Name: detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2019-10-18T15:00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

हम प्रोटोकॉल सलाह और तकनीकी सहायता के लिए अमांडा Arute के लिए किम ओर्थ और Marcela डे सूजा सैंटोस शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. यह काम आंशिक रूप से के.पी. द्वारा आयोजित सिस्टम जीव विज्ञान में सेसिल एच और Ida ग्रीन चेयर द्वारा समर्थित किया गया था.

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लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

यहाँ, हम मानव मूत्राशय बायोप्सी में ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन द्वारा 16S rRNA FlSH. इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य ऊतकों से ली गई बायोप्सी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे जठरांत्र संबंधी मार्ग या त्वचा, और स्तनधारी मॉडल जीवों की एक किस्म से काटा ऊतकों के लिए बढ़ाया जा सकता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल भी कई निर्धारण के उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, formalin, इथेनॉल, methacarn) और ऊतक तैयारी तकनीक (उदाहरण के लिए, पैराफिन या राल एम्बेडेड, और cryopreserved ऊतकों). डबल लेबल सार्वभौमिक 16S RRNA जांच ऊतक के भीतर मौजूद सभी जीवाणु प्रजातियों के निष्पक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है और कैसे रोगजनकों और microbiota स्थानिक रूप से रोग और स्वस्थ में mucosal सतहों के साथ बातचीत में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं राज्यों. इस तरह के probeBase, PhylOPDb या प्रजातियों या वंश-विशिष्ट 16S या 23S RNA जांच के चयन या डिजाइन के लिए ARB सॉफ्टवेयर पैकेज के प्रोब जेड डिजाइन उपकरण के रूप में संसाधनों का उपयोग करना, इस प्रोटोकॉल विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों या वंश का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ऊतक15,21,22के भीतर . इस विधि के लिए एक महत्वपूर्ण भविष्य की दिशा प्रजातियों का उपयोग कर multiplexing है- या वंश-विशिष्ट जांच मूत्राशय श्लेष्म के भीतर माइक्रोबियल विविधता के मूल्यांकन के लिए अलग, असतत फ्लोरोफोर के साथ लेबल.
मानव नमूनों पर उपयोग के लिए इस विधि की प्राथमिक सीमा बायोप्सी ऊतक की उपलब्धता है। संस्थागत समीक्षा बोर्ड अनुमोदन और सूचित रोगी सहमति बायोप्सी प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं और प्रक्रिया प्रदर्शन चिकित्सक के साथ प्रत्यक्ष सहयोग इष्टतम नमूना संग्रह और रोगी मेटाडेटा के लिए उपयोग के लिए आवश्यक है. CEFT प्रक्रिया ही मूत्राशय उपकला को नष्ट कर देता है तो हम प्रक्रिया से पहले इन क्षेत्रों की बायोप्सी का औचित्य साबित करने में सक्षम थे. एक धूआं हुड या उचित रूप से फिट जैव सुरक्षा कैबिनेट deparaffinization कदम में विषाक्त xylenes के उपयोग और प्रक्रिया के दौरान एक बाँझ वातावरण बनाए रखने की जरूरत के कारण इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, अधिमानतः confocal, एक 63x या एक 100x उद्देश्य और Hoechst, Alexa-555, और Alexa-488 के दृश्य के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है. चित्र 1 में चित्रित प्रतिनिधि परिणामों को लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। इसी तरह लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप तुलनीय छवियों का उत्पादन करना चाहिए. इस प्रोटोकॉल केवल ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का पता लगाने की क्षमता द्वारा सीमित है और नहीं, उदाहरण के लिए, कवक. जांच विशिष्ट कवक 18S या 28S rRNA ऊतक18के भीतर कवक रोगजनकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए .
इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण कदम प्रक्रिया के दौरान एक बाँझ वातावरण को बनाए रखने और यह सुनिश्चित करना है कि ऊतक संकरीकरण और धुंधला कदम के बीच बाहर सूखी नहीं है शामिल हैं. यदि प्रक्रिया के दौरान ऊतक सूख जाता है, तो सिग्नल कम हो सकता है या ऊतक धोने के चरण के दौरान स्लाइड से गिर सकता है। यह भी हमेशा इस प्रोटोकॉल के लिए दो सीरियल वर्गों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है - एक 16S rRNA जांच के लिए और एक हाथापाई जांच के लिए. इस नियंत्रण के बिना, यह झूठी सकारात्मक भेद करने के लिए बहुत मुश्किल हो सकता है और प्राप्त डेटा उपयोगी या जानकारीपूर्ण नहीं हो सकता है. यदि इस प्रोटोकॉल सार्वभौमिक 16S rRNA जांच के अलावा अन्य एक जांच के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा रहा है, देखभाल एक उपयुक्त संकरीकरण तापमान का चयन करने के लिए लिया जाना चाहिए, लगभग 5 डिग्री सेल्सियस जांच की भविष्यवाणी पिघलने के तापमान से कम. संकेत तीव्रता बनाए रखने के लिए, जांच के बाद लंबे समय तक प्रकाश के संपर्क में नहीं होना चाहिए और माइक्रोस्कोपी के दौरान ओवरexposed नहीं होना चाहिए। अंत में, माइक्रोस्कोपी के दौरान FLUOROFसे के लिए इसी चैनल के लिए एक ही सेटिंग्स FISH जांच करने के लिए संगत प्रयोगात्मक (16S rRNA जांच) और नियंत्रण (स्क्रैम्बल जांच) स्लाइड के बीच संगत रखा जाना चाहिए. रोगी व्युत्पन्न ऊतकों के mucosal सतहों के भीतर बैक्टीरिया के स्थानिक संबंध कल्पना को समझने और मेजबान-रोगजनक बातचीत अंतर्निहित संक्रामक रोग के बारे में नैदानिक रूप से प्रासंगिक hypotheses के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है।

मूत्रमार्ग, मूत्राशय, मूत्रवाहिनी और गुर्दे से मिलकर मूत्र पथ लगातार बैक्टीरिया है कि मूत्र microbiome शामिल करने के साथ ही यूरोपैथोजनक ई. कोलाई (UPEC) की तरह, यूरोपैथोजेनिक ई. कोलाई (UPEC) की तरह, के संपर्क में लगातार है 1,2. हाइड्रेटेड श्लेष्म की एक परत जिसमें ग्लाइकोसामिनोग्लीकन्स और ग्लाइकोसिलेटेड यूरोप्लाकिन प्रोटीन का एक अपारगम्य पट्टिका होती है जो सतही कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त की जाती है, एक अवरोध बनाती है जो नियमित रूप से मूत्राशय उपकला को अनुलग्न द्वारा आक्रमण से बचाती है। बैक्टीरिया3,4. मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) के दौरान, इन बाधाओं को परेशान या नष्ट कर रहे हैं, uropathogenic बैक्टीरिया5,6द्वारा मूत्राशय उपकला के लगाव और आक्रमण की सुविधा. Murine मॉडल में काम से पता चला है कि कई uropathogenic बैक्टीरिया सहित UPEC, Klebsiella निमोनिया, और Enterococcus faecalis सतही कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के भीतर प्रतिकृति intracellular समुदायों (आईबीसी) फार्म कर सकते हैं और संक्रमणकालीन उपकला कोशिकाओं के भीतर शांत इंट्रासेल्यूलर जलाशय (क्यूआईआर)7,8,9. यद्यपि यू पी पी सी की पहचान मानव यूटीआई रोगियों से शेड उपकला कोशिकाओं के भीतर की गई है , फिर भी मानव में मूत्राशय के श्लेष्म के साथ यूरोपैथोजेन्स की बातचीत को पहले से10कल्पना नहीं की गई थी .
हमने उन्नत के लिए ट्राइगोनिटिस (सीईएफटी) के इलेक्ट्रोफुलगुरेशन के साथ सिस्टोस्कोपी से गुजर ने पोस्टमेनोपॉज़ल रोगियों से प्राप्त मूत्राशय बायोप्सी के श्लेष्म के भीतर बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक आम तकनीक, सीटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश) में फ्लोरोसेंट अनुकूलित किया। एंटीबायोटिक-रिफ्रैक्टरी आवर्ती यूटीआई11का प्रबंधन | 16S rRNA के लिए एक सार्वभौमिक जांच का उपयोग करना, हम निष्पक्ष आवर्ती यूटीआई रोगियों के मूत्राशय mucosa के साथ जुड़े जीवाणु प्रजातियों का पता लगाने और मूत्राशय की दीवार12के भीतर उनकी स्थिति का निर्धारण करने में सक्षम थे. सार्वभौमिक 16S RRNA न्यूक्लिओटाइड जांच पहले जीवाणु 16S rRNA13के एक संरक्षित क्षेत्र को लक्षित करने के लिए डिजाइन किया गया था, जो ई. कोलाई 16s RRNA के 388-355 पदों से मेल खाती है. 16S RRNA और हाथापाई जांच दृश्यों पहले मान्य किया गया है और माउस जठरांत्र संबंधी मार्ग14,15में उपयोग के लिए प्रकाशित . जाँचों के अनुक्रमों और गुणों का वर्णन सारणी 1में किया गया है। यह इस प्रोटोकॉल में दो अनुक्रमिक वर्गों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, एक 16S rRNA जांच के लिए और एक हाथापाई जांच के लिए, मूत्राशय उपकला के रूप में सच और पृष्ठभूमि संकेत के बीच भेद करने में सक्षम होने के लिए, कोलेजन और elastin प्रदर्शन autofluorscence16 . इस प्रोटोकॉल में, 16S rRNA और हाथापाई जांच फ्लोरोसेंट एलेक्सा फ्लोर 488 लेबल के साथ डिजाइन किए गए थे दोनों पर 3' और 5' टर्मिनी के माध्यम से एन-hydroxysuccinimide (एनएचएस) एस्टर लिंकेज फ्लोरोसेंट संकेत बढ़ाने के लिए.
हालांकि इस प्रोटोकॉल मानव मूत्राशय बायोप्सी वर्गों पर उपयोग के लिए विकसित किया गया था, यह आसानी से किसी भी ऊतक जहां बैक्टीरिया रहते हैं माना जाता है से पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रयोगों के विपरीत जो जीवाणु सतह पर विशिष्ट एंटीजन (उदा., lipopolissaccharide) को लक्षित करते हैं, इस विधि के लिए ऊतक-संबद्ध बैक्टीरिया द्वारा व्यक्त एंटीजन के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहींहै 10,17 . सार्वभौमिक 16S RRNA जांच का उपयोग नमूने के भीतर सभी जीवाणु प्रजातियों के निष्पक्ष पता लगाने की अनुमति देता है, लेकिन उनकी पहचान के निर्धारण की अनुमति नहीं है. पता लगाया बैक्टीरिया की पहचान निर्धारित करने के लिए, प्रजातियों या जीनस-विशिष्ट 16S या 23S RNA जांच का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यह प्रोटोकॉल मेजबान ऊतक से जुड़े फंगल रोगजनकों, जैसे कैंडिडा एल्बिकन्सका भी पता नहीं लगाएगा। कवक रोगजनकों का पता लगाने के लिए, 28S या 18S RRNA जांच18इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34055</td>
			<td>Staining Actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>W32464</td>
			<td>Staining Mucin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-07</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M900-12W</td>
			<td>Deparaffinization/washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-224</td>
			<td>Rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>TE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H21492</td>
			<td>Staining Nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic marker</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Hydrophobic barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersol 518 F</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-624-66A</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TJ274997</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>Hybridization buffer/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75486-756</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>TE/Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-754-29</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization

मेजबान म्यूकोसल सतहों और ऊतकों के साथ बैक्टीरिया की बातचीत का दृश्य रोगजनन के तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। जबकि संक्रमण के पशु मॉडल में जीवाणु रोगजनकों के दृश्य ऐसे GFP के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर जीवाणु उपभेदों पर भरोसा कर सकते हैं, बायोप्सी या मानव रोगियों से प्राप्त ऊतक के mucosa के भीतर बैक्टीरिया के दृश्य की आवश्यकता है एक निष्पक्ष विधि। यहाँ, हम मानव बायोप्सी वर्गों में ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन. इस विधि में एक फ्लोरोसेंट लेबल के साथ situ संकरीकरण (फिश) में फ्लोरोसेंट का इस्तेमाल 16S rRNA के लिए सार्वभौमिक ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांच के लिए मूत्राशय बायोप्सी वर्गों आवर्तक से पीड़ित रोगियों से प्राप्त के भीतर ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया लेबल करने के लिए मूत्र पथ संक्रमण। एक सार्वभौमिक 16S RRNA जांच के उपयोग के माध्यम से, बैक्टीरिया प्रजातियों के पूर्व ज्ञान के बिना पता लगाया जा सकता है, वंश, या जैव रासायनिक विशेषताओं, जैसे lipopolysaccharide (LPS), कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों द्वारा पता लगाने के लिए आवश्यक होगा. हम confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए बायोप्सी निर्धारण से 16S rRNA FISH के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल ऊतक के लगभग किसी भी प्रकार में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और रोगी के ऊतकों में चिकित्सकीय प्रासंगिक जीवाणु-होस्ट बातचीत के निष्पक्ष दृश्य के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है. इसके अलावा, प्रजातियों या वंश-विशिष्ट जांचों का उपयोग करके, इस प्रोटोकॉल को रोगी के ऊतकों के भीतर विशिष्ट जीवाणु रोगजनकों का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल पैराफिन-एम्बेडेड मूत्राशय बायोप्सी वर्गों में मूत्राशय mucosa के साथ जुड़े बैक्टीरिया के निष्पक्ष पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है। चित्र 1 आवर्ती मूत्र पथ के संक्रमण के साथ महिलाओं से प्राप्त मूत्राशय बायोप्सी के वर्गों पर इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक प्रयोग से प्रतिनिधि confocal micrographs दर्शाया गया है. दो धारावाहिक वर्गों या तो सार्वभौमिक 16S rRNA (ऊपरी पैनलों) या हाथापाई (कम पैनलों) जांच के साथ संकरित किया गया. ऊतक के एक ही क्षेत्र से छवियाँ ले जाया गया और बैक्टीरिया (हरा) 16S rRNA जांच के साथ संकर ऊतक में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं और नहीं हाथापाई जांच के साथ. चित्र 2 एक झूठे धनात्मक परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है। autofluorescent कोलेजन या elastin के लिए इसी संकेत दोनों 16S rRNA और हाथापाई जांच-हाइब्रिड बायोप्सी वर्गों में 405 और 488 चैनलों में पाया जाता है हमेशा एक हाथापाई जांच नियंत्रण का उपयोग कर के महत्व पर प्रकाश डाला.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>जांच</td>
			<td>अनुक्रम</td>
			<td>Tm</td>
			<td>फ्लोरोफोर</td>
			<td>संबंध</td>
		</tr>
<tr>
<td>यूनिवर्सल 16S rRNA</td>
			<td>5'-जीसीटीजीसीसीसी GTAGGAGT-3'</td>
			<td>54.9</td>
			<td>एलेक्सा-488 (5' और 3')</td>
			<td>एन एच एस एस्टर</td>
		</tr>
<tr>
<td>संघर्ष</td>
			<td>5'-ACTCCTACGG GAGGC-3'</td>
			<td>ना</td>
			<td>एलेक्सा-488 (5' और 3')</td>
			<td>एन एच एस एस्टर</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: मछली जांच दृश्यों और विशेषताओं। टी एम पिघलने के तापमान को इंगित करता है और एनएचएस एन-हाइड्रोक्सीसिसिनीमाइड के लिए एक संक्षिप्त नाम है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig1.jpg"> चित्र 1: सार्वभौमिक 16S rRNA के FISH के प्रतिनिधि confocal micrographs और एक मानव मूत्राशय बायोप्सी में हाथापाई जांच. Actin और Mucin लाल रंग में लेबल कर रहे हैं, सेलुलर नाभिक नीले रंग में लेबल कर रहे हैं, और हरे रंग में बैक्टीरिया. ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया केवल 16SrRNA जांच के साथ पता चला रहे हैं और नहीं हाथापाई. 63x आवर्धन पर ली गई छवियाँ. स्केल बार $ 20 डिग्री मी. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig2.jpg"> चित्र 2: एक मानव मूत्राशय बायोप्सी में झूठी सकारात्मक हरी autofluorscence के प्रतिनिधि confocal micrographs. Actin और mucin लाल रंग में लेबल कर रहे हैं, सेलुलर नाभिक नीले रंग में लेबल कर रहे हैं, और बैक्टीरिया और extracellular मैट्रिक्स के autofluorescent घटकों (उदा., कोलेजन और elastin) हरे हैं. ग्रीन फ्लोरोसेंट दोनों 16S rRNA और हाथापाई जांच एक झूठी सकारात्मक परिणाम का संकेत के साथ मनाया जाता है. छवियाँ 63x आवर्धन पर लिया जाता है. स्केल बार $ 20 डिग्री मी. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

यह प्रोटोकॉल रोगी बायोप्सी में ऊतक संबद्ध बैक्टीरिया का निष्पक्ष पता लगाने के लिए है 16S rRNA द्वारा situ संकरीकरण और confocal माइक्रोस्कोपी में.

सीटू हाइब्रिडाइजेशन में 16S आरएनए फ्लोरोसेंट द्वारा ब्लैडर बायोप्सी में ऊतक-निवासी बैक्टीरिया की जांच

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

यहां हम बायोप्सीड मूत्राशय ऊतक के भीतर बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिसमें कई ऊतक प्रकारों के लिए व्यापक अनुप्रयोग होते हैं जहां बैक्टीरिया के मौजूद होने की आशंका होती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह निष्पक्ष है। यह शोधकर्ता को प्राथमिकताओं के ज्ञान के बिना ऊतक के भीतर बैक्टीरिया का पता लगाने की अनुमति देता है जिसमें से जीवाणु प्रजातियां मौजूद हैं।इस तकनीक को निर्धारित करने में मदद कर सकते है अगर बैक्टीरिया आवर्ती मूत्र पथ संक्रमण के साथ महिलाओं के मूत्राशय की दीवारों पर हमला किया है और इस तरह के ऊतक मर्मज्ञ एंटीबायोटिक दवाओं के चयन के रूप में चिकित्सीय विकल्पों को सूचित । मूत्राशय के ऊतकों के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, इस तकनीक को मोटे तौर पर न्यूनतम अनुकूलन के साथ निवासी बैक्टीरियल आबादी के साथ अन्य ऊतकों पर लागू किया जा सकता है। जो व्यक्ति इस तकनीक के लिए नए हैं, वे कवरस्लिप प्लेसमेंट और इमेजिंग के साथ संघर्ष कर सकते हैं।बुलबुले को कम करने और गैर-कीमती नमूनों पर इमेजिंग का अभ्यास करने के लिए कवरलिप प्लेसमेंट को अनुकूलित करने पर ध्यान केंद्रित करें। इस प्रक्रिया को प्रदर्शित करने में मदद कर रहा है जशकरण गडवी, मेरी प्रयोगशाला में एक स्नातक छात्र । इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, 70% इथेनॉल के साथ एक खाली धूम हुड या उचित रूप से फिट बायोसेफ्टी कैबिनेट को साफ करें।पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित सभी आवश्यक बफ़र्स और रिएजेंट तैयार करें। इसके बाद, 70% इथेनॉल के साथ पांच कॉपलिन जार को साफ करें और जार को सूखने दें। जब जार सूखे होते हैं, तो उन्हें लेबल करें जैसा कि यहां दिखाया गया है और उन्हें उचित समाधान के 100 मिलीलीटर से भरें।धूम हुड में, एक ऊर्ध्वाधर स्लाइड रैक में प्रति बायोप्सी दो स्लाइड रखें। वर्टिकल स्लाइड रैक को 10 मिनट के लिए जाइलीन्स 1 कॉपलिन जार में रखें। इसके बाद, जार से स्लाइड रैक निकालें और अतिरिक्त जाइलीन को हटाने के लिए एक पेपर तौलिया पर नीचे दाग दें।रैक को 10 मिनट के लिए जाइलीन्स 2 जार में रखें। और फिर लगातार इथेनॉल वॉश में डी-पैराफिनाइज्ड ऊतक वर्गों को 10 मिनट के लिए फिर से हाइड्रेट करें। जब वॉश पूरा हो जाते हैं, तो अतिरिक्त इथेनॉल को हटाने के लिए पेपर टॉवेल पर स्लाइड रैक के नीचे दाग दें और रैक को कॉप्लिन जार में रखें जिसमें 100 मिलीलीटर फिल्टर स्टरलाइज्ड, डबल डिस्टिल्ड पानी 10 मिनट के लिए होता है।इस धोने के दौरान, धुंधला समाधान बनाने के लिए संकरण बफर में 10 नैनोमोलर के लिए जांच को पतला करें, जिससे प्रति स्लाइड धुंधला समाधान के 150 माइक्रोलीटर तैयार करना सुनिश्चित करें। एक P1000 टिप बॉक्स के एक जलाशय में एक लथपथ, उखड़ नाजुक कार्य पोंछ और बाँझ पानी जोड़कर प्रत्येक जांच के लिए एक आर्द्रीकरण कक्ष तैयार करें । टिप धारक कारतूस को शीर्ष पर रखें क्योंकि यह वह जगह है जहां स्लाइड बैठेंगे।जब अंतिम धोने पूरा हो गया है, स्लाइड रैक से स्लाइड को हटा दें और उन्हें एक ताजा कागज तौलिया, ऊतक की ओर ऊपर पर जगह है । स्लाइड को सुखाने के लिए एक नाजुक कार्य पोंछ का उपयोग करें, केवल धीरे से थपका के पास लेकिन बायोप्सी अनुभाग पर नहीं पानी दूर बाती करने के लिए सावधान किया जा रहा है । एक हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके, बायोप्सी अनुभाग के चारों ओर एक सीमा खींचें और स्लाइड ऊतक की ओर को ह्यूमिडिफाइंग चैंबर में रखें।इसके बाद, ह्यूमिडिफाइंग चैंबर को 50 डिग्री सेल्सियस तक सेट करने वाले इनक्यूबेटर में रखें। ऊतक के शीर्ष पर सीधे धुंधला समाधान के 50 और 150 माइक्रोलीटर के बीच पिपेट ताकि ऊतक के चारों ओर हाइड्रोफोबिक सीमा द्वारा बनाया गया आयत भर जाए और बॉक्स को धीरे-धीरे बंद कर दिया जाए। रात भर अंधेरे में 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।यदि इनक्यूबेटर में एक खिड़की है, तो अंधेरे वातावरण बनाने के लिए इसे बुद्धि एल्यूमीनियम पन्नी को कवर करें। अगली सुबह, ह्यूमिडिफाइज़िंग कक्षों से स्लाइड हटा दें और जल्दी से एक नाजुक कार्य पोंछ के साथ किसी भी शेष संकरण समाधान को दूर करें। फिर पक्षों को एक ऊर्ध्वाधर धुंधला रैक में रखें।एक एल्यूमीनियम पन्नी लिपटे Coplin जार में धुंधला रैक रखें 10 मिनट के लिए पूर्व गरम धोने बफर के १०० मिलीलीटर युक्त । नए कॉपलिन जार में ताजा वॉश बफर के साथ इस वॉश स्टेप को दो बार और दोहराएं। इन वॉश स्टेप्स के दौरान, वॉश बफर में होचस्ट 33342 के स्टॉक समाधान को एक से 1000 के अनुपात में कमजोर करके काउंटर-दाग तैयार करें।इसी ट्यूब के लिए, एलेक्सा-555 गेहूं रोगाणु एग्लुटिनिन को पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर और एलेक्सा-555 फालोडिन की अंतिम एकाग्रता में 33 नैनोमोलर की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। उपयोग करने के लिए तैयार होने तक अंधेरे में स्टोर करें। जब अंतिम धोने पूरा हो गया है, Coplin जार से स्लाइड निकालें और धीरे से दूर एक नाजुक कार्य पोंछ के साथ किसी भी अतिरिक्त धोने बफर बाती ।स्लाइड्स टिश्यू साइड को एक पेपर तौलिया पर रखें और टिश्यू के ऊपर सीधे काउंटर दाग के 50 से 150 माइक्रोलीटर के बीच डालें ताकि हाइड्रोफोबिक बॉर्डर भर जाए, लेकिन लबालब न हो। क्रायोबॉक्स-टॉप के साथ चार स्लाइड तक कवर करें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, स्लाइड्स को वापस धुंधला रैक में रखें और उन्हें ताजा वॉश बफर युक्त कॉप्लिन जार में दो बार और धो लें, प्रत्येक धोने के साथ 10 मिनट तक चलने वाला।फिर स्लाइडों को अच्छी तरह से सुखा लें और उन्हें क्रायोबॉक्स-टॉप के नीचे एक पेपर तौलिया पर टिश्यू-साइड रखें। बढ़ते मीडिया की एक बूंद सीधे ऊतक के शीर्ष पर निचोड़ें और धीरे-धीरे शीर्ष पर उचित आकार के कवरलिप रखें। धीरे-धीरे किसी भी बुलबुले को दबाएं और कवरस्लिप स्लाइड को अंधेरे में रात भर ठीक करने की अनुमति दें।अगले दिन, स्पष्ट नेल पॉलिश के हल्के कोट के साथ स्लाइड करने के लिए कवरस्लिप के किनारों को सील करें और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत करने से पहले 10 मिनट के लिए अंधेरे में सूखने दें। दाग बायोप्सी को इमेज करने के लिए तैयार होने पर, कंफोकल माइक्रोस्कोप और माइक्रोस्कोप से जुड़े सॉफ्टवेयर पर स्विच करें। एक मछली सकारात्मक स्लाइड के साथ शुरू करें और कंप्यूटर विज़ुअलाइज़ेशन मोड पर स्विच करें।405, 488 और 555 के लिए चैनलों का चयन करें। सबसे लंबे तरंगदैर्ध्य चैनल का उपयोग करके पिनहोल सेट करें, जो इस मामले में 555 है। फिर 488 चैनल में लेबल बैक्टीरिया के दृश्य के लिए वर्तमान फोकल प्लेन ढूंढें।फोकल प्लेन को बदले बिना, लाभ, लेजर पावर सेट करें, और प्रत्येक चैनल के लिए ऑफसेट करें ताकि सिग्नल संतृप्त न हो और पृष्ठभूमि अधिक सही न हो। तीनों चैनलों में छवि प्राप्त करें। इस अध्ययन में, ऊतक से जुड़े बैक्टीरिया 16S rRNA मछली द्वारा मानव मूत्राशय बायोप्सी में पाए जाते हैं।पैराफिन एम्बेडेड ब्लैडर बायोप्सी सेक्शन में ब्लैडर म्यूकोसा से जुड़े बैक्टीरिया के निष्पक्ष पहचान के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है। यहां दिखाया गया है एक प्रयोग से प्रतिनिधि confocal माइक्रोग्राफ मूत्राशय बायोप्सी के वर्गों पर इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर आवर्ती मूत्र पथ संक्रमण के साथ महिलाओं से प्राप्त कर रहे हैं । दो धारावाहिक वर्गों या तो सार्वभौमिक 16S rRNA या हाथापाई जांच के साथ संकरित कर रहे हैं ।छवियां ऊतक और बैक्टीरिया के एक ही क्षेत्र से लिया 16S rRNA जांच के साथ संकरित ऊतक में साफ दिखाई दे रहे हैं, लेकिन हाथापाई की जांच के साथ नहीं हैं । झूठे सकारात्मक परिणाम भी संभव हैं। इस प्रतिनिधि में झूठी सकारात्मक, ऑटोफ्लोरेटेंट कोलेजन या इलास्टिन के अनुरूप संकेत 405 और 488 चैनलों में दोनों 16S rRNA और हाथापाई जांच संकरित बायोप्सी वर्गों में पाया जाता है, हमेशा एक हाथापाई जांच नियंत्रण का उपयोग करने के महत्व को उजागर।फोटो-ब्लीचिंग को रोकने के लिए, जांच लागू होने के बाद ऊतक के प्रकाश के संपर्क को कम करें। हालांकि यह तकनीक मानव ऊतकों में बैक्टीरिया का निष्पक्ष पता लगाने की अनुमति देती है, यह प्रजातियों को विशिष्ट जानकारी नहीं देती है। मल्टीप्लेक्स-मछली के साथ वर्गीकरण विशिष्ट जांच का उपयोग मौजूद जीनस या प्रजातियों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।इससे पहले कि इस तकनीक को विकसित किया गया था, यह पहले से प्रदर्शित नहीं किया गया था कि बैक्टीरिया मानव आवर्ती UTI रोगियों के मूत्राशय की दीवार पर आक्रमण कर सकता है । अब हम जीनस और प्रजातियों विशिष्ट जांच का उपयोग कर रहे है निर्धारित करने के लिए जो जीवाणु प्रजातियों मौजूद हैं । जाइलीन का उपयोग उनकी विषाक्तता के कारण धूम हुड में किया जाना चाहिए।इमेजिंग के दौरान सीधे लेजर में देखने के लिए नहीं देखभाल की जानी चाहिए। उद्देश्य के तहत अपनी स्लाइड की स्थिति करते समय लेजर बंद कर दिया जाना चाहिए।

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

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प्रतिदीप्ति बगल में</emमानव शुक्राणु में> संकरण (मछली) प्रोटोकॉल

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

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वायरल शाही सेना के प्रतिदीप्ति द्वारा जांच<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण (मछली)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

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एकल कोशिका के जीन प्रतिलेखन की शाही सेना प्रतिदीप्त द्वारा विश्लेषण<em&gt; स्वस्थानी</em&gt; संकरण (मछली)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

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प्रतिदीप्ति का प्रयोग mRNA अणुओं के दृश्य और विश्लेषण<em&gt; स्वस्थानी</emमें&gt; संकरण<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

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प्रतिदीप्ति डीएनए के लिए सरल तरीका<em&gt; बगल में</em&gt; कुचल गुणसूत्रों को संकरण

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

कुशल न्यूक्लिक एसिड निकासी और -16 rRNA जीन अनुक्रमण जीवाणु समुदाय विशेषता के लिए

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

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अवलोकन और टेलोमेर की मात्रा और दोहराव दृश्यों का उपयोग प्रतिदीप्ति<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण (मछली) में PNA जांच के साथ<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

सीटू संकरण प्रयोगों में एकल-अणु प्रतिदीप्ति के लिए व्यक्तिगत ई कोलाई कोशिकाओं में लेबलिंग टेप के लिए विधि

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

16S rRNA-Amplicon अनुक्रमण द्वारा मल माइक्रोबियल लक्षण वर्णन के लिए निर्देशित प्रोटोकॉल

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

टिक अगली पीढ़ी 16S rRNA Amplicon अनुक्रमण द्वारा Microbiome लक्षण वर्णन

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...