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+preservation+media+for+storage+of+stool+samples.">Comparison of preservation media for storage of stool samples.</a> Journal of Clinical Microbiology. 33 (8), 2176-2178 (1995).</li><li>Bess&#232;de, E., Delcamp, A., Sifre, E., Buissonniere, A., M&#233;graud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Methods+for+Detection+of+Campylobacters+in+Stool+Samples+in+Comparison+to+Culture.">New Methods for Detection of Campylobacters in Stool Samples in Comparison to Culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 49 (3), 941-944 (2011).</li><li>Bess&#232;de, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Diagnostic+Accuracy+of+Two+Immunochromatographic+Tests+Detecting+Campylobacter+in+Stools+and+Their+Role+in+Campylobacter+Infection+Diagnosis.">Evaluation of the Diagnostic Accuracy of Two Immunochromatographic Tests Detecting Campylobacter in Stools and Their Role in Campylobacter Infection Diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), (2018).</li><li>Shane, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Diseases+Society+of+America+Clinical+Practice+Guidelines+for+the+Diagnosis+and+Management+of+Infectious+Diarrhea.">Infectious Diseases Society of America Clinical Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Infectious Diarrhea.</a> Clinical Infectious Diseases. 65 (12), 1963-1973 (2017).</li><li>Toledo, Z., Simaluiza, R. J., Astudillo, X., Fern&#225;ndez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+and+antimicrobial+susceptibility+of+thermophilic+Campylobacter+species+isolated+from+healthy+children+attending+municipal+care+centers+in+Southern+Ecuador.">Occurrence and antimicrobial susceptibility of thermophilic Campylobacter species isolated from healthy children attending municipal care centers in Southern Ecuador.</a> Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 59, 77-77 (2017).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symptomatic+and+asymptomatic+Campylobacter+infections+associated+with+reduced+growth+in+Peruvian+children.">Symptomatic and asymptomatic Campylobacter infections associated with reduced growth in Peruvian children.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (1), 2036 (2013).</li></ol>

Yazarlar TECHLAB, Inc bu makalede bir karşılaştırıcı olarak kullanılan QUIK CHEK™ kiti üreten çalışanlarıdır.

Burada açıklanan kültür yöntemleri basit, yaygın olarak kullanılan teknikler ve malzemelerin çoğulaboratuvar10mevcuttur üzerine inşa edilmiştir. Dışkı kültürleri için klinik olarak ilgili bir algılama eşiği hakkında yeni bilgiler sağlayan analitik ve contrived örneklerin birleşimidir. Ayrıca, 5 ayrı tahlil ile kültür sonuçlarının karara Campylobacter dışkı kültürünün hasta örneklerinin önemli bir bölümünü yanlış tanımladığı vardığı sonuçları güçlendirir. ÇED ve moleküler tahliller kontrol ler olarak yararlıdır, çünkü her biri farklı bir ilkeye (antikor ve DNA amplifikasyonu ile antijen etkileşimi) dayanır ve daha da önemlisi bakterilerin canlılığına güvenmez. Bu çalışmalar da kullanılan EIA tahliliyi iyi doğrulanmış olduğunu ve 4 moleküler test12ile tam olarak aynı fikirde olduğu gösterilmiştir unutmayın.
Campylobacter spp. Kültürü özellikle zahmetli, duyarlılık 60−76%19,20arasında değişen rapor ve burada gerçek-pozitif örnekleri tespit etmek için başarısızlık onun ~ 30% oranı belirgin. Personel, kültür verileri negatif olduğunda, eia kontrolü ve moleküler testlerin sık lıkla olumlu sonuçlar doğuracağını bekleyebilir.
Protokoldeki en kritik adım, rakip dışkı florası arasında pin noktası kolonilerinin belirlenmesidir. Algılama eşiğine yakın seyreltmeler olarak, alternatif sıfır ve sıfır olmayan koloni sayısı tahminlerine (örneğin, 2, 0, 1, 0, 0) sahip olmak olağandışı değildir. Kültür eşiklerinin belirli bir CFU/mL değil, bir dizi konsantrasyon olacağını kabul etmek önemlidir. Yine de, kültür tespiti için bir alt sınır olarak ~ 1 x 106 CFU / mL dışkı tahmini enfekte insanlar gram dışkı21başına 106 ila 109Campylobacter döken raporları ile iyi karşılaştırır . Antibiyotikler veya agar plakaları ve varyasyonları bireysel dışkı örneklerikaçınılmaz değişiklikler şüphesiz eşik değerleri değişecektir. Bu protokol, büyüme medyasında iyileştirmelere olanak sağlamalıdır.
Kültür algılama için bir sınır bu ilk bilgi mümkün tanı testleri için klinik olarak ilgili eşikleri ayarlamak için yapar, ve non-semptomatik taşıma incelenmemiş sorunları ele almak için gerekli olan mikrobiyolojik temel koyar22, Campylobactertarafından23 , ya da bakteriyel yük belirtileri veya ciddi sekel ile ilişkili ise.

Amerika Birleşik Devletleri Hastalık Kontrol Merkezleri (CDC) son zamanlarda Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) gözetim programı 2018 yılında laboratuvar tanısı Campylobacter enfeksiyonları9.723 vaka bildirdi yayınladı1. Bu, 2015−2017 1'deki Campylobacter vaka raporlarında%12'likbir artışı temsil eder. Dünya çapında, Campylobacter spp. en sık bakteriyel bağırsakenfeksiyonlarıarasında 2 . Bununla birlikte, her yıl meydana gelen Campylobactertabanlı bağırsak hastalıklarının sayısı3underreported olduğundan şüpheleniliyor. Çoğu hasta sadece orta rahatsızlık ve hiçbir tıbbi tedavi ile kurtarabilirsiniz, çünkü bu küçümseme tahmin edilebilir. Ancak, daha ciddi semptomları olan veya ciddi hastalık için daha yüksek risk altında olan ve daha sonra tıbbi bakım arayan hastalar için, dışkı kültürü Campylobacter onların sıkıntı neden olan patojen olup olmadığını değerlendirmek için en yaygın yöntemdir4.
Campylobacter spp için, dışkı kültürü özellikle zahmetli. En sık görülen patojenik organizmalar, C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis, ve C. lari, mikroaofilik5. Bu bakteri bir kez havaya maruz rasgele, bilinmeyen oranlarda ölecek anlamına gelir. Böylece numune toplama ve kültür kurulumu arasındaki zaman, kültüre göre uygulanabilir Campylobacter spp.'yi tespit etme yeteneğinde kontrolsüz bir değişken haline gelir.
Dışkı örneklerinin doğrudan kültürü için Campylobacter'ın yavaş büyümesi de bir sorundur. Campylobacter kolonileri kuluçka 48 saat sonra bile çok küçük ve kolayca dışkı matris rakip organizmalar tarafından kaplanabilir. C. jejuni ve C. coli en suşları dirençli olan antibiyotik içeren plakalar yaygın olarak kullanılır, antibiyotikler birçok büyümesini inhibe olarak (ama hepsi değil) rakip dışkı bakterilerinin, Campylobacter kolonilerin daha iyi görselleştirilmesine izin6. Ancak, C. lari ve C. upsaliensis gibi diğer Campylobacter türleri bu antibiyotiklerin bazılarına duyarlıdır, ve ya kötü ya da hiç büyümek. Bu bu antibiyotiğe duyarlıtürler campylobacter enfeksiyonların underreporting katkıda 7 .
Campylobacter için bir kültürün yanlış olmasının üçüncü bir nedeni vardır. Bakteri, stresli, canlı kalabilir ama "non-culturable"8olabilir. Bu tanım, kültürün örnekte bulunan bakterileri tespit edeceği anlamına gelir. Bunun ne sıklıkta oluştuğu bilinmemektedir8.
Kültür ile bu potansiyel sorunlar göz önüne alındığında, hatalı kültür sonuçları tek bir karşılaştırıcı taht yanlış 9 görünmesi vermedi, böylece birden fazla karşılaştırma başvuru yöntemlerikullanılır. Kullanılan kültür yöntemleri (örneğin, Campylobacter-seçici plakalar, taşıma ortamı, gaz üreten poşetler) dışkı numune sikültürü için klinik laboratuvarlarda yaygın olarak kullanıldığından seçilmiştir10.
Burada açıklanan kültür protokolleri, insan dışkısında kültür tarafından tespit edilebilen en düşük Campylobacter jejuni sayısı bilinmeden geliştirildi. Kümes hayvanı dışkısı11'debulunan koloni oluşturan birimlerin (CFU) sayısı için tahminler yayınlanmış olsa da, campylobacter spp. tavuklarda kommensal olduğu ve ishale neden olmadığı için bu sonuçlar insan dışkısına eşit olamaz. Bu temel bilgi insanlarda gastroenterit belirtileri üretecek Campylobacter bakteri sayısını belirlemek ve suşları veya türler arasında virülans karşılaştırmak için gereklidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anaerobic 3.5L Jar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HP0031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>AG701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Protease Peptone</td>
			<td>Life Technologies Corp</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fuchsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B12544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase Peptone</td>
			<td>Life Technologies Corp</td>
			<td>211921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. coli Type strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>33559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. jejuni Type strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>33560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CampyGen gas generating system sachet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CN0025A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campylobacter QUIK CHEK</td>
			<td>TechLab, Inc.</td>
			<td>T5047 / T31025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cary-Blair transport medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-005-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coli Roller Sterile plating beads</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution Buffer</td>
			<td>Anaerobe Systems</td>
			<td>AS-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc</td>
			<td>SFBM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>243973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9090-0460</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture methods to determine the limit of detection and survival in transport media of campylobacter jejuni in human fecal specimens

Campylobactertabanlı bağırsak hastalığı tanısı için insan dışkı bir kültür birkaç gün sürer, bir bekleyin bu vergi hekim ve hastanın metanet. Bir kültür de örnek işleme sırasında canlılık rasgele kaybı, diğer dışkı florasının aşırı büyüme ve geleneksel medya üzerinde çeşitli patojenik Campylobacter türlerin in kötü büyüme yanlış negatif sonuçlareğilimli. Bu sorunlar hasta tedavisi ile ilgili klinik kararları şaşırtmak ve Campylobacter büyüme ve enfeksiyonlar hakkında temel sorulara cevap alan sınırlı dır. Bir kültür tarafından tespit edilebilen bakteri sayılarının alt sınırını tahmin eden bir prosedür ve bu kırılgan organizmanın taşınması nda kullanılan ortamda C. jejuni'nin sağkalımını ölçmek için bir yöntem tanımladık. Bu bilgileri bilerek, tanısal testler için klinik olarak ilgili algılama eşikleri belirlemek ve semptomatik olmayan kolonizasyonun yaygın olup olmadığı, diğer enterik patojenlerle birlikte enfeksiyon yaygın olup olmadığı veya bakteriyel yükün semptomlar veya ciddi sekellerle ilişkili olup olmadığı gibi incelenmemiş sorunları ele almak mümkün olur. Çalışma da başlangıçta konvansiyonel kültür tarafından sınıflandırılan ve daha yeni bir enzim immünoassay tarafından test edildi 1.552 prospektif olarak toplanan hasta ishal dışkı örneklerinin test dahil. Pozitif ve ayrık örnekler daha sonra gerçek-pozitif veya doğru-negatif durum atamak için dört moleküler yöntemle tarandı. Kültür dışı 5 yöntem, 48 pozitif ve ayrık numunenin tümü üzerinde tam bir anlaşma gösterirken, kültür 14'ünü (%28) yanlış tanımlamıştır. Kültür tarafından yanlış tanımlanan örnekler arasında 13 yanlış negatif ve 1 yanlış pozitif örnek yer al›rıldı. Bu temel protokol birden fazla Campylobacter spp ile kullanılabilir ve insanlarda gastroenterit belirtileri üreten Campylobacter bakteri sayısıbelirlenecek ve yaygınlık oranları güncellenmesi için izin verecektir.

Rakip dışkı florası arasında Campylobacter spp. kolonilerin belirlenmesi keskin görme ve önemli bir yargı gerektirir. Kültür tarafından tespit edilebilen en düşük koloni sayısı incelenmemekle birlikte, hastalardan alınan örneklerin 106−109 CFU/mL16,17olduğu tahmin edilmektedir. Ancak doğru bakteri sayılarını belirlemek için bağımsız bir yöntem olmadığı için hasta örnekleri nicel olarak kullanılamaz. Bu sınırlamayı aşmak için, bir bakteri stoku ile iki eşzamanlı ölçüm yapılır. Bir test, campylobacter kolonilerinin fekal matriksteki stok bakterilerin seri seyreltmelerinden görsel olarak saptanması nda kullanılır, klinik numuneleri simüle eder; diğeri ise spiking için kullanılan bakteri stok kültüründe bulunan CFU/mL'yi ölçmek için analitik olarak kullanılır (Şekil 2A).
Campylobacter için algılama eşikleri tanımlı değerler olmayacaktır. Her dışkı matris karmaşık ve benzersiz ve bakterilerin büyüme değişken olduğu için bu beklenebilir. Başarı için önemli bir parametre rakip dışkı florası arasında kesin boyut kolonileri belirlenmesidir. Çivili dışkı kültürünün temsili bir plakası Şekil 2C ve Şekil 2D'degösterilmiştir. Campylobacter olmadan negatif kontrol plakası diğer dışkı florası belirlemeye yardımcı olmak için önemlidir. Gram boyama birçok aday da doğru parlak koloniler ve fuşin lekeli gram-negatif bakterilerin ara pembe renk ayırt etmek için göz trenler ve seçilen kolonilerde bakterilerin morfolojisi doğrular(Şekil 2B). 5 C. jejuni ve 2 C. coli suyu kullanılarak yedi bağımsız deney yapıldı ve 0.3−5 x 106 CFU/mL'den çakışan eşikler verildi. Tipik veriler için Tablo 2'ye bakın. Algılama limitleri C. jejuni için ortalama 2 x 106 ve C. coliiçin 1.2 x 106 CFU/mL. Bu kültür büyük olasılıkla standart antibiyotik içeren Campylobacterüzerinde dışkı numunegram başına ~ 1−2 x 106C. jejuni veya C. coli tespit edebilirsiniz gösterir -birçok klinik laboratuvarları tarafından kullanılan özel agar. Koloni tespiti için farklı eşikler verebilir farklı antibiyotikler ile birden fazla özel agar vardır. Burada açıklanan yöntemler, kültürün doğruluğunu artırmak ve yeni medyanın çok yönlülüğünü genişletmek için daha nicel ve karşılaştırmalı çalışmaları teşvik etmelidir. Örneğin, ilk 10-5 plakada 152 koloni, ikinci10-5 plakada 144 koloni sayılmıştır. İki tabaka arasındaki ortalama 148 kolonidir. Plakalar 0.1 mL (100 μL) 10-5 seyreltme ile aşılanmıştır, bu da Denklem 1 ile saf kültür stoğunda 148 x 106 (14,8 x 107) CFU/mL'ye eşittir. Dışkı seyreltmeleri yapıldığında, kültür 1:1 oranında negatif dışkı havuzuna çivilendi. Bu nedenle, Denklem 2ile dışkı eğrisindeki ilk nokta ("a" levhası) 14,8 x 107'ye karşılık gelir ve 7,4 x 107 CFU/mL'ye eşittir. Bu "a" tüp 9 ek seyreltme yapmak için kullanılır. Şekil 1'de Campylobacterile görünür bir gram-negatif koloni ile son seyreltme -morfoloji si "g" plakası üzerindedir. Bu örnekte algılama dışkı kültür eşiği için 1.1 x 106 CFU/mL eşittir.
Sürdürülebilir canlılık kültürün doğruluğunun anahtarı olsa da, hastaların tedavi ve referans laboratuvarlarına numunelerin sevkiyatı sırasında Campylobacter spp.'nin canlılığının korunması sorunludur. Tipik depolama hava maruz ilerlik ve özel bir atmosfer ile sıradan kapaklı tüpler örnekleri soğutmak için. Taşıma medyasındaki örneklerin (korunmuş numuneler olarak da bilinir) daha iyi sağkalım alabildiği düşünülmektedir, ancak nicel veri sağlayan birkaç rapor vardır18.
Yukarıda gösterilen analitik ve contrived örneklem yöntemlerinin birleşimi, taşıma medyasında C. jejuni'nin canlılık ve hayatta kalma süresi tahminlerini elde etmek için tekrar kullanılmıştır. Bir bakteriyel stok suyu dışkı matris 1024 kat örnek seyreltme on iki kat hazırlamak için kullanılmıştır. İlk et suyu analitik sayımlar tarafından 4.8 x 107 CFU/mL konsantrasyonuna sahip bulundu. 0. günde yapılan plakalarda C. jejuni tespit edildi (2 gün sonra) 1.5 x 106 CFU/mL'ye eşdeğer 32 kat seyreltme ile plaka üzerinde çizgili plaka üzerinde. Ancak, Cary Blair dışkı örneğinin 24 saat soğutulmasından sonra yapılan plakalarda, sadece 2 kat seyreltme (2,4 x 107 CFU/mL'ye eşdeğer) görünür koloniler büyüdü. Çalışma durdurulduğunda 96 saate kadar başka canlılık kaybı görülmedi. Bu canlılık kaybı 16 kat (%94) eşittir az 24 saat içinde culturable organizmaların kaybı ve daha az 107 CFU / mL C. jejuni ile Cary Blair orta soğutma bile dışkı kültür tarafından cevapsız olabilir gösterir.
Kültür sonuçlarının aksine, ÇED ilk zaman noktasında ve 4 günlük test süresi boyunca 256 kat seyreltme de C. jejuni varlığını tespit etti. Çivili dışkı örnekleri kullanılarak bu ÇED için C. jejuni algılama eşiği 8.4 x 104 CFU/mL'dir. Bu eşik dışkı kültürünün altındadır ve C. jejunidaha hassas ve istikrarlı tespiti sağlar.
Kültürün Campylobacter spp.'yi gerçek bir klinik ortamda tespit etme yeteneğini test etmek için, 1.552 klinik dışkı örneği 6 işlemle karakterize edildi: dışkı kültürü, Campylobacter spp., ve 4 moleküler yöntem için yeni bir immünoassay. Tüm numuneler prospektif olarak toplandı ve başlangıçta Amerika Birleşik Devletleri'ndeki 3 laboratuvarda konvansiyonel kültüre göre sınıflandırıldı ve daha sonra ÇED tarafından çapraz kontrol edildi. Herhangi bir kültür-pozitif veya ÇED / kültür-discrepant örnekleri daha sonra moleküler yöntemlerle taranmış12. Örneklere kültür dışı 5 yöntemin sonuçlarına göre doğru-pozitif veya doğru-negatif durum atandı. Kültür dışı 5 yöntem, 48 pozitif ve ayrık numunenin tümü üzerinde tam bir anlaşma gösterirken, kültür 14'ünü (%28) yanlış tanımlamıştır. Kültür tarafından yanlış tanımlanan örnekler arasında 13 yanlış negatif ve 1 yanlış pozitif örnek yer al›rıldı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60457/60457fig1a.jpg"> Şekil 1: Analitik ve çivili dışkı örneklerinin eşzamanlı hazırlanması için şema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60457/60457fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60457/60457fig2a.jpg"> Şekil 2: Saf ve dışkı kültürlerinden C. jejuni kolonilerinin belirlenmesi. (A) 72 saat kuluçka dan sonra saf bakteri kültüründen C. jejuni kolonileri fotoğrafı. (B) Saf bakteri kültüründen C. jejuni gram leke, yağ daldırma 400x büyütme. (C) Fotoğraf C. jejuni-pozitif sivri dışkı kültürü sonra 48 h kuluçka. (D) Kutu içinde genişlemiş alan (C), 10x büyütme. Beyaz oklar pin noktası boyutu gram-negatif C. jejuni kolonileri gösterir. Siyah ok ucu biraz daha büyük bir koloni gösterir, gram-pozitif, ve C. jejunideğil . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60457/60457fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Kültür</td>
			<td>OD600 @ T0</td>
			<td>OD600 @ T Final1</td>
			<td>Son CFU/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. jejuni</td>
			<td>0.146</td>
			<td>0.321</td>
			<td>1,28 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. coli</td>
			<td>0.245</td>
			<td>0.508</td>
			<td>4,50 x 108
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: C. jejuni ve C. coli stoklarının tipik büyüme ve CFU/mL'si. 1C. jejuni kültürü kuluçka 48 saat sonra durduruldu. C. coli kültürü 54 saat kuluçkadan sonra durduruldu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Çivili dışkı numunesi için seyreltme tüpü</td>
			<td>Campylobactersayısı -koloniler gibi</td>
			<td>Gram-negatif kolonisayısı1</td>
			<td>Kültür olumlu mu?</td>
			<td>Çivili numunenin hesaplanan CFU/mL'si</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="10">
C. jejuni (1,28 x 108 CFU/mL hisse senedi)</td>
			<td>(2 kat) bir</td>
			<td>Yoğun</td>
			<td>nd2
</td>
			<td>Evet</td>
			<td>6,40 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4 kat) b</td>
			<td>20+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Evet</td>
			<td>3,20 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(8 kat) c</td>
			<td rowspan="3">4-10</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Evet</td>
			<td>1,60 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(16 kat) d</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Evet</td>
			<td>8,00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(32 kat) e</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Evet</td>
			<td>4,00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(64 kat) f</td>
			<td rowspan="4">1-3</td>
			<td>2'nin 1'i</td>
			<td>Evet</td>
			<td>2,00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(128 kat) g</td>
			<td>3'te 2</td>
			<td>Evet</td>
			<td>1,00 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>
3(256 kat) h
</td>
			<td>2'nin 1'i</td>
			<td>Evet</td>
			<td>5,00 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(512 kat) i</td>
			<td>0 / 1</td>
			<td>№</td>
			<td>2,50 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(1024 kat) j</td>
			<td>0</td>
			<td>Nd</td>
			<td>№</td>
			<td>Nfp</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="10">
C. coli (4,50 x 108 CFU/mL stok)</td>
			<td>(2 kat) bir</td>
			<td rowspan="2">Yoğun</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Evet</td>
			<td>2,25 x 108
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4 kat) b</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Evet</td>
			<td>1,13 x 108
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(8 kat) c</td>
			<td>50+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Evet</td>
			<td>5,63 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(16 kat) d</td>
			<td>30+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Evet</td>
			<td>2,81 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(32 kat) e</td>
			<td>10+</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Evet</td>
			<td>1,41 x 107
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(64 kat) f</td>
			<td rowspan="2">3-8</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Evet</td>
			<td>7,03 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(128 kat) g</td>
			<td>Nd</td>
			<td>Evet</td>
			<td>3,52 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>
3(256 kat) h
</td>
			<td rowspan="2">1-3</td>
			<td>3'te 1</td>
			<td>Evet</td>
			<td>1,76 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(512 kat) i</td>
			<td>0 / 1</td>
			<td>№</td>
			<td>8,79 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(1024 kat) j</td>
			<td>0</td>
			<td>Nd</td>
			<td>№</td>
			<td>Nfp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Çivili dışkı örneklerinin plakaları üzerindeki tipik koloni sayıları. Campylobacterarasında 1 Gram negatif koloniler -koloniler gibi, 2nd = belirlenmemiş, kalın tipte 3veri son pozitif seyreltme gösterir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tür</td>
			<td>Gen hedefi</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. jejuni</td>
			<td>hipO</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. coli</td>
			<td>cadF</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. upsaliensis</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. lari</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. helveticus</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. fetüs</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. hyointestinalis</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. concisus</td>
			<td>cpn60</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Genler bireysel Campylobacter türlerinin saptanması için yararlıdır qPCR.

Watch this Scientific Journal Video about Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens at JoVE.com

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Campylobacter için dışkı kültürü kesin olmasa da, hala kimlik için altın standart olarak kabul edilir. C. jejuni'nin insan dışkısındaki nakil medyasında tespit ve sağkalım sınırını belirleme yöntemleri tanımlanmış ve daha doğru bir şekilde yeni bir immünoassay ile karşılaştırılmaktadır.

İnsan Dışkı Örneklerinde Campylobacter Jejuni'nin Ulaşım Medyasında Tespit ve Sağkalım Sınırını Belirlemek Için Kültür Yöntemleri

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Campylobacter kültürünün zorluğu, hastalık üretmek için ne kadar az bakteriye ihtiyaç duyulduğu gibi temel çalışmaları engellemiştir. Burada kullanılan bu birleştirilmiş analitik ve contrived örnekleri bu sorunu giderebilir. Bu teknik, klinik ilgili hasta semptomlarının pozitif dışkı kültürü sonucu ve ilk kez gerçek sayıda bakteri ile ilişkili olmasını sağlar.Kaç bakteri hastalık ile ilişkili öğrenme tanı, algılama için önemli bir hedef ve suşları veya Campylobacter türleri arasında virülans karşılaştırmak için sağlam bir yöntem sağlayacaktır. Campylobacter kültür basit ama kantitatif canlılık korumak için hızlı ve organize hazırlık gerektirir. Bir tabakta rakip dışkı florası arasında Campylobacter kolonileri tanımlamak için önemli bir yargı da gereklidir.C.jejuni veya C.coli kültürüne başlamadan önce eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü takın ve dezenfekte edilmiş laminar akış güvenlik başlığının içine tek kullanımlık koruyucu bir levha yerleştirin. Steril tekniği kullanarak bir Campylobacter özel agar plaka üzerine her sulu veya çözülmüş bakteri stok çizgi ve bir mikroaerobik atmosfer gazı üreten poşet içeren bir anaerobik kavanozda 48 saat boyunca 37 derece santigrat plaka yerleştirin. 24 saat sonra, gevşek BHI suyu bir şişe kapağı ve 37 derece Santigrat bir gecede kuluçka için bir mikroaerobik ortam üretecek bir poşet ile yeni bir anaerobik kavanoziçine şişe yerleştirin.Ertesi sabah campylobacter kültürünün başlangıç plaka kazımak için önceden azaltılmış suyu ve aşılama döngü üç mililitre kullanın. Bulamacı steril bir boruya aktarın ve kalan 97 mililitrelik azaltılmış suyu üç mililitre kazınmış bulamaç ile inoküle edin. Gaz poşeti ile kavanoza et suyu yerleştirin ve kültür 4daha fazla 600 nanometre bir optik yoğunluğu ulaşana kadar, 48 ila 72 saat boyunca sallayarak bir kuluçka üzerinde dakikada 37 derece santigrat ve 115 devrimler kültür kuluçka.Bu saf stok kültüründe bakteri sayısını belirlemek için seyreltme 900 mikrolitre 100 mikrolitre suyu sekiz 10 kat seyreltme serisi gerçekleştirin. Steril kaplama boncuklar kullanarak, 10 kez 10 negatif beşinci 10 için negatif yedinci seyreltme ler için yinelenen önceden azaltılmış Campylobacter özel plakalar ve seyreltme konsantrasyonu ile etiket plakaları plakaları ikinci bir anaerobik kavanoza yerleştirmeden önce bir gaz üreten poşet ile 48 ila 72 saat için 37 derece santigrat. Büyüme döneminin sonunda saymak için 30 ila 300 kolonisi olan plakaları seçin.Saydıktan sonra formüle göre stok suyu kültürünün mililitre başına koloni oluşturan birimleri belirlemek için sayıları kullanın. Bu çivili dışkı havuzu kullanarak tüm adımları destekleyen gibi analitik koloni sayıları doğru olması önemlidir. Gösterildiği gibi sayma için kaplama hemen sonra, et suyu ve Campylobacter negatif dışkı havuzu eşit hacimlerde karıştırın ve negatif dışkı havuzunda dokuz sonraki iki kat seyreltme yapmak, olmayan Campylobacter kolonileri belirlemeye yardımcı olmak için dışkı havuzuna hiçbir Campylobacter içeren et suyu içeren bir kontrol plakası ekleyerek.Her Campylobacter dışkı seyreltme 10 mikrolitre çoğaltılabilir önceden azaltılmış Campylobacter özel agar plakaları ve yaklaşık 48 saat boyunca 37 santigrat derece bir gaz üreten poşet ile anaerobik kavanozda plakalar inkübün. Kuluçka sonunda, saf Campylobacter kültürlerinden gelenkolonilere benzeyen kolonilerin çizgili plakalarını görsel olarak inceleyin. Koloniler aslında Campylobacter gram boyama için koloniler gibi birden fazla Campylobacter seçin ve gram-negatif kavisli, spiral veya puro şeklinde küçük bakterileri tanımlamak için bir yağ daldırma lens kullanarak ışık mikroskobu ile ince çizgili bir alan görselleştirmek onaylamak için.Campylobacter eklenmeden negatif bir kontrol plakası diğer dışkı florasını belirlemeye yardımcı olmak için önemlidir. Görsel bir Campylobacter benzeri gram-negatif koloni içeren son seyreltme kültür algılama sınırı düşünün. Ve formülü kullanarak, yapılan klinik dışkı örneğindeki pozitif seyreltmenin mililitrebaşına koloni oluşturan birimlerini hesaplayın.Taşıma orta bir mililitre Campylobacter et suyu kültürünün bir mililitre negatif dışkı havuzu ile karıştırılmasında depolanan Campylobacter canlılığını belirlemek ve negatif dışkı havuzunda 10 adet iki katlı seri seyreltmeler hazırlamak. Cary-Blair ortamında her seyreltme bir ila dört oranında seyreltin ve 96 saat boyunca 2-8 santigrat derece kapak tüpleri cary-Blair orta ve negatif kontrol saklayın. Zaman sıfır başlayarak ve bundan sonra her 24 saatte bir Campylobacter seçici agar plakaları üzerine her seyreltme 10 mikrolitre aliquots çizgi ve 48 saat boyunca 37 derece santigrat plakaları kuluçka.Hasta örneklerinden doğru bakteri sayılarını oluşturmak için bağımsız bir yöntem bulunmadığından, tek bir saf bakteri stoku ile iki eşzamanlı ölçüm yapılabilir. Bir test, campylobacter kolonilerinin fekal matriksteki stok bakterilerin seri seyreltmelerinden ve klinik numunelerin simüle edilmesinden elde edilen görsel algılamaiçin kullanılır. Diğer test analitik olarak kullanılır, aynı bakteri stok kültüründe bulunan mililitre başına koloni oluşturan birimleri ölçmek için kullanılan spiking için kullanılır.Başarı için önemli bir parametre, çivili dışkı kültürünün bu temsili plaka gösterildiği gibi, rakip dışkı florası arasında kesin büyüklüktekoloniler belirlenmesidir. Burada, yedi bağımsız deneyden elde edilen tipik veriler gözlemlenebilir. Sadece dışkı kültürleri içinde Campylobacter benzer koloniler tespit yeterli değildir.Tüm koloniler gram lekesi veya daha gelişmiş yöntemlerle doğrulanmalıdır. Biz c.upsaliensis veya C.lari gibi nadir türleri tespit etmek için kültürden daha doğru bir enzim immünoassay kullanın, hangi agar içeren standart antibiyotik kötü büyümek. Bu teknik Campylobacter non-semptomatik taşıma ve yüksek bakteriyel yükler Campylobacter enfeksiyonun ciddi sonuçları için daha yüksek risk altında bir hasta koymak gibi şeyler çalışmak için gerekli bir temel oluşturur.Genellikle bulaşıcı ve tehlikeli olabilecek bakterilerle çalışırken ve sağlıklı bağışçılardan toplandığında bile bilinmeyen patojenler içerebilen negatif dışkı havuzu ile her zaman PPE takın.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri<em&gt; Burkholderia</em&gt; Türler

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...