Name: detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2019-10-18T15:00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

ونود ان نشكر كيم أورث ومارزا دي سوزا سانتوس علي المشورة المتعلقة بالمراسم وأماندا اريوت للحصول علي الدعم الفني. وكان هذا العمل مدعوما جزئيا من قبل سيسيل h. وأيدا الأخضر كرسي في علوم علم الاحياء النظم التي عقدتها ك

<ol>
	<li>Abraham, S. N., Miao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+immune+responses+to+urinary+tract+infections.">The nature of immune responses to urinary tract infections.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).</li><li>Wolfe, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+uncultivated+bacteria+in+the+adult+female+bladder.">Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).</li><li>Grist, M., Chakraborty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mucin+layer+in+the+urinary+bladder.">Identification of a mucin layer in the urinary bladder.</a> Urology. 44 (1), 26-33 (1994).</li><li>Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uroplakins+in+urothelial+biology,+function,+and+disease.">Uroplakins in urothelial biology, function, and disease.</a> Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).</li><li>Ingersoll, M. A., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+infection+to+immunotherapy:+host+immune+responses+to+bacteria+at+the+bladder+mucosa.">From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa.</a> Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).</li><li>Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infections:+epidemiology,+mechanisms+of+infection+and+treatment+options.">Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).</li><li>Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+Host+Cells+and+Tissues+by+Uropathogenic+Bacteria.">Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria.</a> Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).</li><li>Horsley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+subverts+and+invades+the+host+urothelium+in+patients+with+chronic+urinary+tract+infection.">Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection.</a> PLoS One. 8 (12), (2013).</li><li>Rosen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+an+intracellular+bacterial+community+pathway+in+Klebsiella+pneumoniae+urinary+tract+infection+and+the+effects+of+FimK+on+type+1+pilus+expression.">Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression.</a> Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).</li><li>Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+bacterial+communities+in+human+urinary+tract+infection.">Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection.</a> PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).</li><li>Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+efficacy+of+fulguration+of+trigonitis+for+recurrent+urinary+tract+infections+in+women.">Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women.</a> Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).</li><li>De Nisco, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Detection+of+Tissue-Resident+Bacteria+and+Chronic+Inflammation+in+the+Bladder+Wall+of+Postmenopausal+Women+with+Recurrent+Urinary+Tract+Infection.">Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection.</a> Journal of Molecular Biology. , (2019).</li><li>Amann, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+16S+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+with+flow+cytometry+for+analyzing+mixed+microbial+populations.">Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).</li><li>Vaishnava, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+lectin+RegIIIgamma+promotes+the+spatial+segregation+of+microbiota+and+host+in+the+intestine.">The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine.</a> Science. 334 (6053), 255-258 (2011).</li><li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers:+new+features+2016.">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).</li><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications.">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li><li>Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+uropathogenic+Escherichia+coli+persistence+and+eradication+from+the+urinary+tract.">Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).</li><li>Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+yeast+by+fluorescence+in+situ+hybridisation+from+broth+and+blood+cultures.">Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures.</a> Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning.">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+black+B+reduces+autofluorescence+in+murine+renal+tissue.">Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).</li><li>Ludwig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARB:+a+software+environment+for+sequence+data.">ARB: a software environment for sequence data.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).</li><li>Jaziri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhylOPDb:+a+16S+rRNA+oligonucleotide+probe+database+for+prokaryotic+identification.">PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification.</a> Database (Oxford). , (2014).</li></ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

هنا ، ونحن وصف بروتوكول للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالانسجه في الخزعات المثانة البشرية من قبل الجيش النيبالي الريبي 16S FlSH. ويمكن تكييف هذا البروتوكول بسهوله لأخذ الخزعات الماخوذه من الانسجه الأخرى ، مثل الجهاز الهضمي أو الجلد ، ويمكن ان يمتد إلى الانسجه التي تحصد من مجموعه متنوعة من الكائنات الحية النموذجية الثدييات. ويمكن أيضا تكييف البروتوكول الموصوف هنا لاستخدام تثبيت متعدد (علي سبيل المثال ، formalin ، الايثانول ، ميثاكارن) وتقنيات اعداد الانسجه (مثل البارافين أو الراتنج جزءا لا يتجزا ، والانسجه الباكية). المزدوج المسمي العالمي 16S rRNA المسبار يسمح للكشف عن غير متحيزة من جميع الأنواع البكتيرية الموجودة داخل الانسجه ، ويمكن ان توفر نظره قيمه في كيفيه مسببات الامراض والميكروبات تتفاعل مكانيا مع الأسطح المخاطية في المرض وصحية الدول. استخدام الموارد مثل probeBase ، PhylOPDb أو أداه PROBE_DESIGN لحزمه البرمجيات ارب لاختيار أو تصميم الأنواع أو أجناس الخاصة 16S أو 23S التحقيقات rRNA ، ويمكن تكييف هذا البروتوكول للكشف عن الأنواع البكتيرية محدده أو أجناس داخل الانسجه15،21،22. وثمة اتجاه هام في المستقبل لهذه الطريقة هو تعدد الإرسال باستخدام الأنواع-أو التحقيقات الخاصة بالأجناس المسمية بمختلف ، فلوبهورس منفصلة لتقييم التنوع الميكروبي داخل الغشاء المخاطي للمثانة.
القيد الأساسي لهذه الطريقة للاستخدام علي العينات البشرية هو توافر الانسجه البيولوجية. ان موافقه مجلس المراجعة المؤسسية وموافقه المريض المستنيرة مطلوبه للحصول علي الخزعات والتعاون المباشر مع الطبيب الذي يؤدي الاجراء ضروري لجمع العينات المثلي والوصول إلى البيانات الوصفية للمريض. الاجراء CEFT نفسه يدمر ظهاره المثانة لذلك كنا قادرين علي تبرير خزعة من هذه المناطق قبل الاجراء. مطلوب لهذا البروتوكول غطاء الدخان أو خزانه السلامة الاحيائيه المجهزة بشكل مناسب بسبب استخدام الاكزينات السامة في خطوه المغادرين والحاجة إلى الحفاظ علي بيئة معقمه طوال الاجراء. المجهر الفلورسنت ، ويفضل ان يكون التنسيق ، مع 63x أو 100x الهدف ومجموعات مرشح المناسبة لتصور Hoechst ، اليكسا-555 ، و اليكسا-488 مطلوب لهذا البروتوكول. وقد تم تصوير النتائج التمثيلية المبينة في الشكل 1 باستخدام المجهر البؤري الضوئي بالليزر. وينبغي ان المجاهر المسح بالليزر مماثله إنتاج صور قابله للمقارنة. هذا البروتوكول محدود بقدرته علي الكشف عن البكتيريا المرتبطة بالانسجه فقط وليس ، علي سبيل المثال ، الفطريات. مجسات محدده الفطرية 18S أو 28S rRNA يجب ان تستخدم لتحديد مسببات الامراض الفطرية داخل الانسجه18.
وتشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول الحفاظ علي بيئة معقمه طوال العملية وضمان ان الانسجه لا تجف بين التهجين وتلطيخ الخطوات. إذا كان النسيج يجف اثناء العملية ، قد تكون الاشاره مبلله أو قد يسقط النسيج من الشريحة اثناء خطوه الغسيل. كما انه من المهم دائما استخدام قسمين تسلسليين لهذا البروتوكول-أحدهما لمسبار rRNA 16S والاخر لمسبار التدافع. بدون هذه السيطرة ، قد يكون من الصعب جدا التمييز بين الإيجابيات الزائفة والبيانات التي تم الحصول عليها قد لا تكون مفيده أو غنيه بالمعلومات. إذا تم تكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع مسبار آخر غير المسبار العالمي لل rRNA 16S ، يجب توخي الحذر لاختيار درجه حرارة التهجين المناسبة ، تقريبا 5 درجه مئوية اقل من ذوبان درجه الحرارة المتوقعة من المسبار. للحفاظ علي كثافة الاشاره ، يجب ان لا يتعرض النسيج للضوء لفترات طويلة من الزمن بعد ان تمت أضافه المسبار ويجب الا يتعرض لفرط العرض اثناء المجهر. أخيرا, اثناء مجهريه الضبط نفسه للقناه يماثل إلى ال [فلوفيبور] مترافق إلى السمكة تحقيق ينبغي كنت أبقيت متسقة بين التجريبية ([16 س] [ررنا] تحقيق) وتحكم (يتبارى تحقيق) منزلقات. يعتبر تصور العلاقة المكانية للبكتيريا داخل الأسطح المخاطية للانسجه المستمدة من المريض أمرا بالغ الاهميه لفهم وبناء فرضيات ذات صله سريريا حول تفاعلات المضيف-الممرض الكامنة وراء الامراض المعدية.

المسالك البولية ، التي تتكون من مجري البول والمثانة والحالب والكلي يتعرض باستمرار للبكتيريا التي تشكل ميكروبيوم البولية ، فضلا عن الغازية المسببة للامراض البولية ، مثل الامراض البولية الجرثومية e. القولونية (upec) ، من الجهاز الهضمي 1،2. طبقه من المخاط الرطب تتكون من الغليكوسامينوجليكانز ولوحه غير نفاذه من البروتينات البولية الغليكولاتيد التي تم التعبير عنها علي سطح الخلايا السطحية تشكل حاجزا يحمي بشكل روتيني ظهاره المثانة من الغزو من قبل المنضمين بكتيريا3،4. اثناء عدوي المسالك البولية (UTI) ، يتم إزعاج هذه الحواجز أو تدميرها ، مما يسهل التعلق بظهاره المثانة وغزوها من قبل البكتيريا المسببة للامراض البولية5،6. وقد كشف العمل في نماذج murine ان العديد من البكتيريا المسببة للامراض البولية بما في ذلك upec ، klebsiella الرئوية، والمكورات المعوية البرازيه يمكن ان تشكل المجتمعات الخلوية المتماثلة (الحاويات الوسيطة) داخل سيتوتوبلاسما من الخلايا السطحية الخزانات داخل الخلية الهادئة (qirs) ضمن الخلايا الظهاريه الانتقالية7،8،9. علي الرغم من ان UPEC قد تم التعرف عليها داخل سفك الخلايا الظهاريه من المرضي UTI الإنسان ، والتفاعل من مسببات الامراض البولية مع الغشاء المخاطي المثانة في البشر لم يسبق تصوره10.
قمنا بتكييف تقنيه مشتركه ، مضانه في التهجين الموضعي (FISH) ، للكشف عن البكتيريا داخل الغشاء المخاطي لخزعات المثانة التي تم الحصول عليها من المرضي بعد سن إلياس الذين خضعوا لتنظير المثانة بالكهرباء من التهاب الأوتار الثلاثية (CEFT) للمتقدمين أداره المضادات الحيوية الحرارية المتكررة UTI11. باستخدام مسبار عالمي ل rRNA 16S, كنا قادرين علي الكشف بموضوعيه الأنواع البكتيرية المرتبطة بالغشاء المخاطي المثانة من المرضي UTI المتكررة وتحديد موقفهم داخل جدار المثانة12. وقد تم تصميم المسبار النيوكليوتيد العالمي 16S rRNA لاستهداف منطقه المحمية من البكتيريا 16S rRNA13، الذي يتوافق مع المواقع 388-355 من القولونية rrna 16S. وقد تم التحقق من تسلسل rrna 16s والتدافع التحقيق سابقا ونشرت للاستخدام في الجهاز الهضمي الماوس14,15. ويرد وصف لمتواليات وخصائص التحقيقات في الجدول 1. من الضروري استخدام قسمين متسلسلين في هذا البروتوكول ، أحدهما لمسبار rRNA 16S والاخر لمسبار التدافع ، ليكون قادرا علي التمييز بين الاشاره الصحيحة والخلفية كظهاره المثانة ، والكولاجين والايلاستين المعرض التلقائي16 . في هذا البروتوكول ، تم تصميم rRNA 16S والتدافع التحقيقات مع الفلورسنت اليكسا فلور 488 التسميات علي حد سواء في 3 ' و 5 ' تيرميني عن طريق N-هيدروكسيسكالنجيد (نهس) استر الروابط لزيادة اشاره الفلورسنت.
علي الرغم من انه تم تطوير هذا البروتوكول لاستخدامه علي أقسام خزعة المثانة البشرية ، فانه يمكن تكييفه بسهوله للاستخدام علي الأقسام المضمنة في البارافين من اي نسيج يعتقد ان البكتيريا تقيم فيه. علي عكس التجارب مناعي التي تستهدف المستضدات محدده (علي سبيل المثال ، lipopolysساكاريد) علي سطح البكتيريا ، وهذا الأسلوب لا يتطلب اي معرفه مسبقه من المستضدات التي أعربت عنها البكتيريا المرتبطة بالانسجه10،17 . استخدام المسبار العالمي لل rRNA 16S يسمح الكشف غير متحيزة لجميع الأنواع البكتيرية داخل العينة ولكن لا يسمح تحديد هويتهم. لتحديد التعرف علي البكتيريا المكتشفة ، يجب استخدام الأنواع أو الكائنات الخاصة بالجنس أو النوع 16S أو 23S rRNA. هذا البروتوكول لن يكشف أيضا عن مسببات الامراض الفطرية ، مثل المبيضات الbicans، المرتبطة بالانسجه المضيفة. للكشف عن مسببات الامراض الفطرية ، 28S أو 18S rRNA تحقيقات يجب ان تستخدم18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34055</td>
			<td>Staining Actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>W32464</td>
			<td>Staining Mucin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-07</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M900-12W</td>
			<td>Deparaffinization/washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-224</td>
			<td>Rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>TE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H21492</td>
			<td>Staining Nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic marker</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Hydrophobic barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersol 518 F</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-624-66A</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TJ274997</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>Hybridization buffer/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75486-756</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>TE/Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-754-29</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization

يمكن ان يوفر تصور تفاعل البكتيريا مع الأسطح المخاطية المضيفة والانسجه رؤية قيمه في أليات التسبب في المرض. في حين ان تصور مسببات الامراض البكتيرية في النماذج الحيوانية للعدوى يمكن ان يعتمد علي سلالات بكتيرية مصممه للتعبير عن البروتينات الفلورية مثل GFP ، فان تصور البكتيريا داخل الغشاء المخاطي للخزعات أو الانسجه التي يتم الحصول عليها من المرضي البشريين يتطلب طريقه غير متحيزة. هنا ، نقوم بوصف طريقه فعاله للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالانسجه في أقسام الخزعة البشرية. يستخدم هذا الأسلوب الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH) مع فلوريسسينتلي المسمي المسبار العالمي اوليغكليوكليوتيد ل 16S rRNA لتسميه البكتيريا المرتبطة بالانسجه داخل أقسام خزعة المثانة المكتسبة من المرضي الذين يعانون من المتكررة عدوي المسالك البولية. من خلال استخدام المسبار العالمي لل rrna 16s ، يمكن الكشف عن البكتيريا دون معرفه مسبقه من الأنواع ، أجناس ، أو الخصائص البيوكيميائية ، مثل عديد السكاريد (lps) ، التي ستكون مطلوبه للكشف عن طريق التجارب المناعية. نحن وصف بروتوكول كامل ل 16S rRNA الأسماك من تثبيت الخزعة إلى التصوير عن طريق المجهر البؤري. ويمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام في اي نوع من الانسجه تقريبا ويمثل أداه قويه لتصور غير متحيز من التفاعلات البكتيرية المضيفة ذات الصلة سريريا في انسجه المريض. وعلاوة علي ذلك ، باستخدام الأنواع أو المجسات الخاصة بالأجناس ، يمكن تكييف هذا البروتوكول للكشف عن مسببات الامراض البكتيرية المحددة داخل انسجه المريض.

تم تحسين البروتوكول للكشف غير المتحيز عن البكتيريا المرتبطة بالغشاء المخاطي للمثانة في أقسام خزعة المثانة المضمنة في البارافين. ويصور الشكل 1 الرسوم البيانية المنسقة التمثيلية من تجربه تستخدم هذا البروتوكول في أجزاء من خزعة المثانة التي يتم الحصول عليها من النساء المصابات بعدوي المسالك البولية المتكررة. وقد تم تهجين القسمين التسلسليين اما مع rRNA العالمية 16S (ألواح العلوية) أو التدافع (لوحات اقل) مجسات. أخذت صور من نفس المنطقة من النسيج والبكتيريا (الأخضر) واضحة بوضوح في الانسجه التهجين مع التحقيقات rRNA 16S وليس مع مسبار التدافع. ويمثل الشكل 2 نتيجة ايجابيه زائفه. يتم الكشف عن اشاره المقابلة الكولاجين الفلورسنت أو والايلاستين في القناات 405 و 488 في كل من rRNA 16S والتدافع السبر التهجين المقاطع خزعة تسليط الضوء علي اهميه دائما باستخدام التدافع مسبار السيطرة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>التحقيق</td>
			<td>تسلسل</td>
			<td>Tm</td>
			<td>فلوروفوري</td>
			<td>الصله</td>
		</tr>
<tr>
<td>العالمي 16S rRNA</td>
			<td>5 '-GCTGCCTCCC GTAGGAGT-3 '</td>
			<td>54.9</td>
			<td>اليكسا-488 (5 ' و 3 ')</td>
			<td>استر</td>
		</tr>
<tr>
<td>التدافع</td>
			<td>5 '-ACTCCTACGG GAGGCAGC-3 '</td>
			<td>Na</td>
			<td>اليكسا-488 (5 ' و 3 ')</td>
			<td>استر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: تسلسل المسبار السمكي وخصائصه. Tm يشير إلى ذوبان درجه الحرارة والدائرة الخاصة للصحة هو اختصار ل N-هيدروكسيسكالنجيد.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig1.jpg"> الشكل 1: الرسوم البيانية المنسقة التمثيلية للأسماك العالمية لل rRNA والتدافع في خزعة المثانة البشرية. يتم تسميه actin و Mucin باللون الأحمر ، وتسمي النوى الخلوية باللون الأزرق ، والبكتيريا باللون الأخضر. يتم الكشف عن البكتيريا المرتبطة بالانسجه فقط مع المسبار 16SrRNA وليس التدافع. الصور الملتقطة بالتكبير 63x. شريط مقياس = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig2.jpg"> الشكل 2: الرسوم البيانية المحورية التمثيلية للفلورية الخضراء الايجابيه الزائفة في خزعة المثانة البشرية. يتم تسميه actin و الميوسين باللون الأحمر ، وتسمي النوى الخلوية باللون الأزرق ، والبكتيريا ومكونات الفلورسنت التلقائي لمصفوفة خارج الخلية (علي سبيل المثال ، الكولاجين والايلاستين) هي الخضراء. ويلاحظ الفلورية الخضراء مع كل من rRNA 16S والتدافع تحقيقات تشير إلى نتيجة ايجابيه كاذبه. تؤخذ الصور في التكبير 63x. شريط مقياس = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

هذا البروتوكول هو للكشف عن غير منحازة من البكتيريا المرتبطة الانسجه في الخزعات المريض بواسطة rRNA 16S في التهجين الموضعي والمجهر البؤري.

الكشف عن البكتيريا المقيمة في الانسجه في المثانة الخزعات من قبل rRNA الفلورية 16S في الموقع التهجين

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

هنا نقدم بروتوكول قوي للكشف عن البكتيريا داخل أنسجة المثانة الخزعة، والتي لها تطبيقات واسعة على العديد من أنواع الأنسجة حيث يشتبه في وجود البكتيريا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها غير متحيزة. وهو يسمح للباحث للكشف عن البكتيريا داخل الأنسجة دون معرفة مسبقة من الأنواع البكتيرية الموجودة.قد تساعد هذه التقنية في تحديد ما إذا كانت البكتيريا قد غزت جدران المثانة للنساء المصابات بعدوى المسالك البولية المتكررة وإعلام الخيارات العلاجية مثل اختيار المضادات الحيوية المخترقة للأنسجة. في حين أن مصممة للأنسجة المثانة، يمكن تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع على الأنسجة الأخرى مع السكان البكتيرية المقيم مع الحد الأدنى من التحسين. الأفراد الذين هم جديدة لهذه التقنية قد النضال مع وضع coverlip والتصوير.التركيز على تحسين وضع الأغطية للحد من الفقاعات وممارسة التصوير على عينات غير الثمينة. المساعدة في إثبات هذا الإجراء سيكون جاشكاران غادفي، طالب دراسات عليا في مختبري. لبدء هذا الإجراء، تنظيف غطاء دخن فارغة أو مجهزة بشكل مناسب مجلس الوزراء السلامة البيولوجية مع 70٪ الإيثانول.إعداد كافة المخازن المؤقتة الضرورية والكواشف كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، تنظيف خمس جرار كوبلين مع 70٪ الإيثانول والسماح للجران الجافة. عندما تكون الجرار جافة، قم بتسميةها كما هو موضح هنا وملءها بـ 100 ملليلتر من الحل المناسب.في غطاء الدخان، ضع منزلتين لكل خزعة في رف شريحة عمودي. ضع رف الشريحة العمودي في جرة Xylenes 1 كوبلين لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة رف الشريحة من الجرة ولطخة الجزء السفلي على منشفة ورقية لإزالة الزيلين الزائد.ضع الحامل في جرة Xylenes 2 لمدة 10 دقائق. ثم إعادة هيدرات أقسام الأنسجة دي paraffinized في يغسل الإيثانول المتعاقبة لمدة 10 دقائق لكل من. عندما تكون الغسلات كاملة، لطخة الجزء السفلي من رف الشريحة على المناشف الورقية لإزالة الإيثانول الزائد ووضع الرف في جرة كوبلين التي تحتوي على 100 ملليلتر من تصفية معقمة، والمياه المقطرة مزدوجة لمدة 10 دقيقة.خلال هذا الغسل، تمييع المسابير إلى 10 نانوموللار في العازلة التهجين لإنشاء حل تلطيخ، مع التأكد من إعداد 150 ميكرولترات من حل تلطيخ لكل شريحة. إعداد غرفة الترطيب لكل مسبار عن طريق إضافة غارقة، تكوم مهمة حساسة مسح والمياه المعقمة إلى خزان من صندوق تلميح P1000. ضع خرطوشة حامل التلميح في الأعلى حيث ستجلس الشرائح.عند الانتهاء من الغسيل النهائي، قم بإزالة الشريحة من رف الشريحة ووضعها على منشفة ورقية جديدة، وجانب الأنسجة. استخدام مهمة حساسة مسح لتجفيف الشريحة، مع الحرص على الداب بلطف فقط بالقرب ولكن ليس على قسم الخزعة للفتيل بعيدا الماء. باستخدام قلم مُهدّم، قم برسم حد حول قسم الخزعة ووضع جانب نسيج الشريحة في غرفة الترطيب.بعد ذلك، ضع غرفة الترطيب في حاضنة تعيين إلى 50 درجة مئوية. ما بين 50 و 150 ميكرولترات من حل تلطيخ مباشرة على الجزء العلوي من الأنسجة بحيث المستطيل الذي أدلى به الحدود المائية حول الأنسجة يتم تعبئة وإغلاق مربع بلطف. احتضان بين عشية وضحاها في 50 درجة مئوية في الظلام.إذا كانت الحاضنة لديها نافذة، وتغطية ذلك بخرق الألومنيوم الطرافة لخلق بيئة مظلمة. في صباح اليوم التالي، قم بإزالة الشرائح من غرف الترطيب وإبعاد أي حل تهجين متبقي مع مسح مهمة حساسة. ثم ضع الجانبين في رف تلطيخ عمودي.ضع رف التلوين في جرة كوبلين ملفوفة رقائق الألومنيوم تحتوي على 100 ملليلتر من عازلة الغسيل قبل الدافئة لمدة 10 دقائق. كرر هذه الخطوة غسل مرتين أكثر مع عازلة غسل الطازجة في الجرار كوبلين جديدة. خلال هذه الخطوات غسل، وإعداد وصمة مضادة عن طريق تمييع محلول الأسهم من Hoechst 33342 في عازلة غسل، بنسبة واحد إلى 1000.إلى نفس الأنبوب، أضف أليكسا-555 جرثومة القمح agglutinin إلى تركيز نهائي من خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر واليكسا-555 فالويدين إلى تركيز نهائي من 33 نانوموللار. تخزين في الظلام حتى جاهزة للاستخدام. عندما يتم الغسل النهائي، وإزالة الشرائح من جرة كوبلين وفتيل بلطف بعيدا أي العازلة غسل الزائدة مع مسح مهمة حساسة.وضع الشرائح الأنسجة الجانب على منشفة ورقية وإضافة ما بين 50 و 150 ميكرولترات من وصمة مضادة مباشرة على رأس الأنسجة بحيث يتم تعبئة الحدود المائية، ولكن لا تفيض. غطي ما يصل إلى أربع شرائح مع أعلى صندوق التبريد واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، ضع الشرائح مرة أخرى في رف التلوين وغسلها مرتين أكثر في جرار كوبلين التي تحتوي على عازلة غسيل طازجة، مع كل غسل دائم 10 دقائق.ثم يجف جيدا الشرائح ووضعها الجانب الأنسجة حتى على منشفة ورقية تحت أعلى cryobox. الضغط على قطرة واحدة من تصاعد وسائل الإعلام مباشرة على رأس الأنسجة ووضع بلطف coverslip الحجم المناسب على القمة. اضغط بلطف على أي فقاعات والسماح للشرائح coverlip لعلاج بين عشية وضحاها في الظلام.في اليوم التالي، ختم حواف الأغطية إلى الشريحة مع معطف خفيف من طلاء الأظافر واضحة والسماح الجافة في الظلام لمدة 10 دقائق، قبل تخزينها في الظلام عند أربع درجات مئوية. عندما تكون جاهزة لتصوير الخزعات الملطخة ، قم بالتبديل على المجهر confocal والبرامج المرتبطة بالمجهر. ابدأ بشريحة إيجابية FISH والتبديل إلى وضع مرئي الكمبيوتر.حدد القنوات ل 405 و 488 و 555. تعيين الثقب باستخدام أطول قناة طول موجي، والتي في هذه الحالة هو 555. ثم ابحث عن المستوى البؤري الحالي للتصور للبكتيريا المسماة في قناة 488.دون تغيير المستوى البؤري، تعيين كسب، قوة الليزر، وعوض لكل قناة بحيث لا تكون الإشارة مشبعة والخلفية غير مصححة. الحصول على الصورة في جميع القنوات الثلاث. في هذه الدراسة، يتم الكشف عن البكتيريا المرتبطة الأنسجة في خزعات المثانة البشرية من قبل 16S rRNA FISH.وقد تم تحسين هذا البروتوكول للكشف غير متحيزة من البكتيريا المرتبطة الغشاء المخاطي للمثانة في أقسام خزعة المثانة البارافين جزءا لا يتجزأ. يظهر هنا هي ميكروجرافات تمثيلية من تجربة باستخدام هذا البروتوكول على أقسام من خزعات المثانة التي تم الحصول عليها من النساء المصابات بالتهابات المسالك البولية المتكررة. يتم تهجين قسمين متسلسلين إما مع RRNA 16S العالمي أو تحقيقات التدافع.صور ع مأخوذة من نفس المنطقة من الأنسجة والبكتيريا واضحة للعيان في الأنسجة المهجّنة مع تحقيقات 16S RRNA، ولكن ليست مع التحقيق التدافع. كما أن النتائج الإيجابية الكاذبة ممكنة أيضاً. في هذا ممثل إيجابية كاذبة، يتم الكشف عن إشارة المقابلة للكولاجين أو الإيلاستين ذات الفيورات في القنوات 405 و 488 في كل من 16S rRNA والتدافع مسبار أقسام خزعة هجين، وتسليط الضوء على أهمية استخدام دائما التحكم في التحقيق التدافع.لمنع تبييض الصور، تقليل تعرض الأنسجة للضوء بعد تطبيق المسابير. في حين أن هذه التقنية تسمح للكشف غير المتحيزة من البكتيريا في الأنسجة البشرية، فإنه لا يعطي معلومات محددة الأنواع. يمكن استخدام متعددة الأسماك مع مسابير محددة التصنيف لتحديد جنس أو الأنواع الموجودة.قبل أن يتم تطوير هذه التقنية ، لم يكن قد ثبت من قبل أن البكتيريا يمكن أن تغزو جدار المثانة من مرضى التهاب المسالك البولية البشرية المتكررة. ونحن نستخدم الآن جنس وأجناس محددة تحقيقات لتحديد الأنواع البكتيرية الموجودة. يجب استخدام Xylenes في غطاء الدخان بسبب سميتها.يجب الحرص على عدم النظر مباشرة في الليزر أثناء التصوير. يجب إيقاف تشغيل الليزر أثناء وضع الشريحة تحت الهدف.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

تحليل النسخ الجيني وحيدة الخلية التي كتبها نيون RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

طريقة بسيطة لDNA الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لسحق الكروموسومات

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

كفاءة نوكليك حمض استخراج و16S الريباسي جين تسلسل للبكتيريا الجماعة توصيف

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

المراقبة والكمي لالتيلومير وتسلسل المتكررة عن طريق الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) مع السلطة الوطنية الفلسطينية تحقيقات في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

بروتوكول المصحوبة بمرشدين لتوصيف الجراثيم البراز بتسلسل الرنا الريباسي-Amplicon 16S

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

توصيف ميكروبيومي التجزئة بالتسلسل Amplicon الرنا الريباسي 16S الجيل المقبل

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...