Name: detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2019-10-18T15:00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Nous tenons à remercier Kim Orth et Marcela de Souza Santos pour les conseils protocolaires et Amanda Arute pour le soutien technique. Ce travail a été partiellement soutenu par la Chaire Cecil H. et Ida Green en sciences de la biologie des systèmes détenue par K.P.

Le protocole d'étude a été approuvé et a suivi les lignes directrices des comités institutionnels de biosécurité et de sécurité chimique de l'UT Dallas et du Centre médical du Sud-Ouest de l'UT. L'utilisation des biopsies des sujets humains dans ce protocole a été approuvée par et a suivi les directives des conseils institutionnels d'examen de l'UT Dallas et du centre médical du sud-ouest de l'UT. Toutes les personnes impliquées dans la collecte et le traitement de biopsie ont la protection humaine courante de sujet (HSP) et la formation de HIPPA.
1. Préparation des tissus pour la fixation et l'emcasterie de paraffine
REMARQUE: Des biopsies ont été prises des femmes consentantes subissant la cystoscopie avec l'électro-fulguration de trigonitis pour la gestion avancée de l'infection urinaire récurrente (rUTI). rUTI est défini comme 3 infections urinaires sur une période de 12 mois. La collecte de biopsie a été exécutée dans la salle d'opération tandis que le patient était sous anesthésie après avoir obtenu le consentement informé de patient par protocole d'IRB d'UTSW STU 082010-016. Tous les échantillons ont été codés et dé-identifiés avant l'expérimentation.
<ol><li>Obtenir une tasse froide (1 mm3) biopsie de la vessie trigone avec des forceps urologiques via cystoscope flexible et placer immédiatement dans un cryovial stérile de 2 ml contenant 1,5 mL de 4% v/v paraformaldehyde (PFA) préparé en 1x phosphate stérile tamponné salin (PBS). REMARQUE : 4 % de PFA en 1x PBS peuvent être faits à l'avance et stockés à -20 oC jusqu'à ce que nécessaire.</li>
	<li>Fixer la biopsie de 6 h à température ambiante ou de 16 à 24 h à 4 oC. REMARQUE: La durée de fixation doit être calculée en fonction de la taille de l'échantillon de tissu et la surfixation doit être évitée. Il n'est pas conseillé d'utiliser le glutaraldéhyde comme fixatif car il introduit l'autofluorescence.</li>
	<li>Dans une hotte stérilisée ou une armoire de biosécurité, retirer le fixatif par pipetting et remplacer par 1,5 ml de 1x PBS stérile. Gardez les échantillons à 4 oC pendant la nuit ou effectuez immédiatement le traitement des tissus et l'incorporation de paraffine19.</li>
	<li>Utilisez un microtome stérilisé pour sectionr les blocs de tissu d'une épaisseur de 5 m et adhérez les sections de tissu de paraffine aux lames de microscope en verre chargées. Un minimum de deux diapositives par biopsie sera nécessaire pour le protocole 16S rRNA FISH. REMARQUE: Le tissu de biopsie doit être disposé de section croisée par rapport au plan de coupe afin d'assurer la visualisation des couches urothéliales dans toutes les sections. Il convient également de noter que l'épaisseur de la section devrait être optimisée pour la détection des communautés bactériennes. Des sections plus minces ou un échantillonnage de plusieurs sections en série peuvent être nécessaires dans le cas d'infections où les bactéries résidentes de tissus sont extrêmement rares (p. ex., la bactérie résidente des tissus par 1 000 cellules de mammifères).</li>
</ol>2. Fluorescence In Situ Hybridization avec universal 16S rRNA Probes
REMARQUE: Deux diapositives par biopsie sont nécessaires. Une diapositive est nécessaire pour la sonde rRNA 16S universelle et une diapositive pour une sonde de contrôle avec une séquence brouillée. Ceci est important pour distinguer le vrai signal du signal de fond pendant la microscopie puisque l'épithélium de réservoir souple est auto-fluorescent dans plusieurs canaux. En plus de la sonde de brouillage, le blocage avec 0,1% Soudan Black B avant le montage peut réduire l'autofluorescence de fond inhérente au tissu20.
<ol><li>Préparation des réactifs et du capot de fumée
	<ol>
<li>Nettoyez une hotte de fumée vide (ou une armoire de biosécurité convenablement équipée) avec 70 % d'éthanol.</li>
		<li>Préparer le tampon d'hybridation composé de 0,9 M de chlorure de sodium (NaCl), de 20 mM de Tris-HCl (pH 7,2), de 0,1 % de sulfate de dodécyl de sodium (SDS) dans 10 ml d'eau filtrée stérile. REMARQUE: L'eau filtrée par les stériles peut être préparée en passant de l'eau distillée autoclave d'un filtre de 0,22 M. Le tampon d'hybridation peut être stocké à température ambiante, mais le SDS peut précipiter de la solution. Si le SDS se précipite, réchauffez la solution dans un bain d'eau de 50 oC avant de l'utiliser.</li>
		<li>Préparer au moins 100 ml chacun de 95 % et 90 % d'éthanol dans de l'eau filtrée stérile dans des bouteilles lavées et autoclavées.</li>
		<li>Dissoudre les sondes lyophilisées étiquetées fluorescentes dans 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) et 1 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic acid (EDTA) tampon préparé dans de l'eau sans nucléarisation filtrée à une concentration finale de 100 M. Préparer une dilution de 1 M dans le tampon TE pour une utilisation dans ce protocole. Entreposez les sondes reconstituées de 100 m et de 1 million de sondes reconstituées à -20 oC, protégées de la lumière. REMARQUE: Ne pas dissoudre les sondes étiquetées fluorescentes dans l'eau. La mise en mémoire tampon est nécessaire pour empêcher l'hydrolyse de la liaison de l'ester nhs conjuguant le fluorophore à la sonde nucléotide.</li>
		<li>Nettoyer cinq pots De Coplin avec 70% d'éthanol, laisser sécher, étiqueter comme suit: xylènes I, xylènes II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH2O, et remplir avec 100 ml de la solution appropriée. Cela permettra d'éviter la confusion dans les étapes ultérieures.</li>
	</ol></li>
	<li>Déparaisonetisation et réhydratation des tissus
	<ol>
<li>Dans le capot, placez deux diapositives par biopsie dans un plan vertical.</li>
		<li>Placez un plan de glissière vertical dans le bocal xylènes I Coplin (contenant 100 ml de xylènes) pendant 10 min.</li>
		<li>Retirez le rack de glissière des xylènes I et épongez le fond sur une serviette en papier pour enlever l'excès de xylènes. Placer dans le pot de xylènes II Coplin pendant 10 min. REMARQUE: Ne jamais travailler avec des xylènes à l'extérieur d'une hotte de fumée certifiée.</li>
		<li>Réhydrater les sections de tissus déparaffinisées dans les lavages successifs d'éthanol (95 % et 90 %) pendant 10 min chacun dans les pots de Coplin étiquetés respectivement. REMARQUE: Pendant cette étape, tampon d'hybridation chaude à 50-56 oC dans un bain d'eau</li>
		<li>Retirez le support à glissière du lavage à 90 % d'éthanol, épongez le fond sur des essuie-tout pour enlever l'excès d'éthanol et placez-le dans le pot ddH2O Coplin contenant 100 ml de ddH2O filtrant pendant 10 min.</li>
		<li>En attendant le lavage ddH2O, diluer les sondes à 10 nM dans un tampon d'hybridation pour créer la solution de coloration. Préparer 150 L de solution de coloration par diapositive. REMARQUE: Protégez la solution de coloration de la lumière en enveloppant les tubes dans du papier d'aluminium et en les rangeant dans un tiroir. Lorsque vous travaillez avec des sondes étiquetées fluorescentes sur le banc, envisagez d'éteindre les lumières aériennes lorsque vous le jugez. Les sondes diluées dans le tampon d'hybridation ne doivent pas être réutilisées.</li>
	</ol></li>
	<li>Hybridation et contre-staining
	<ol><li>Préparer une chambre humidifiante pour chaque sonde en plaçant de l'eau imbibée et froissée Kimwipe et stérile au réservoir d'une boîte de pointe P1000. Placez la cartouche porte-boutsur le dessus - c'est là que les diapositives seront assis. REMARQUE: Il est important d'utiliser une chambre d'humidification pour empêcher les sections de biopsie de se dessécher pendant l'hybridation. Il convient de noter que les chambres d'humidificateur disponibles dans le commerce sont conçues pour maintenir une atmosphère stable et humide. Cependant, la technique détaillée ici contrôle suffisamment l'humidité à un coût nettement inférieur.</li>
		<li>Retirer les glissières du toboggan et les placer sur un essuie-tout frais (côté tissu vers le haut). Utilisez un Kimwipe pour sécher la lame. Veillez à ne tamponner doucement près (pas sur) la section de biopsie pour évacuer l'eau. À l'aide d'un stylo hydrophobe, tracer une bordure autour de la section de biopsie et placer le côté tissu coulissant vers le haut dans la chambre d'humidification. REMARQUE: Travaillez rapidement pour que les tissus ne se dessèchent pas avant l'hybridation.</li>
		<li>Placer la chambre d'humidification dans un incubateur réglé à 50 oC. Pipette 50-150 l de la solution de coloration directement sur le dessus du tissu de sorte que le rectangle fait par la bordure hydrophobe autour du tissu est rempli. Veillez à ne pas ajouter trop de solution pour déborder la frontière hydrophobe. Fermez la boîte doucement.</li>
		<li>Incuber toute la nuit (16 h) à 50 oC dans l'obscurité. Si l'incubateur a une fenêtre, couvrez-la de papier d'aluminium pour créer un environnement sombre. REMARQUE: Une température d'hybridation inférieure à la température de fonte de la sonde FISH est nécessaire pour un signal fiable. La température optimale de la sonde 16S est optimale, mais elle n'est peut-être pas optimale pour les autres sondes.</li>
		<li>Le lendemain matin, préparer au moins 500 ml de tampon de lavage composé de 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) en ddH2O et filtrer-stériliser dans une bouteille stérile avec un filtre à vide. Chauffer à 50-56 oC dans un bain d'eau.</li>
		<li>Retirez les glissières des chambres d'humidification et éliminez soigneusement toute solution d'hybridation restante à l'aller avec un Kimwipe. Placer les glissières dans un support de coloration vertical.</li>
		<li>Placer la grille de coloration dans un bocal Coplin opaque contenant 100 ml de tampon de lavage préréchauffé pendant 10 min. Si les pots de Coplin ne sont pas opaques (p. ex. verre), placez-les dans l'obscurité pendant les étapes d'incubation — peut-être sous une boîte ou dans un tiroir.</li>
		<li>Répétez l'étape de lavage deux fois avec un tampon de lavage frais dans de nouveaux pots Coplin.</li>
		<li>Pendant les étapes de lavage, préparer la contre-tache en diluant une solution de 100 g/mL de bouillon de Hoechst 33342 1:1,000 dans le tampon de lavage. Dans le même tube, ajouter l'agglutinine du germe de blé Alexa-555 (WGA) à une concentration finale de 5 g/mL et la phalloidin Alexa-555 à une concentration finale de 33 nM. Conserver dans l'obscurité jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi. REMARQUE: Hoechst, Alexa-555 WGA, et Alexa-555 Phalloidin étiquette ADN, mucine / uroplakins, et l'actine, respectivement et peut être stocké à long terme dans l'obscurité selon les instructions du fabricant. Les étiquettes fluorescentes utilisées pour les sondes et les contre-taches peuvent être personnalisées pour les ensembles de filtres disponibles pour le microscope à utiliser.</li>
		<li>Retirez les diapositives du dernier lavage et évacuez doucement l'excédent de tampon de lavage à l'œil d'un Kimwipe. Placez les diapositives côté tissu vers le haut sur un essuie-tout et ajoutez 50-150 l de contre-tache directement sur le dessus du tissu de sorte que la bordure hydrophobe soit remplie, mais pas débordante. Couvrez jusqu'à quatre diapositives d'un dessus cryobox et incubez 10 min à température ambiante.</li>
		<li>Remettre les côtés dans la grille de coloration et laver deux fois plus dans des bocaux Coplin avec un tampon de lavage frais, pendant 10 min chacun.</li>
		<li>Séchez soigneusement les lames après le dernier lavage et placez le côté tissulaire vers le haut sur une serviette en papier sous un cryobox-top. Presser une goutte de support de montage directement sur le dessus du tissu. Placez délicatement un bordereau de taille appropriée (dépendra de la taille de la biopsie) sur le dessus. Appuyez doucement sur les bulles car elles interfèrent avec l'imagerie et permettent aux glissières glissées par le couvercle de guérir toute la nuit dans l'obscurité.</li>
		<li>Le lendemain, scellez les bords de la glissière à la glissière avec une légère couche de vernis à ongles clair. Laisser sécher 10 min dans l'obscurité, puis conserver à l'obscurité à 4 oC pour une microscopie confocale.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Visualisation de 16S rRNA FISH par Microscopie Confocal
REMARQUE: Pour ce protocole, les meilleurs résultats sont obtenus avec un microscope confocal à balayage laser avec des objectifs 63x et 100x. Des ensembles de filtres appropriés pour la visualisation de Hoechst, Alexa-488 et Alexa-555 fluorescence sont nécessaires. Cependant, la microscopie fluorescente standard peut être utilisée si un microscope confocal n'est pas disponible. Ce protocole est pour un microscope confocal de balayage laser.
<ol><li>Allumez le microscope confocal et le logiciel informatique associé aux instructions du microscope par fabricant.</li>
	<li>Chargez la diapositive et visualisez avec l'objectif 10x dans le canal bleu (DAPI/Hoechst). Concentrez-vous soigneusement jusqu'à ce que les noyaux soient visibles.</li>
	<li>Une fois concentré, changer l'objectif à un grossissement élevé (63x ou 100x). Ajouter l'huile sur le dessus de la feuille de couverture. Recentrer avec le nouvel objectif, en s'assurant que la lentille objective entre en contact avec l'huile tout en se concentrant. REMARQUE: Utilisez uniquement la mise au point fine à un grossissement élevé (63x ou 100x). Le pétrole ne doit être utilisé que pour un objectif pétrolier.</li>
	<li>Évaluez rapidement chaque diapositive à travers l'œil-pièce dans le canal vert (eGFP/Alexa-488) pour déterminer quelles diapositives sont positives FISH et qui sont négatives FISH. REMARQUE: Il est préférable que cette évaluation initiale ou la notation soit effectuée à l'aveuglepar par une personne distincte afin de réduire les biais expérimentaux.</li>
	<li>Pour imager les biopsies tachées, commencez par une diapositive positive FISH et passez au mode de visualisation par ordinateur. Sélectionnez les canaux 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Définir le trou d'épingle en utilisant le canal de longueur d'onde le plus long, dans ce cas 555. Trouvez le plan focal correct pour la visualisation des bactéries étiquetées dans le canal 488. Sans changer le plan focal, définir le gain, la puissance laser, et le décalage pour chaque canal de sorte que le signal n'est pas saturé, et l'arrière-plan n'est pas sur-corrigé. Acquérir l'image dans les trois canaux. REMARQUE: Utilisez les mêmes paramètres pour le canal 488 pour imager chaque diapositive d'une expérience. La puissance laser peut nécessiter un ajustement dans les canaux 405 et 555 si le plan focal optimal pour la visualisation bactérienne change entre les champs.</li>
	<li>Répétez sur d'autres champs jusqu'à l'acquisition d'images de toute la surface épithéliale. REMARQUE: Vous devrez peut-être changer légèrement le plan focal pour visualiser les bactéries étiquetées dans différents champs, mais ne modifiez jamais le gain, la puissance laser ou le décalage pour le canal 488 entre les champs. Si vous travaillez sur un microscope confocal, il peut être instructif de capturer une pile Z afin que la localisation tridimensionnelle des bactéries dans le tissu peut être analysée.</li>
	<li>Traiter les images et quantifier les bactéries étiquetées à l'intérieur ou associées au tissu à l'aide d'ImageJ ou d'un logiciel similaire. Un traitement minimal des images est recommandé (p. ex., fractionnement/fusion des canaux et conversion en fichiers d'images), bien que la correction de fond puisse être effectuée si nécessaire. Toutes les corrections ou autres modifications doivent rester cohérentes entre les images.</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ici, nous décrivons un protocole pour la détection des bactéries tissu-associées dans les biopsies humaines de réservoir souple par 16S rRNA FlSH. Ce protocole peut être facilement adapté pour les biopsies prélevées sur d'autres tissus, tels que le tractus gastro-intestinal ou la peau, et peut être étendu aux tissus récoltés à partir d'une variété d'organismes modèles de mammifères. Le protocole décrit ici peut également être adapté à l'utilisation de la fixation multiple (par exemple, formaline, éthanol, méthacarn) et des techniques de préparation des tissus (p. ex. la paraffine ou la résine incorporée, et des tissus cryoconservés). La sonde universelle à double étiquette 16S rRNA permet la détection impartiale de toutes les espèces bactériennes présentes dans les tissus et peut fournir un aperçu précieux de la façon dont les pathogènes et le microbiote interagissent spatialement avec les surfaces muqueuses dans la maladie et en bonne santé États. À l'aide de ressources telles que sondeBase, PhylOPDb ou l'outil PROBE-DESIGN du logiciel ARB pour la sélection ou la conception d'espèces ou de sondes 16S ou 23S rRNA spécifiques aux genres, ce protocole peut être adapté pour la détection d'espèces bactériennes ou de genres spécifiques. dans le tissu15,21,22. Une orientation future importante pour cette méthode est le multiplexage utilisant des sondes spécifiques à des espèces ou à des genres étiquetées avec différents fluorophores discrets pour l'évaluation de la diversité microbienne au sein de la muqueuse de la vessie.
La principale limitation de cette méthode pour l'utilisation sur les spécimens humains est la disponibilité de tissus biopsiés. L'approbation de la Commission d'examen institutionnel et le consentement éclairé des patients sont nécessaires pour obtenir des biopsies et une collaboration directe avec le clinicien effectuant l'intervention est nécessaire pour la collecte optimale des échantillons et l'accès aux métadonnées des patients. La procédure CEFT elle-même détruit l'épithélium de la vessie, donc nous avons pu justifier la biopsie de ces zones avant la procédure. Une hotte de fumée ou un coffret de biosécurité convenablement équipé est exigé pour ce protocole dû à l'utilisation des xylènes toxiques dans l'étape de déparaffinisation et à la nécessité de maintenir un environnement stérile tout au long de la procédure. Un microscope fluorescent, de préférence confocal, avec un 63x ou un 100x objectif et des ensembles de filtres appropriés pour la visualisation de Hoechst, Alexa-555, et Alexa-488 est nécessaire pour ce protocole. Les résultats représentatifs décrits à la figure 1 ont été photographiés à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser. Des microscopes à balayage laser similaires devraient produire des images comparables. Ce protocole est limité par sa capacité à détecter uniquement les bactéries associées aux tissus et non, par exemple, les champignons. Les sondes spécifiques au fongique 18S ou 28S rRNA doivent être utilisées pour identifier les agents pathogènes fongiques dans les tissus18.
Les étapes critiques de ce protocole comprennent le maintien d'un environnement stérile tout au long de la procédure et de s'assurer que le tissu ne se dessèche pas entre l'hybridation et les étapes de coloration. Si le tissu s'assèche pendant l'intervention, le signal peut être amorti ou le tissu peut tomber de la glissière au cours d'une étape de lavage. Il est également essentiel de toujours utiliser deux sections de série pour ce protocole - l'un pour la sonde 16S rRNA et l'autre pour la sonde de brouillage. Sans ce contrôle, il peut être très difficile de distinguer les faux positifs et les données obtenues peuvent ne pas être utiles ou informatives. Si ce protocole est adapté pour une utilisation avec une sonde autre que la sonde rRNA 16S universelle, il faut prendre soin de choisir une température d'hybridation appropriée, environ 5 oC inférieure à la température de fusion prévue de la sonde. Pour maintenir l'intensité du signal, le tissu ne doit pas être exposé à la lumière pendant de longues périodes après l'ajout de la sonde et ne doit pas être surexposé pendant la microscopie. Enfin, pendant la microscopie, les mêmes réglages pour le canal correspondant au fluorophore conjugué à la sonde FISH doivent être maintenus cohérents entre les diapositives expérimentales (sonde rRNA 16S) et de contrôle (sonde brouillée). La visualisation de la relation spatiale des bactéries dans les surfaces muqueuses des tissus dérivés du patient est essentielle pour comprendre et construire des hypothèses cliniquement pertinentes sur les interactions hôte-pathogène sous-jacentes aux maladies infectieuses.

Les voies urinaires, composées de l'urètre, de la vessie, des uretères et des reins, sont constamment exposées à des bactéries qui composent le microbiome urinaire ainsi qu'à des uropathogènes envahissants, comme l'uropathogène E. coli (UPEC), du tractus gastro-intestinal. 1,2. Une couche de mucus hydraté composé de glycosaminoglycanes et une plaque imperméable de protéines d'uroplakine glycosylated exprimées à la surface des cellules superficielles forment une barrière qui protège systématiquement l'épithélium de la vessie contre l'invasion par les adhérents bactéries3,4. Pendant l'infection urinaire (UTI), ces barrières sont dérangées ou détruites, facilitant l'attachement et l'invasion de l'épithélium de réservoir souple par les bactéries uropathogènes5,6. Le travail dans les modèles murins a révélé que de nombreuses bactéries uropathogènes, y compris UPEC, Klebsiella pneumoniae, et Enterococcus faecalis peut former des communautés intracellulaires réplicatrices (IBC) dans le cytoplasme des cellules superficielles et réservoirs intracellulaires quiescents (QIR) dans les cellules épithéliales transitoires7,8,9. Bien que l'UPEC ait été identifié dans les cellules épithéliales de hangar des patients humains d'UTI, l'interaction des uropathogens avec la muqueuse de réservoir souple chez l'homme n'avait pas été précédemment visualisée10.
Nous avons adapté une technique commune, la fluorescence in situ hybridation (FISH), pour détecter les bactéries dans la muqueuse des biopsies de la vessie obtenues auprès de patients ménopausées subissant une cystoscopie avec électrofulguration de la trigonite (CEFT) pour les gestion de l'UTI11réfractaire aux antibiotiques. À l'aide d'une sonde universelle pour l'ARNr 16S, nous avons pu détecter objectivement les espèces bactériennes associées à la muqueuse de la vessie des patients REcticiens et déterminer leur position dans la paroi de la vessie12. La sonde universelle 16S rRNA nucléotide a été précédemment conçu pour cibler une région conservée de la bactérie 16S rRNA13, qui correspond à des positions 388-355 de l'ARNr E. coli 16s. Les séquences 16S rRNA et sonde brouillée ont déjà été validées et publiées pour une utilisation dans le tractus gastro-intestinal de la souris14,15. Les séquences et les propriétés des sondes sont décrites dans le tableau 1. Il est essentiel d'utiliser deux sections séquentielles dans ce protocole, l'une pour la sonde 16S rRNA et l'autre pour la sonde de brouillage, pour être en mesure de distinguer entre le signal vrai et le signal de fond que l'épithélium de la vessie, le collagène et l'élastine présentent autofluorescence16 . Dans ce protocole, les sondes 16S rRNA et scramble ont été conçues avec des étiquettes fluorescentes Alexa Fluor 488 sur les 3' et 5' termini via N-hydroxysuccinimide (NHS) ester linkages pour augmenter le signal fluorescent.
Bien que ce protocole ait été développé pour une utilisation sur les sections de biopsie de la vessie humaine, il peut facilement être adapté pour une utilisation sur les sections incorporées à la paraffine de tout tissu où les bactéries sont censées résider. Contrairement aux expériences d'immunohistochimie qui ciblent des antigènes spécifiques (p. ex. lipopolysaccharide) à la surface bactérienne, cette méthode ne nécessite aucune connaissance préalable des antigènes exprimés par les bactéries associées aux tissus10,17 . L'utilisation de la sonde universelle 16S rRNA permet la détection impartiale de toutes les espèces bactériennes à l'intérieur de l'échantillon, mais ne permet pas de déterminer leur identité. Pour déterminer l'identification des bactéries, des espèces ou des sondes 16S ou 23S de rRNA détectées doivent être utilisées. Ce protocole ne détectera pas non plus les agents pathogènes fongiques, tels que Candida albicans, associés aux tissus hôtes. Pour la détection d'agents pathogènes fongiques, les sondes 28S ou 18S de rRNA doivent être utilisées18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34055</td>
			<td>Staining Actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>W32464</td>
			<td>Staining Mucin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-07</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M900-12W</td>
			<td>Deparaffinization/washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-224</td>
			<td>Rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>TE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H21492</td>
			<td>Staining Nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic marker</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Hydrophobic barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersol 518 F</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-624-66A</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TJ274997</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>Hybridization buffer/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75486-756</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>TE/Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-754-29</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization

La visualisation de l'interaction des bactéries avec les surfaces et tissus muqueuses hôtes peut fournir un aperçu précieux des mécanismes de pathogénie. Alors que la visualisation des agents pathogènes bactériens dans les modèles animaux d'infection peut s'appuyer sur des souches bactériennes conçues pour exprimer des protéines fluorescentes telles que le GFP, la visualisation des bactéries dans la muqueuse des biopsies ou des tissus obtenus auprès de patients humains nécessite une méthode impartiale. Ici, nous décrivons une méthode efficace pour la détection des bactéries tissu-associées dans les sections humaines de biopsie. Cette méthode utilise l'hybridation in situ fluorescente (FISH) avec une sonde oligonucléotide universelle étiquetée fluorescente pour 16S rRNA pour étiqueter les bactéries associées aux tissus dans les sections de biopsie de la vessie acquises auprès de patients souffrant de ressurphase infection des voies urinaires. Grâce à l'utilisation d'une sonde universelle 16S rRNA, les bactéries peuvent être détectées sans connaissance préalable des espèces, des genres ou des caractéristiques biochimiques, telles que le lipopolysaccharide (LPS), qui seraient nécessaires pour la détection par des expériences d'immunofluorescence. Nous décrivons un protocole complet pour 16S rRNA FISH de la fixation de biopsie à la formation image par microscopie confocale. Ce protocole peut être adapté pour une utilisation dans presque n'importe quel type de tissu et représente un outil puissant pour la visualisation impartiale des interactions bactériennes-hôtes cliniquement pertinentes dans le tissu patient. En outre, à l'aide d'espèces ou de sondes spécifiques aux genres, ce protocole peut être adapté pour la détection d'agents pathogènes bactériens spécifiques dans les tissus du patient.

Le protocole a été optimisé pour la détection impartiale des bactéries associées à la muqueuse de la vessie dans les sections de biopsie de la vessie incorporées à la paraffine. La figure 1 représente des micrographes confocalreprésentatifs représentatifs d'une expérience utilisant ce protocole sur des sections de biopsies de la vessie obtenues de femmes atteintes d'une infection récurrente des voies urinaires. Deux sections en série ont été hybrides avec les sondes universelles 16S rRNA (panneaux supérieurs) ou brouillées (panneaux inférieurs). Des images de la même région du tissu ont été prises et les bactéries (vertes) sont clairement visibles dans le tissu hybridé avec les sondes 16S rRNA et non avec la sonde de brouillage. La figure 2 représente un résultat faussement positif. Le signal correspondant au collagène autofluorescent ou à l'élastine est détecté dans les canaux 405 et 488 dans les deux sections de biopsie hybrides à la sonde 16S et brouiller les sondes, soulignant l'importance de toujours utiliser un contrôle de sonde brouillé.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>sonde</td>
			<td>ordre</td>
			<td>Tm</td>
			<td>Fluorophore</td>
			<td>lien</td>
		</tr>
<tr>
<td>RRNA universel 16S</td>
			<td>5'-GCTGCCTCCC GTAGGAGT-3'</td>
			<td>54.9</td>
			<td>Alexa-488 (5' et 3')</td>
			<td>Ester NHS</td>
		</tr>
<tr>
<td>avancer en s'aidant des pieds et des mains</td>
			<td>5'-ACTCCTACGG GAGGCAGC-3'</td>
			<td>Na</td>
			<td>Alexa-488 (5' et 3')</td>
			<td>Ester NHS</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Séquences et caractéristiques de la sonde FISH. Tm indique la température de fonte et NHS est une abréviation pour N-hydroxysuccinimide.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig1.jpg"> Figure 1 : Micrographies confocales représentatives de FISH de l'ARN1 universel 16S et de la sonde brouillée dans une biopsie de la vessie humaine. Actin e et mucine sont étiquetés en rouge, les noyaux cellulaires sont étiquetés en bleu, et les bactéries en vert. Les bactéries associées aux tissus ne sont détectées qu'avec la sonde 16SrRNA et non avec la bousculade. Images prises à 63x grossissement. Barre d'échelle de 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig2.jpg"> Figure 2 : Micrographies confocales représentatives de l'autofluorescence verte faussement positive dans une biopsie de la vessie humaine. L'actine et la mucine sont étiquetées en rouge, les noyaux cellulaires sont étiquetés en bleu, et les bactéries et les composants autofluorescents de la matrice extracellulaire (p. ex., collagène et élastine) sont verts. La fluorescence verte est observée à la fois avec les sondes 16S rRNA et scramble indiquant un résultat faussement positif. Les images sont prises à 63x grossissement. Barre d'échelle de 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Ce protocole est pour la détection impartiale des bactéries tissu-associées dans les biopsies patientes par l'hybridation in situ de rRNA 16S et la microscopie confocale.

Détection de bactéries résidentes dans les tissus dans les biopsies de la vessie par fluorescence de l'ARNr1 16S In Situ Hybridization

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Ici, nous présentons un protocole robuste pour la détection des bactéries dans le tissu de la vessie biopsié, qui a de larges applications à de nombreux types de tissus où les bactéries sont soupçonnées d’être présentes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est impartiale. Il permet au chercheur de détecter les bactéries dans les tissus sans savoir a priori quelles espèces bactériennes sont présentes.Cette technique peut aider à déterminer si les bactéries ont envahi les parois vésicales des femmes atteintes d’une infection urinaire récurrente et à éclairer les choix thérapeutiques tels que la sélection d’antibiotiques pénétrants dans les tissus. Bien que conçue pour les tissus vésicaux, cette technique peut être largement appliquée à d’autres tissus avec une population bactérienne résidente avec une optimisation minimale. Les personnes qui sont nouvelles à cette technique peuvent avoir du mal avec le placement de coverslip et l’imagerie.Concentrez-vous sur l’optimisation du placement des coverslip pour réduire les bulles et pratiquer l’imagerie sur des échantillons non précieux. Jashkaran Gadhvi, étudiant diplômé dans mon laboratoire, aidera à démontrer cette procédure. Pour commencer cette procédure, nettoyez un capot à vapeur vide ou une armoire de biosécurité convenablement équipée avec 70 % d’éthanol.Préparez tous les tampons et reagents nécessaires tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. Ensuite, nettoyez cinq pots De Coplin avec 70% d’éthanol et laissez sécher les pots. Lorsque les pots sont secs, étiquetez-les comme indiqué ici et remplissez-les de 100 millilitres de la solution appropriée.Dans le capot de fumée, placez deux glissières par biopsie dans un support vertical de glissière. Placez le support vertical dans le bocal Xylenes 1 Coplin pendant 10 minutes. Après cela, retirez la grille du bocal et épongez le fond sur une serviette en papier pour enlever l’excès de xylènes.Placer la grille dans le bocal Xylenes 2 pendant 10 minutes. Et puis réhydrater les sections de tissus dé-paraffinisés dans les lavages successifs à l’éthanol pendant 10 minutes chacun. Lorsque les lavages sont terminés, éponger le fond de la grille sur des serviettes en papier pour enlever l’excès d’éthanol et placer la grille dans le bocal Coplin contenant 100 millilitres de filtre stérilisé, double eau distillée pendant 10 minutes.Au cours de ce lavage, diluer les sondes à 10 nanomolaires dans le tampon d’hybridation pour créer la solution de coloration, en s’assurant de préparer 150 microlitres de solution de coloration par diapositive. Préparez une chambre humidifiante pour chaque sonde en ajoutant un chiffon de tâche délicat trempé et froissé et de l’eau stérile à un réservoir d’une boîte à pourboire P1000. Placez la cartouche du porte-pointe sur le dessus car c’est là que les glissières seront assises.Lorsque le lavage final est terminé, retirez la glissière de la grille et placez-la sur une serviette en papier frais, côté tissu vers le haut. Utilisez un chiffon tâche délicate pour sécher la lame, en prenant soin de tamponner doucement près, mais pas sur la section biopsie pour évacuer l’eau. À l’aide d’un stylo hydrophobe, dessinez une bordure autour de la section de biopsie et placez le côté tissu coulissant vers le haut dans la chambre humidifiante.Ensuite, placez la chambre humidifiante dans un incubateur fixé à 50 degrés Celsius. Pipette entre 50 et 150 microlitres de la solution de coloration directement sur le dessus du tissu de sorte que le rectangle fait par la bordure hydrophobe autour du tissu est rempli et fermer la boîte doucement. Incuber toute la nuit à 50 degrés Celsius dans l’obscurité.Si l’incubateur a une fenêtre, couvrez-la de papier d’aluminium pour créer un environnement sombre. Le lendemain matin, retirez les glissières des chambres humidifiantes et évacuez rapidement toute solution d’hybridation restante avec un chiffon de tâche délicat. Placez ensuite les côtés dans une grille de coloration verticale.Placez la grille de coloration dans un bocal Coplin enveloppé de papier d’aluminium contenant 100 millilitres du tampon de lavage préchauffé pendant 10 minutes. Répétez cette étape de lavage deux fois de plus avec tampon de lavage frais dans de nouveaux pots Coplin. Au cours de ces étapes de lavage, préparer la contre-tache en diluant une solution de stock de Hoechst 33342 dans le tampon de lavage, à un rapport de un à 1000.Dans le même tube, ajouter l’agglutinine germinale de blé Alexa-555 à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre et d’Alexa-555 Phalloidin à une concentration finale de 33 nanomolaires. Conserver dans l’obscurité jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Lorsque le lavage final est terminé, retirez les glissières du bocal Coplin et évacuez doucement tout tampon de lavage excédentaire avec un chiffon de tâche délicat.Placez les glissières côté tissu vers le haut sur une serviette en papier et ajoutez entre 50 et 150 microlitres de contre-tache directement sur le dessus du tissu de sorte que la bordure hydrophobe soit remplie, mais ne déborde pas. Couvrir jusqu’à quatre toboggans avec un cryobox-top et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Après cela, placez les glissières de nouveau dans la grille de coloration et lavez-les deux fois plus dans des pots Coplin contenant tampon de lavage frais, avec chaque lavage d’une durée de 10 minutes.Ensuite, séchez soigneusement les glissières et placez-les côté tissu vers le haut sur une serviette en papier sous un cryobox-dessus. Presser une goutte de supports de montage directement sur le dessus du tissu et placer délicatement un coverslip de taille appropriée sur le dessus. Appuyez doucement sur les bulles et laissez les glissières de coverslip guérir pendant la nuit dans l’obscurité.Le lendemain, sceller les bords des couvre-sols jusqu’à la glissade avec une légère couche de vernis à ongles clair et laisser sécher dans l’obscurité pendant 10 minutes, avant de les stocker dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt à l’image des biopsies tachées, allumez le microscope confocal et le logiciel associé au microscope. Commencez par une diapositive fish positive et passez au mode visualisation informatique.Sélectionnez les canaux pour 405, 488 et 555. Réglez le sténopé à l’aide du canal de longueur d’onde le plus long, qui dans ce cas est de 555. Ensuite, trouvez le plan focal actuel pour la visualisation des bactéries étiquetées dans le canal 488.Sans changer le plan focal, réglez le gain, la puissance laser et le décalage pour chaque canal de sorte que le signal ne soit pas saturé et que l’arrière-plan ne soit pas sur-corrigé. Acquérir l’image dans les trois canaux. Dans cette étude, les bactéries associées aux tissus sont détectées dans les biopsies de la vessie humaine par 16S rRNA FISH.Ce protocole a été optimisé pour la détection impartiale des bactéries associées à la muqueuse vésicale dans les sections de biopsie de la vessie intégrées à la paraffine. On y voit des micrographes confocaux représentatifs d’une expérience utilisant ce protocole sur des sections de biopsies de la vessie obtenues auprès de femmes atteintes d’infections urinaires récurrentes. Deux sections de série sont hybridées avec l’ARN rRNA universel 16S ou les sondes brouillées.Les images prises dans la même région du tissu et des bactéries sont proprement visibles dans le tissu hybridé avec les sondes rRNA 16S, mais ne sont pas avec la sonde brouillée. De faux résultats positifs sont également possibles. Dans ce faux positif représentatif, un signal correspondant au collagène ou à l’élastine autofluorescent est détecté dans les canaux 405 et 488 dans les sections hybridées de biopsie de sonde de 16S et de sonde de brouille, soulignant l’importance d’utiliser toujours un contrôle de sonde brouillée.Pour éviter le blanchiment photo, réduisez au minimum l’exposition des tissus à la lumière après l’application des sondes. Bien que cette technique permette la détection impartiale des bactéries dans les tissus humains, elle ne donne pas d’informations spécifiques aux espèces. Multiplex-FISH avec des sondes spécifiques à la taxonomie pourrait être utilisé pour identifier le genre ou les espèces présentes.Avant que cette technique ait été développée, il n’avait pas été précédemment démontré que les bactéries pourraient envahir la paroi de réservoir souple des patients récurrents humains d’UTI. Nous utilisons maintenant des sondes spécifiques au genre et aux espèces pour déterminer quelles espèces bactériennes sont présentes. Les xylènes doivent être utilisés dans un capot de fumée en raison de leur toxicité.Il faut prendre soin de ne pas regarder directement dans le laser pendant l’imagerie. Le laser doit être éteint tout en positionnant votre glissière sous l’objectif.

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