Name: detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2019-10-18T15:00:00
Duration: 9 min 50 s
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我们要感谢金·奥尔特和马塞拉·德苏扎·桑托斯提供礼宾建议，感谢阿曼达·阿鲁特提供技术支持。这项工作得到了K.P.举行的系统生物学科学塞西尔H.和Ida绿色讲座的部分支持。

研究协议得到UT达拉斯分校和UT西南医学中心机构生物安全和化学品安全委员会的批准并遵循了该指南。本议定书中人体受试者活检的使用得到了UT达拉斯分校和UT西南医学中心机构审查委员会的批准和遵循。所有参与活检收集和处理的个人都拥有当前的人体主体保护 （HSP） 和 HIPPA 培训。
1. 固定和石蜡嵌入的组织准备
注：活检是从接受膀胱镜检查的妇女身上进行的，她们患有三联体炎，以便对复发性尿路感染进行高级管理。rUTI 定义为 12 个月内的 3 个 UTI。根据 UTSW IRB 协议 STU 082010-016 获得知情的患者同意后，在手术室进行活检采集，而患者处于麻醉状态。所有样品在实验前都进行了编码和去识别。
<ol><li>通过灵活的膀胱镜从膀胱三聚氰胺中获取冷杯 （±1 mm3） 活检，并立即放入含有 1.5 mL 4% v/v 甲醛 （PFA） 的无菌 2 mL 冷冻液中，在 1x 无菌磷酸盐缓冲盐水中制备（PBS）。 注：1x PBS 中的 4% PFA 可以提前制成，并储存在 -20°C 下，直到需要为止。</li>
	<li>在室温下固定活检6小时，在4°C下固定16-24小时。 注：固定持续时间应根据组织样本的大小计算，应避免过度固定。不建议使用谷醛作为固定剂，因为它引入了自荧光。</li>
	<li>在消毒罩或生物安全柜中，通过移液去除固定剂，并更换为 1.5 mL 无菌 1x PBS。将样品保持在4°C过夜，或立即进行组织处理和石蜡嵌入19。</li>
	<li>使用灭菌的微生物将组织块分割为5μm厚度，并将石蜡组织部分粘附到带电玻璃显微镜幻灯片上。对于 16S rRNA FISH 协议，每个活检至少需要两张幻灯片。 注：活检组织应相对于切割平面进行横截面排列，以确保所有截面的尿层可视化。还应注意的是，应针对细菌群落检测优化截面厚度。在组织驻留细菌极为稀少的感染（例如，每1，000个哺乳动物细胞中，<1组织驻留细菌）的感染可能需要更薄的节或多个序列部分的采样。</li>
</ol>2. 使用通用 16S rRNA 探针的原位荧光杂交
注：每个活检需要两张幻灯片。通用 16S rRNA 探头需要一张幻灯片，带杂乱的序列的控制探头需要一张幻灯片。这对在显微镜期间区分真实信号和背景信号非常重要，因为膀胱上皮在多个通道中是自动荧光的。除了扰动探针，在安装前用0.1%苏丹黑B阻塞可能会减少组织20中固有的背景自荧光。
<ol><li>试剂和烟气罩的制备
	<ol>
<li>用 70% 乙醇清洁空烟机罩（或适当安装的生物安全柜）。</li>
		<li>在10 mL无菌过滤水中制备由0.9M氯化钠（NaCl）、20 mM Tris-HCl（pH 7.2）、0.1%硫酸二钠（SDS）组成的杂交缓冲液。 注：无菌过滤水可通过 0.22 μM 过滤器通过灭菌蒸馏水制备。杂交缓冲液可在室温下储存，但SDS可能从溶液中沉淀。如果SDS沉淀，在使用前将溶液加热到50°C的水浴中。</li>
		<li>在经过清洗的灭菌瓶中，将95%和90%乙醇分别制备至少100 mL。</li>
		<li>在10mM Tris-HCl（pH 8.0）和1mM乙烯二甲酸（EDTA）缓冲液（TE）中溶解荧光标记的冻干剂探针，最终浓度为100μM。准备在 TE 缓冲区中稀释 1 μM，用于此协议。将100μM浓缩库存和1μM库存重组探头储存在-20°C，防止光线照射。 注：请勿在水中溶解荧光标记的探针。需要缓冲以防止NHS酯键的水解将荧光酸与核苷酸探针结合。</li>
		<li>用70%乙醇清洁5个Coplin罐，允许干燥，标签如下：二甲苯I，二甲苯II，95%EtOH，90%EtOH，ddH2O，并填充100 mL的适当溶液。这将有助于避免在后面的步骤中出现混淆。</li>
	</ol></li>
	<li>组织脱石化和补液
	<ol>
<li>在机罩中，将每个活检的两张幻灯片放入垂直滑动机架中。</li>
		<li>将垂直滑动机架放入二甲苯 I Coplin 罐（包含 100 mL 的二甲苯）10 分钟。</li>
		<li>从二甲苯 I 上拆下滑轨架，并将底部在纸巾上抹去，以去除多余的二甲苯。放入二甲苯 II 科普林罐 10 分钟。 注：切勿在经过认证的烟气罩外使用二甲苯。</li>
		<li>连续乙醇洗洗中补水脱水组织部分（95%和90%）在分别标有科普林罐子中各10分钟。 注：在此阶段，水浴中温式杂交缓冲液温度为50-56°C</li>
		<li>从 90% 乙醇洗涤液中取出滑轨架，在纸巾上将底部抹去多余的乙醇，并放入含有 100 mL 过滤消毒 ddH2O 的 ddH2Coplin 罐中 10 分钟。</li>
		<li>在等待 ddH2O 洗涤时，将分针稀释到 10 nM 的杂交缓冲液中，以创建染色溶液。每张幻灯片准备 150 μL 的染色溶液。 注：通过将管子包裹在铝箔中并存放在抽屉中，保护染色溶液免受光线照射。在台面上使用荧光标记探头时，请考虑在可能时关闭顶灯。不应重复使用在杂交缓冲液中稀释的探针。</li>
	</ol></li>
	<li>杂交和反染色
	<ol><li>将浸泡、皱褶的 Kimwipe 和无菌水放入 P1000 尖端盒的储液罐中，为每个探头准备一个加湿室。将吸头盒放在顶部 - 这是幻灯片的坐位置。 注：使用加湿室防止活检部分在杂交过程中干燥非常重要。应当指出，市售加湿室旨在维持稳定、潮湿的环境。然而，这里详述的技术以大大降低的成本充分控制湿度。</li>
		<li>从滑架上取下滑轨，然后放在新的纸巾上（纸巾面上）。使用 Kimwipe 擦干幻灯片。小心，只需轻轻涂抹靠近（不上）活检部分，以吸走水。使用疏水笔，在活检部分周围绘制边框，并将滑动组织侧上放在加湿室中。 注：工作迅速，使组织在杂交前不会变干。</li>
		<li>将加湿室放入设置为 50°C 的培养箱中。移液器 50-150 μL 的染色溶液直接位于组织顶部，以便填充组织周围疏水边界制作的矩形。小心不要添加太多的溶液溢出疏水边界。轻轻合上盒子。</li>
		<li>在黑暗中在50°C下孵育过夜（±16小时）。如果孵化器有一个窗口，用铝箔盖住它，以创造一个黑暗的环境。 注：需要低于 FISH 探头熔融温度的杂交温度才能发出可靠的信号。50°C 是通用 16S rRNA 探针的最佳温度，但可能不是其他探头的最佳温度。</li>
		<li>第二天早上，在 ddH2O 中制备至少 500 mL 的洗涤缓冲液，包括 0.9 M NaCl、20 mM Tris-HCl （pH 7.2）和过滤消毒器，并放入带真空瓶顶过滤器的无菌瓶中。水浴加热至50-56°C。</li>
		<li>从加湿室中取出幻灯片，并用 Kimwipe 小心地清除任何剩余的杂交溶液。将幻灯片放在垂直染色架上。</li>
		<li>将染色架放入一个不透明的科普林罐中，该罐含有 100 mL 的预加热洗涤缓冲液，为期 10 分钟。如果 Coplin 罐子不是不透明的（例如玻璃），则在孵育步骤时将其置于黑暗中 - 可能放在盒子下或抽屉里。</li>
		<li>在新的科普林罐中用新鲜的洗涤缓冲液重复洗涤步骤两次。</li>
		<li>在洗涤步骤中，通过稀释 Hoechst 33342 1：1，000 的 100 μg/mL 库存溶液，在洗涤缓冲液中准备反污渍。在同一管中，将Alexa-555小麦胚芽凝乳素（WGA）添加到5μg/mL的最终浓度中，将Alexa-555Phalloidin添加到33 nM的最终浓度中。在黑暗中储存，直到准备好使用。 注：Hoechst、Alexa-555 WGA 和 Alexa-555 Phalloidin 分别标记 DNA、粘素/尿素和 Actin，根据制造商的说明可以长期储存在黑暗中。用于探头和反印的荧光标签可以针对可用于显微镜的过滤器集进行定制。</li>
		<li>从上次洗涤中取出滑轨，并用 Kimwipe 轻轻吸走多余的洗涤缓冲液。将滑片组织侧上放在纸巾上，并在组织顶部直接添加 50-150 μL 的反污渍，以便填充疏水边界，但不会溢出。用冷冻盒顶覆盖多达四张幻灯片，并在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>将两侧放回染色架中，用新鲜的洗涤缓冲液在科普林罐中再洗两次，每次10分钟。</li>
		<li>上次清洗后彻底擦干滑片，并将纸巾侧放在冷冻盒顶下的纸巾上。直接在组织顶部挤压一滴安装介质。轻轻地将适当尺寸的盖玻片（取决于活检尺寸）放在顶部。轻轻压出任何气泡，因为它们会干扰成像，让盖玻底的幻灯片在黑暗中过夜固化。</li>
		<li>第二天，用一层淡淡的指甲油将盖玻片的边缘密封到幻灯片上。在黑暗中干燥10分钟，然后储存在黑暗中4°C，进行共聚焦显微镜。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 通过共聚焦显微镜对16S rRNA FISH的可视化
注：对于该协议，使用具有 63 倍和 100 倍目标的激光扫描共聚焦显微镜可实现最佳结果。需要适当的滤波器集来可视化 Hoechst、Alexa-488 和 Alexa-555 荧光。但是，如果共聚焦显微镜不可用，可以使用标准荧光显微镜。该协议适用于激光扫描共聚焦显微镜。
<ol><li>根据制造商的说明打开共聚焦显微镜和与显微镜相关的计算机软件。</li>
	<li>加载幻灯片，并在蓝色 （DAPI/Hoechst） 通道中使用 10 倍目标进行可视化。仔细观察，直到原子核可见。</li>
	<li>聚焦后，将目标更改为高放大倍率（63 倍或 100 倍）。在盖玻片上加油。重新聚焦新目标，确保对焦时物镜与机油接触。 注：在高放大倍率（63 倍或 100 倍）下仅使用精细对焦。石油只能用于石油目标。</li>
	<li>快速评估绿色 （eGFP/Alexa-488） 通道中的每个幻灯片，以确定哪些幻灯片为 FISH 正，哪些为 FISH 负片。 注：最好由单独的个体进行初始评估/评分，以减少实验偏差。</li>
	<li>要对染色的活检进行图像成像，请从 FISH 正滑片开始，然后切换到计算机可视化模式。选择 405（霍赫斯特）、488（Alexa-488）、555（Alexa-555）通道。使用最长的波长通道（本例中为 555）设置针孔。在 488 通道中查找用于标记细菌可视化的正确焦平面。在不更改焦平面的情况下，设置每个通道的增益、激光功率和偏移，使信号不饱和，并且背景不会过度校正。获取所有三个通道中的图像。 注：对 488 通道使用相同的设置来成像实验中的每张幻灯片。如果细菌可视化的最佳焦平面在场间发生变化，则激光功率可能需要在 405 和 555 通道中进行调整。</li>
	<li>在附加字段上重复上述步骤，直到获取整个上皮表面的图像。 注：您可能需要稍微更改焦平面，以可视化不同字段中标记的细菌，但切勿更改场间 488 通道的增益、激光功率或偏移。如果在共聚焦显微镜上工作，捕获 Z 堆栈可能信息丰富，以便分析组织内细菌的三维定位。</li>
	<li>使用 ImageJ 或类似软件处理图像并量化组织内或与组织相关的标记细菌。建议对图像进行最少的处理（例如，拆分/合并通道并转换为图像文件），但如有必要，可以执行背景校正。所有校正或其他改动应在图像之间保持一致。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

在这里，我们描述了16S rRNA FlSH检测人类膀胱活检中组织相关细菌的协议。此方案可以很容易地适应从其他组织（如胃肠道或皮肤）采集的活检，并可扩展到从各种哺乳动物模型生物体中采集的组织中。此处描述的协议还可以适用于使用多重固定（例如，形式、乙醇、甲胺）和组织制备技术（例如，石蜡或树脂嵌入和冷冻保存组织）。双标记通用 16S rRNA 探针允许对组织内存在的所有细菌物种进行无偏见检测，并可为病原体和微生物群在疾病和健康中如何与粘膜表面在空间上相互作用提供有价值的见解国家。使用诸如探针库、PhylOPDb或 ARB 软件包的 PROBE_DESIGN 工具等资源来选择或设计物种或属特 16S 或 23S rRNA 探针，该协议可适用于特定细菌物种或属的检测在组织15，21，22。该方法的一个重要未来方向是使用带有不同离散荧光道标记的物种或属特探器进行多路复用，以评估膀胱粘囊内的微生物多样性。
这种方法用于人体标本的主要限制是活检组织的可得性。机构审查委员会的批准和知情的患者同意需要获得活检，并与执行该程序的临床医生直接协作是必要的，以最佳的样本收集和访问患者元数据。CEFT 程序本身会破坏膀胱上皮，因此我们能够证明在手术前对这些区域进行活检是合理的。由于在脱蜡步骤中使用有毒二甲苯，并且需要在整个过程中保持无菌环境，因此此协议需要使用烟罩或适当安装的生物安全柜。此协议需要荧光显微镜，优选共聚焦，具有 63x 或 100x 物镜和适当的滤波器集，用于对 Hoechst、Alexa-555 和 Alexa-488 进行可视化。图1所示的代表性结果使用激光扫描共聚焦显微镜进行成像。类似的激光扫描显微镜应该产生类似的图像。该协议受其仅检测组织相关细菌的能力（例如真菌）的限制。特异性真菌18S或28S rRNA的探针必须用于识别组织18内的真菌病原体。
该协议的关键步骤包括在整个过程中保持无菌环境，并确保组织不会在杂交和染色步骤之间干涸。如果组织在手术过程中干涸，信号可能会被抑制，或者组织在洗涤过程中可能会从滑道上脱落。始终使用两个串行部分用于此协议也至关重要 - 一个用于 16S rRNA 探针，另一个用于扰动探头。如果没有这种控制，可能很难区分误报，而且获得的数据可能毫无用处或没有信息。如果此协议适用于通用 16S rRNA 探头以外的探头，则必须注意选择适当的杂交温度，大约比探头的预测熔融温度低 5 °C。为了保持信号强度，在添加探针后，组织不得长时间暴露在光线下，在显微镜期间不得过度曝光。最后，在显微镜期间，与FISH探头的荧光度探针对应的通道的相同设置必须在实验（16S rRNA探针）和控制（扰流探针）滑动之间保持一致。可视化患者衍生组织粘膜表面内细菌的空间关系对于理解和建立有关传染病基础宿主-病原体相互作用的临床相关假设至关重要。

尿道，包括尿道，膀胱，输尿管和肾脏经常暴露于细菌，包括尿微生物群，以及入侵的泌尿病原体，如尿致病大肠杆菌（UPEC），从胃肠道1，2.由糖糖甘油甘油和在表面细胞表面表达的糖基化尿皮蛋白的不透水斑块组成的水合粘液层形成屏障，通常保护膀胱上皮免受粘附物的入侵细菌3，4。在尿路感染（ UTI ）期间，这些屏障扰或破坏，促进尿致病菌5 、 6的附着和侵入膀胱上皮。在鼠模型中的研究表明，许多泌尿致病细菌，包括UPEC，肺炎克氏杆菌和肠球菌，可以在表面细胞的细胞质内形成复制细胞内群落（IBCs），并且过渡上皮细胞7、8、9内的细胞内静层储层（QIRs）。虽然UPEC在人类UTI患者的流棚上皮细胞中被识别，但泌尿原菌与人类膀胱粘液的相互作用在以前并没有被想象出来。
我们采用了一种常见的技术，荧光原位杂交（FISH），以检测从绝经后患者接受膀胱镜检查的膀胱活检中的细菌，通过电化三角炎（CEFT）进行高级抗生素-耐性复发UTI11的管理。使用16S rRNA的通用探针，我们能够客观地检测与复发UTI患者的膀胱粘囊相关的细菌物种，并确定他们在膀胱壁12中的位置。通用16S rRNA核苷酸探针先前被设计为针对细菌16S rRNA13的保守区域，对应于大肠杆菌16s rRNA的388-355位置。16S rRNA和扰动探针序列已经验证并发布，用于小鼠胃肠道14、15。表1描述了探测器的序列和属性。在本协议中，必须使用两个顺序部分，一个用于 16S rRNA 探针，另一个用于扰动探针，以便能够区分真实信号和背景信号，因为膀胱上皮、胶原蛋白和 elastin 表现出自荧光16.在此协议中，通过N-羟基琥二苯甲酸酯（NHS）酯连接，在3'和5'的特尼上设计了荧光Alexa Fluor 488标签，以增加荧光信号。
虽然该协议被开发用于人类膀胱活检部分，它可以很容易地适应使用石蜡嵌入部分从任何组织，相信细菌居住。与针对细菌表面特定抗原（例如脂多糖）的免疫组织化学实验不同，这种方法不需要事先了解组织相关细菌10、17表达的抗原.使用通用 16S rRNA 探针可以无偏见地检测样品中的所有细菌种类，但不允许确定其身份。要确定检测到的细菌的识别，必须使用物种或属特异性 16S 或 23S rRNA 探针。该协议也不会检测真菌病原体，如念珠菌，与宿主组织有关。为了检测真菌病原体，必须使用28S或18S rRNA探针18。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34055</td>
			<td>Staining Actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>W32464</td>
			<td>Staining Mucin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-07</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M900-12W</td>
			<td>Deparaffinization/washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-224</td>
			<td>Rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>TE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H21492</td>
			<td>Staining Nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic marker</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Hydrophobic barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersol 518 F</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-624-66A</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TJ274997</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>Hybridization buffer/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75486-756</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>TE/Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-754-29</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization

细菌与宿主粘膜表面和组织相互作用的可视化可以为对发病机制提供有价值的见解。虽然动物感染模型中细菌病原体的可视化可以依赖于用于表达荧光蛋白（如GFP）的细菌菌株，但从人类患者获得的活检或组织粘体内细菌的可视化需要一种不偏不倚的方法。在这里，我们描述了一种检测人类活检部分组织相关细菌的有效方法。该方法利用荧光原位杂交（FISH）与荧光标记的万能寡核苷酸探针16S rRNA，标记膀胱活检部分从复发患者获得的与组织相关的细菌尿路感染。通过使用通用的 16S rRNA 探针，可以在事先了解物种、属系或生化特性（如脂多糖 （LPS））的情况下检测细菌，这些特性是免疫荧光实验检测所需的。我们描述了16S rRNA FISH的完整方案，从活检固定到共聚焦显微镜成像。该协议可适用于几乎任何类型的组织，是患者组织中临床相关细菌宿主相互作用的无偏见可视化的有力工具。此外，使用物种或属特异性探针，此方案可用于检测患者组织内的特定细菌病原体。

该协议已针对石蜡嵌入膀胱活检部分与膀胱粘囊相关的细菌的无偏检测进行了优化。图1描述了从复发性尿路感染妇女获得的膀胱活检部分的实验中，使用该协议进行具有代表性的共聚焦显微图。两个串行部分与通用 16S rRNA（上面板）或扰动（下面板）探头杂交。从组织同一区域拍摄的图像和细菌（绿色）在组织杂交与16S rRNA探针，而不是与扰动探针清晰可见。图 2表示误报结果。在 16S rRNA 和扰动探针杂交活检部分的 405 和 488 通道中检测到与自荧光胶原蛋白或艾莱他相对应的信号，强调始终使用扰动探针控制的重要性。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>探针</td>
			<td>序列</td>
			<td>Tm</td>
			<td>荧光</td>
			<td>联动</td>
		</tr>
<tr>
<td>通用 16S rRNA</td>
			<td>5'-GCGCCTCCC GTAGGAGT-3'</td>
			<td>54.9</td>
			<td>亚历克萨-488 （5' 和 3'）</td>
			<td>NHS 埃斯特</td>
		</tr>
<tr>
<td>争夺</td>
			<td>5' - ACTCCTACGG GAGGCGC-3'</td>
			<td>那</td>
			<td>亚历克萨-488 （5' 和 3'）</td>
			<td>NHS 埃斯特</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：FISH探头序列和特性。Tm 表示熔融温度，NHS 是 N-羟基奇尼酰胺的缩写。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig1.jpg"> 图1：在人类膀胱活检中，具有代表性的16S rRNA和扰动探针的FISH共聚焦显微图。Actin 和 Mucin 标有红色，细胞核标记为蓝色，细菌标记为绿色。组织相关细菌仅检测与 16SrRNA 探针，而不是争用。以 63 倍放大倍率拍摄的图像。刻度条 = 20 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig2.jpg"> 图2：人体膀胱活检中假阳性绿色自荧光的代表性共聚焦显微图。Actin 和 Mucin 被标记为红色，细胞核标记为蓝色，细胞外基质的细菌和自荧光成分（例如胶原蛋白和乳原）为绿色。使用 16S rRNA 和扰动探针观察到绿色荧光，指示假阳性结果。以 63 倍的放大倍率拍摄图像。刻度条 = 20 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

该协议用于通过16S rRNA原位杂交和共聚焦显微镜对患者活检中组织相关细菌进行无偏见检测。

16S rRNA 荧光原位杂交检测膀胱活检中的组织驻留细菌

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

在这里，我们提出了一个可靠的协议，用于检测活检膀胱组织内的细菌，它具有广泛的应用，适用于许多组织类型，其中细菌被怀疑存在。这种技术的主要优点是它不偏不倚。它允许研究人员在事先不知道存在哪些细菌物种的情况下检测组织内的细菌。这种技术可能有助于确定细菌是否侵入了复发性尿路感染妇女的膀胱壁，并告知治疗选择，如组织穿透抗生素的选择。虽然此技术专为膀胱组织而设计，但可以广泛应用于具有常驻细菌群的其他组织，并采用最少的优化。对这项技术有新一线的人可能会为盖玻片放置和成像而挣扎。专注于优化盖玻片放置，以减少气泡，并练习对非珍贵样品进行成像。帮助演示这个程序的将是贾什卡兰·加德维，一个研究生在我的实验室。要开始此过程，请清洁空烟罩或用 70% 乙醇适当安装的生物安全柜。准备文本协议中概述的所有必要的缓冲液和试剂。接下来，用70%乙醇清洁5个Coplin罐子，让罐子干涸。当罐子干燥时，请标注此处所示，并加注 100 毫升的适当溶液。在烟罩中，将每个活检的两张幻灯片放入垂直滑动架中。将垂直滑动架放入 Xylenes 1 科普林罐中 10 分钟。在此之后，从罐子上取下滑架，并在纸巾上印上底部以去除多余的二十二环。将机架放入 Xylenes 2 罐中 10 分钟。然后在连续乙醇中重新补充去石蜡组织部分的水分，每次洗涤10分钟。洗完后，在纸巾上印上滑架底部，以去除多余的乙醇，将滑架放在包含 100 毫升滤液的 Colin 罐中，经过 10 分钟的双蒸馏水。在洗涤过程中，将探头稀释至杂交缓冲液中的 10 纳米摩尔，以创建染色溶液，确保每张幻灯片准备 150 微升染色溶液。通过向 P1000 尖端箱的储液罐中加入浸泡、皱褶的细腻任务擦拭和无菌水，为每个探头准备一个加湿室。将尖端支架墨盒放在顶部，因为这是幻灯片的位置。完成最后一次洗涤后，从滑架上取下幻灯片，将其放在干净的纸巾上，组织侧向上。使用精细的任务擦拭干燥幻灯片，小心只轻轻擦拭附近，但不是在活检部分，以灯芯离开水。使用疏水笔，在活检部分周围绘制边框，将滑动组织侧向上放在加湿室中。接下来，将加湿室放入温度为 50 摄氏度的培养箱中。直接在组织顶部的染色溶液的 50 到 150 微升之间的移液器，使组织周围疏水边界制作的矩形被填充并轻轻地关闭盒子。在黑暗中在50摄氏度下孵育。如果孵化器有一个窗口，覆盖它机智铝箔创造一个黑暗的环境。第二天早上，从加湿室中取下幻灯片，然后用细腻的任务擦拭快速清除任何剩余的杂交溶液。然后将两侧放入垂直染色架中。将染色架放入铝箔包裹的科普林罐中，内含 100 毫升预热洗涤缓冲液，使用 10 分钟。用新的科普林罐中的新洗涤缓冲液再重复此洗涤步骤两次。在这些洗涤步骤中，通过稀释洗涤缓冲液中的 Hoechst 33342 库存溶液，以 1 比 1000 的比例准备防污。在同一管上，将Alexa-555小麦胚芽凝糖蛋白加入每毫升5微克的最终浓度，将Alexa-555法罗酮的最终浓度添加到33纳米摩尔。储存在黑暗中，直到准备好使用。完成最后一次洗涤后，从 Coplin 罐子中取下幻灯片，然后用细腻的任务擦拭轻轻擦去多余的洗涤缓冲液。将幻灯片放在纸巾上，将 50 到 150 微升的反污剂直接添加到纸巾顶部，以便填充疏水边框，但不会溢出。最多四张幻灯片，顶部有低温盒，在室温下孵育 10 分钟。在此之后，将幻灯片放回染色架中，在含有新鲜洗涤缓冲液的科普林罐中再次清洗两次，每次洗涤持续 10 分钟。然后彻底干燥幻灯片，将纸巾放在冷冻盒顶部的纸巾上。将一滴安装介质直接挤压在组织顶部，轻轻将适当大小的盖玻片放在顶部。轻轻压出任何气泡，让盖玻片滑梯在黑暗中过夜固化。第二天，用透明指甲油的浅色涂层将盖玻片的边缘密封在幻灯片上，让在黑暗中干燥10分钟，然后将它们储存在黑暗中4摄氏度。当准备好对染色活检进行成像时，请打开共生显微镜和与显微镜相关的软件。从 FISH 正幻灯片开始，切换到计算机可视化模式。选择 405、488 和 555 的通道。使用最长的波长通道设置针孔，在这种情况下，该通道为 555。然后查找当前焦点平面，用于在 488 通道中对标记细菌进行可视化。在不更改焦平面的情况下，设置每个通道的增益、激光功率和偏移，使信号未饱和且背景不会过度校正。在所有三个通道中获取图像。在这项研究中，组织相关的细菌被16S rRNA FISH在人类膀胱活检中检测到。该协议已针对与石蜡嵌入膀胱活检部分膀胱粘膜相关的细菌的公正检测进行了优化。此处显示的是使用此协议对从复发性尿路感染妇女获得的膀胱活检部分进行的实验的代表性共生显微图。两个串行部分与通用 16S rRNA 或争先恐后探头混合。从组织和细菌的同一区域拍摄的图像在与16S rRNA探针混合的组织中清晰可见，但与争抢探针没有。假阳性结果也是可能的。在此代表性假阳性中，在 16S rRNA 和争先恐探混合活检部分的 405 和 488 通道中检测到与自荧光胶原蛋白或弹性蛋白对应的信号，突出了始终使用争先探针控制的重要性。为了防止光漂白，在应用探头后尽量减少组织暴露在光线下。虽然这种技术允许对人体组织中细菌进行公正检测，但它没有提供物种特定的信息。具有分类特定探测器的多路复用鱼种可用于识别存在的属或物种。在开发这项技术之前，以前没有证明细菌会侵入人类复发UTI患者的膀胱壁。我们现在使用属和物种特定的探测器来确定哪些细菌物种存在。由于烟罩的毒性，应使用 Xylenes。在成像过程中，应注意不要直视激光。将幻灯片定位在目标下时，应关闭激光。

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

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荧光原位杂交（FISH）的议定书“在人类精子

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生物学

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