Name: detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2019-10-18T15:00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Ringraziamo Kim Orth e Marcela de Souza Santos per la consulenza sul protocollo e Amanda Arute per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dalla Presidente cecil H. e Ida Green in Systems Biology Science detenuti da K.P.

Il protocollo di studio è stato approvato e seguito dalle linee guida dei Comitati di Biosicurezza Istituzionale e Sicurezza Chimica di UT Dallas e UT Southwestern Medical Center. L'uso di biopsie da soggetti umani in questo protocollo è stato approvato e seguito le linee guida dei comitati di revisione istituzionale dell'UT Dallas e dell'UT Southwestern Medical Center. Tutte le persone coinvolte nella raccolta e nell'elaborazione della biopsia hanno l'attuale formazione sulla protezione del soggetto umano (HSP) e sulla formazione HIPPA.
1. Preparazione dei tessuti per la fissazione e l'incorporamento della paraffina
 NOT:</</c0> Le biopsie sono state prese da donne consenzienti sottoposte a cistoscopia con elettrogurazione della trigonite per la gestione avanzata dell'infezione ricorrente delle vie urinarie (rUTI). rUTI è definito come 3 UTI in un periodo di 12 mesi. La raccolta della biopsia è stata eseguita in sala operatoria mentre il paziente era in anestesia dopo aver ottenuto il consenso del paziente informato per protocollo UTSW IRB STU 082010-016. Tutti i campioni sono stati codificati e de-identificati prima della sperimentazione.
<ol><li>Ottenere una biopsia atazza fredda dalla vescica trigone con pinze urologiche tramite cistoscopio flessibile e mettere immediatamente in uno sterile crioviale da 2 mL contenente 1,5 mL del 4% v/v paraformaldedeide (PFA) preparato in 1x sterile fosfato buffer (PBS). NOTA: il 4% di PFA in 1x PBS può essere effettuato in anticipo e conservato a -20 gradi centigradi fino a quando necessario.</li>
	<li>Fissare la biopsia per 6 h a temperatura ambiente o per 16-24 h a 4 gradi centigradi. NOT:</</c2> La durata della fissazione deve essere calcolata in base alle dimensioni del campione di tessuto e si dovrebbe evitare la fissazione eccessiva. Non è consigliabile utilizzare glutaraldeide come fissativo in quanto introduce l'autofluorescenza.</li>
	<li>In un cappuccio sterilizzato o in un armadietto di biosicurezza, rimuovere il fissativo con il pipettaggio e sostituirlo con 1,5 mL di sterile 1x PBS. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi o eseguire immediatamente l'elaborazione dei tessuti e l'incorporamento della paraffina19.</li>
	<li>Utilizzare un microtoma sterilizzato per sezionare blocchi di tessuto a 5 m di spessore e aderire sezioni di tessuto di paraffina ai vetrini del microscopio di vetro caricati. Per il protocollo 16S rRNA FISH saranno necessari almeno due vetrini per biopsia. NOT:</</c4> Il tessuto della biopsia deve essere disposto in sezione rispetto al piano di taglio al fine di garantire la visualizzazione degli strati uroteliali in tutte le sezioni. Va anche notato che lo spessore della sezione dovrebbe essere ottimizzato per il rilevamento della comunità batterica. Possono essere necessarie sezioni più sottili o campionamento di più sezioni seriali nel caso di infezioni in cui i batteri residenti nei tessuti sono estremamente scarsi (ad esempio, il batterio residente nei tessuti <1 per 1.000 cellule di mammiferi).</li>
</ol>2. Fluorescenza nell'ibridazione situ con sonde rRNA Universal 16S
 NOT:</</c0> Sono necessari due vetrini per biopsia. Una diapositiva è necessaria per la sonda rRNA universale 16S e una diapositiva per una sonda di controllo con una sequenza strapazzata. Questo è importante per distinguere il segnale vero dal segnale di fondo durante la microscopia poiché l'epitelio della vescica è auto-fluorescente in più canali. Oltre alla sonda scramble, il blocco con 0,1% Sudan Black B prima del montaggio può ridurre l'autofluorescenza dello sfondo inerente al tessuto20.
<ol><li>Preparazione di reagenti e cappa di fumi
	<ol>
<li>Pulire un cofano di fume vuoto (o un armadio di biosicurezza opportunamente montato) con 70% di etanolo.</li>
		<li>Preparare il buffer di ibridazione composto da 0,9 M di cloruro di sodio (NaCl), 20 mM MM Tris-HCl (pH 7.2), 0,1% solfato di solfato di solfato di sodio dodecyl (SDS) in 10 mL di acqua filtrata sterile. NOT:</</c2> L'acqua filtrata sterile può essere preparata passando l'acqua distillata autoclaved attraverso un filtro da 0,22 M. Il buffer di ibridazione può essere memorizzato a temperatura ambiente, ma l'SDS può precipitare dalla soluzione. Se l'SDS precipita, scaldare la soluzione in un bagno d'acqua a 50 gradi centigradi prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare almeno 100 mL ciascuno del 95% e del 90% di etanolo in acqua sterile filtrata in bottiglie lavate e autoclaved.</li>
		<li>Sciogliere le sonde liofilizzate fluorescenti in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) e 1 mM di acido etilenediaminetratratico (TE) preparato in acqua priva di nucleato sterilizzata a un'umidità finale di 100 m. Preparare una diluizione di 1 M nel buffer TE per l'uso in questo protocollo. Conservare sia 100 M di stock concentrato sia 1 sonde ricostituite a -20 gradi protetti dalla luce. NOT:</</c3> Non sciogliere le sonde etichettate fluorescentmente in acqua. Il buffering è necessario per prevenire l'idrolisi del legame dell'estere NHS che coniuga il fluoroforo alla sonda di nucleotide.</li>
		<li>Pulire cinque vasetti Coplin con 70% etanolo, lasciare asciugare, etichettare come segue: xylenes I, xylenes II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH2O, e riempire con 100 mL della soluzione appropriata. Ciò consentirà di evitare confusione nei passaggi successivi.</li>
	</ol></li>
	<li>Deperaffinazione e reidratazione dei tessuti
	<ol>
<li>Nel cofano, posizionare due vetrini per biopsia in un rack di diapositive verticale.</li>
		<li>Inserire un portante verticale nel barattolo di xilene I Coplin (contenente 100 mL di xilene) per 10 min.</li>
		<li>Rimuovere il portante dagli xileni I e macchiare il fondo su un tovagliolo di carta per rimuovere gli xylene in eccesso. Mettere nel barattolo di xilenes II Coplin per 10 min. NOT:</</c2> Non lavorare mai con gli xileni al di fuori di una cappa di fumi certificata.</li>
		<li>Reidratare le sezioni di tessuto disperaffinato in successivi otanoli (95% e 90%) per 10 min ciascuno nei vasetti Coplin rispettivamente etichettati. NOT:</</c3> Durante questa fase, il buffer di ibridazione caldo a 50-56 gradi centigradi in un bagno d'acqua</li>
		<li>Togliere il rack scorrevole dal 90% di etanolo, macchiare il fondo sugli asciugamani di carta per rimuovere l'etanolo in eccesso e mettere nel barattolo ddH2O Coplin contenente 100 mL di ddH2 O sterilizzati a filtro per 10 min.</li>
		<li>In attesa del lavaggio ddH2O, diluire le sonde a 10 nM nel buffer di ibridazione per creare la soluzione di colorazione. Preparare 150 l di soluzione di colorazione per diapositiva. NOT:</</c7> Proteggere la soluzione di colorazione dalla luce avvolgendo i tubi in un foglio di alluminio e conservandolo in un cassetto. Quando si lavora con sonde con etichetta fluorescente sul piano della panca, è consigliabile spegnere le luci aeree quando possibile. Le sonde diluite nel buffer di ibridazione non devono essere riutilizzate.</li>
	</ol></li>
	<li>Ibridazione e contro-colorazione
	<ol><li>Preparare una camera umida per ogni sonda posizionando Kimwipe imbevuto e accartocciato e acqua sterile al serbatoio di una scatola di punta P1000. Posizionare la cartuccia del portapunta in alto - questo è dove sisiedi i vetrini. NOT:</</c0> È importante utilizzare una camera umidificante per evitare che le sezioni di biopsia si secchino durante l'ibridazione. Va notato che le camere umide disponibili in commercio sono progettate per mantenere un'atmosfera stabile e umida. Tuttavia, la tecnica qui descritta controlla sufficientemente l'umidità a costi notevolmente inferiori.</li>
		<li>Rimuovere i vetrini dal rack scorrevole e posizionare su un tovagliolo di carta fresca (tessuto-side up). Utilizzare un Kimwipe per asciugare la diapositiva. Fare attenzione a tamponare delicatamente solo vicino (non su) la sezione biopsia per stoppino via l'acqua. Utilizzando una penna idrofobica, disegnare un bordo intorno alla sezione biopsia e posizionare il velo a lato superiore nella camera umidificante. NOT:</</c0> Lavorare rapidamente in modo che i tessuti non si asciughino prima dell'ibridazione.</li>
		<li>Collocare la camera umidante in un'incubatrice impostata a 50 gradi centigradi. Pipetta 50-150 -L della soluzione di colorazione direttamente sopra il tessuto in modo che il rettangolo fatto dal bordo idrofobico intorno al tessuto sia riempito. Fare attenzione a non aggiungere troppa soluzione per traboccare il confine idrofobico. Chiudere la scatola delicatamente.</li>
		<li>Incubare durante la notte (16 h) a 50 gradi centigradi al buio. Se l'incubatrice ha una finestra, coprirla con un foglio di alluminio per creare un ambiente scuro. NOT:</</c0> Per un segnale affidabile è necessaria una temperatura di ibridazione al di sotto della temperatura di fusione della sonda FISH. 50 gradi centigradi è la temperatura ottimale per la sonda rRNA universale 16S, ma potrebbe non essere ottimale per altre sonde.</li>
		<li>La mattina seguente, preparare almeno 500 mL di tampone Wash composto da 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) in ddH2O e filtrare-sterilizzare in una bottiglia sterile con un filtro sottovuoto bottiglia-top. Riscaldare fino a 50-56 gradi centigradi in un bagno d'acqua.</li>
		<li>Rimuovere i vetrini dalle camere umide e spazzare via con attenzione qualsiasi soluzione di ibridazione rimanente con un Kimwipe. Posizionare i vetrini in un rack di colorazione verticale.</li>
		<li>Collocare il rack di colorazione in un barattolo DiCoplin opaco contenente 100 mL di buffer di lavaggio preriscaldato per 10 min. Se i vasi Coplin non sono opachi (ad esempio, vetro), metteteli al buio durante le fasi di incubazione, magari sotto una scatola o in un cassetto.</li>
		<li>Ripetere il passaggio di lavaggio due volte con il tampone di lavaggio fresco nei nuovi vasetti Coplin.</li>
		<li>Durante le fasi di lavaggio, preparare il contro-macchia diluindo una soluzione di riserva di 100 g/mL di Hoechst 33342 1:1,000 nel tampone di lavaggio. Allo stesso tubo, aggiungere l'agglutininina di germe di grano Alexa-555 (WGA) ad una concentrazione finale di 5g/mL e Alexa-555 Phalloidin ad una concentrazione finale di 33 nM. Conservare al buio fino a quando non è pronto per l'uso. NOT:</</c0> Hoechst, Alexa-555 WGA, e Alexa-555 Phalloidin etichetta DNA, mucin/uroplakins, e actin, rispettivamente e possono essere conservati a lungo termine al buio secondo le istruzioni del produttore. Le etichette fluorescenti utilizzate per sonde e controstaine possono essere personalizzate per i set di filtri disponibili per il microscopio da utilizzare.</li>
		<li>Rimuovere i vetrini dall'ultimo lavaggio e spazzare via delicatamente buffer di lavaggio in eccesso con un Kimwipe. Posizionare i vetrini a lato su un tovagliolo di carta e aggiungere 50-150 l di contro-macchia direttamente sopra il tessuto in modo che il bordo idrofobico sia riempito, ma non traboccante. Coprire fino a quattro scivoli con un criobox-top e incubare per 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimettere i lati nel rack di colorazione e lavarsi altre due volte in vasetti Coplin con tampone di lavaggio fresco, per 10 min ciascuno.</li>
		<li>Asciugare accuratamente i vetrini dopo l'ultimo lavaggio e mettere il lato tessuto su un tovagliolo di carta sotto un criobox-top. Spremere una goccia di supporti di montaggio direttamente sulla parte superiore del tessuto. Posizionare delicatamente un coverslip di dimensioni appropriate (dipenderà dalle dimensioni della biopsia) sulla parte superiore. Premere delicatamente le bolle in quanto interferiranno con l'imaging e permettono ai vetrini rivolti al coperchio di curare durante la notte al buio.</li>
		<li>Il giorno dopo, sigillare i bordi del coperchio alla diapositiva con un leggero strato di smalto trasparente. Lasciare asciugare per 10 min al buio e poi conservare al buio a 4 gradi centigradi per la microscopia confocale.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Visualizzazione di 16S rRNA FISH di Confocal Microscopy
 NOT:</</c0> Per questo protocollo, i migliori risultati si ottengono con un microscopio confocale a scansione laser con obiettivi 63x e 100x. Sono necessari set di filtri appropriati per la visualizzazione di fluorescenza di Hoechst, Alexa-488 e Alexa-555. Tuttavia, la microscopia fluorescente standard può essere utilizzata se non è disponibile un microscopio confocale. Questo protocollo è per un microscopio confocale a scansione laser.
<ol><li>Accendere il microscopio confocale e il software del computer associato al microscopio per le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Caricare la diapositiva e visualizzare con l'obiettivo 10x nel canale blu (DAPI/Hoechst). Mettere a fuoco con attenzione fino a quando i nuclei sono visibili.</li>
	<li>Una volta focalizzato, modificare l'obiettivo ad alto ingrandimento (63x o 100x). Aggiungere l'olio sopra lo scivolo di copertura. Rifocalizzare con il nuovo obiettivo, assicurandosi che la lente dell'obiettivo entri in contatto con l'olio durante la messa a fuoco. NOT:</</c0> Utilizzare solo la messa a fuoco fine ad alto ingrandimento (63x o 100x). L'olio deve essere utilizzato solo per un obiettivo petrolifero.</li>
	<li>Valuta rapidamente ogni diapositiva attraverso l'occhio nel canale verde (eGFP/Alexa-488) per determinare quali diapositive sono FISH positive e quali sono FISH negative. NOT:</</c1> È meglio se questa valutazione/punteggio iniziale viene fatto accecato da un individuo separato per ridurre la distorsione sperimentale.</li>
	<li>Per immaginare le biopsie colorate, iniziare con una diapositiva positiva FISH e passare alla modalità di visualizzazione del computer. Selezionare i canali 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Impostare il foro stenopeico utilizzando il canale di lunghezza d'onda più lungo, in questo caso 555. Trova il piano focale corretto per la visualizzazione dei batteri etichettati nel canale 488. Senza cambiare il piano focale, impostare il guadagno, la potenza del laser e l'offset per ogni canale in modo che il segnale non sia saturo e lo sfondo non sia sovracorretto. Acquisire l'immagine in tutti e tre i canali. NOT:</</c2> Usa le stesse impostazioni per il canale 488 per visualizzare ogni diapositiva di un esperimento. La potenza laser può richiedere la regolazione nei canali 405 e 555 se il piano focale ottimale per la visualizzazione batterica cambia tra i campi.</li>
	<li>Ripetere su campi aggiuntivi fino all'acquisizione di immagini dell'intera superficie epiteliale. NOT:</</c3> Potrebbe essere necessario modificare leggermente il piano focale per visualizzare i batteri etichettati in campi diversi, ma non modificare mai il guadagno, la potenza del laser o l'offset per il canale 488 tra i campi. Se si lavora su un microscopio confocale, può essere informativo per catturare uno stack di z in modo che la localizzazione tridimensionale dei batteri all'interno del tessuto può essere analizzata.</li>
	<li>Elabora immagini e quantifica i batteri etichettati all'interno o associati al tessuto utilizzando ImageJ o software simili. Si raccomanda un'elaborazione minima delle immagini (ad esempio, la divisione/unione dei canali e la conversione in file di immagine), anche se, se necessario, può essere eseguita una correzione dello sfondo. Tutte le correzioni o altre modifiche devono rimanere coerenti tra le immagini.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, descriviamo un protocollo per la rilevazione di batteri associati ai tessuti nelle biopsie della vescica umana da 16S rRNA FlSH. Questo protocollo può essere facilmente adattato per biopsie prese da altri tessuti, come il tratto gastrointestinale o la pelle, e può essere esteso ai tessuti raccolti da una varietà di organismi modello di mammiferi. Il protocollo qui descritto può anche essere adattato per l'uso di tecniche di fissazione multipla (ad esempio, formalina, etanolo, methacarn) e tecniche di preparazione dei tessuti (ad esempio, paraffina o resina incorporata e tessuti crioconservati). La sonda rRNA universale a doppia etichetta 16S consente il rilevamento imparziale di tutte le specie batteriche presenti all'interno dei tessuti e può fornire preziose informazioni su come gli agenti patogeni e il microbiota interagiscono spazialmente con le superfici mucose nella malattia e Stati. Utilizzando risorse come probeBase, PhylOPDb o lo strumento PROBE_DESIGN del pacchetto software ARB per la selezione o la progettazione di specie o sonde rRNA 16S o 23S specifiche del genere, questo protocollo può essere adattato per il rilevamento di specifiche specie batteriche o generi all'interno del tessuto15,21,22. Un'importante direzione futura per questo metodo è il multiplexing utilizzando sonde specifiche per specie o generi etichettate con fluorofori diversi e discreti per la valutazione della diversità microbica all'interno della mucosa della vescica.
La limitazione primaria di questo metodo per l'uso su campioni umani è la disponibilità di tessuto biopsied. L'approvazione del Consiglio di revisione istituzionale e il consenso informato del paziente sono necessari per ottenere biopsie e la collaborazione diretta con il medico che esegue la procedura è necessaria per la raccolta ottimale dei campioni e l'accesso ai metadati dei pazienti. La stessa procedura CEFT distrugge l'epitelio della vescica, quindi siamo stati in grado di giustificare la biopsia di queste aree prima della procedura. Per questo protocollo è necessaria una cappa di fumi o un armadio di biosicurezza opportunamente montato a causa dell'uso di xylene tossici nella fase di deparaffinazione e della necessità di mantenere un ambiente sterile durante tutta la procedura. Per questo protocollo è richiesto un microscopio fluorescente, preferibilmente confocale, con un obiettivo 63x o un set di filtri 100x e appropriati per la visualizzazione di Hoechst, Alexa-555 e Alexa-488. I risultati rappresentativi illustrati nella Figura 1 sono stati raffigurati utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. Microscopi a scansione laser simili dovrebbero produrre immagini simili. Questo protocollo è limitato dalla sua capacità di rilevare solo i batteri associati ai tessuti e non, ad esempio, i funghi. Per identificare i patogeni fungini all'interno del tessuto18.
I passaggi critici per questo protocollo includono il mantenimento di un ambiente sterile durante tutta la procedura e la garanzia che il tessuto non si asciughi tra le fasi di ibridazione e colorazione. Se il tessuto si asciuga durante la procedura, il segnale può essere smorzato o il tessuto può cadere dal vetrino durante una fase di lavaggio. È inoltre fondamentale utilizzare sempre due sezioni seriali per questo protocollo: una per la sonda rRNA 16S e una per la sonda scramble. Senza questo controllo, può essere molto difficile distinguere i falsi positivi e i dati ottenuti potrebbero non essere utili o informativi. Se questo protocollo viene adattato per l'uso con una sonda diversa dalla sonda rRNA universale 16S, è necessario prestare attenzione a selezionare una temperatura di ibridazione appropriata, circa 5 gradi centigradi inferiore alla temperatura di fusione prevista della sonda. Per mantenere l'intensità del segnale, il tessuto non deve essere esposto alla luce per lunghi periodi di tempo dopo l'aggiunta della sonda e non deve essere sovraesposto durante la microscopia. Infine, durante la microscopia le stesse impostazioni per il canale corrispondente al fluoroforo coniugato alla sonda FISH devono essere mantenute coerenti tra i vetrini sperimentali (16S rRNA sonda) e di controllo (sonda scramble). La visualizzazione della relazione spaziale dei batteri all'interno delle superfici mucosali dei tessuti derivati dal paziente è fondamentale per comprendere e costruire ipotesi clinicamente rilevanti sulle interazioni ospite-patogeno alla base delle malattie infettive.

Il tratto urinario, costituito da uretra, vescica, ureteri e reni è costantemente esposto a batteri che compongono il microbioma urinario e invadendo uropatogeni, come e. coli uropatogeni (UPEC), dal tratto gastrointestinale 1,2. Uno strato di muco idratato costituito da glicosaminoglycani e una placca impermeabile di proteine uroplakin glicosillate espresse sulla superficie delle cellule superficiali formano una barriera che protegge abitualmente l'epitelio della vescica dall'invasione da aderente batteri3,4. Durante l'infezione del tratto urinario (UTI), queste barriere sono disturbate o distrutte, facilitando l'attaccamento e l'invasione dell'epitelio della vescica da batteri uropatogeni5,6. Il lavoro nei modelli murini ha rivelato che molti batteri uropatogeni tra cui UPEC, Klebsiella pneumoniaee Enterococcus faecalis possono formare comunità intracellulari replicative (IBC) all'interno del citoplasma delle cellule superficiali e bacini intracellulari quiescenti (QIR) all'interno delle cellule epiteliali transitorie7,8,9. Sebbene l'UPEC sia stato identificato all'interno delle cellule epiteliali dei pazienti affetti da UTI umani, l'interazione degli uropatogeni con la mucosa della vescica nell'uomo non era stata precedentemente visualizzata10.
Abbiamo adattato una tecnica comune, la fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH), per rilevare i batteri all'interno della mucosa delle biopsie della vescica ottenute da pazienti in postmenopausa sottoposti a cistoscopia con elettrofulguration di trigonite (CEFT) per gestione dell'UTI ricorrente antibiotico-refrattaria11. Utilizzando una sonda universale per 16S rRNA, siamo stati in grado di rilevare oggettivamente le specie batteriche associate alla mucosa della vescica di pazienti UTI ricorrenti e determinare la loro posizione all'interno della parete della vescica12. La sonda universale 16S rRNA nucleotide è stata precedentemente progettata per colpire una regione conservata del batterio 16S rRNA13, che corrisponde alle posizioni 388-355 dell'E. coli 16s rRNA. Le sequenze di sonda 16S rRNA e scramble sono state precedentemente convalidate e pubblicate per l'uso nel tratto gastrointestinale14,15. Le sequenze e le proprietà dei probe sono descritte nella Tabella 1. È essenziale utilizzare due sezioni sequenziali in questo protocollo, una per la sonda rRNA 16S e una per la sonda scramble, per essere in grado di distinguere tra segnale vero e segnale di fondo come l'epitelio della vescica, collagene ed elastina esibiscono autofluorescenza16 . In questo protocollo, le sonde 16S rRNA e scramble sono state progettate con etichette fluorescenti Alexa Fluor 488 sia sul 3' che sul 5' termini via N-hydroxysuccinimide (NHS) per aumentare il segnale fluorescente.
Anche se questo protocollo è stato sviluppato per l'uso su sezioni di biopsia della vescica umana, può essere facilmente adattato per l'uso su sezioni incorporate in paraffina da qualsiasi tessuto in cui si ritiene che i batteri risiedano. A differenza degli esperimenti di immunohistochimica che prendono di mira specifici antigeni (ad esempio, lipopolysaccharide) sulla superficie batterica, questo metodo non richiede alcuna conoscenza preliminare degli antigeni espressi dai batteri associati ai tessuti10,17 . L'uso della sonda rRNA universale 16S consente il rilevamento imparziale di tutte le specie batteriche all'interno del campione, ma non consente la determinazione della loro identità. Per determinare l'identificazione dei batteri rilevati, devono essere utilizzate sonde 16S o 23S rRNA specifiche del genere. Questo protocollo non rileverà anche agenti patogeni fungini, come Candida albicans, associati al tessuto ospite. Per la rilevazione di patogeni fungini, le sonde rRNA 28S o 18S devono essere utilizzate18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34055</td>
			<td>Staining Actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>W32464</td>
			<td>Staining Mucin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-07</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M900-12W</td>
			<td>Deparaffinization/washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-224</td>
			<td>Rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>TE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H21492</td>
			<td>Staining Nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic marker</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Hydrophobic barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersol 518 F</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-624-66A</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TJ274997</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>Hybridization buffer/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75486-756</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>TE/Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-754-29</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization

La visualizzazione dell'interazione dei batteri con le superfici e i tessuti mucosali ospiti può fornire preziose informazioni sui meccanismi della patogenesi. Mentre la visualizzazione di patogeni batterici in modelli animali di infezione può contare su ceppi batterici progettati per esprimere proteine fluorescenti come la GFP, la visualizzazione di batteri all'interno della mucosa delle biopsie o dei tessuti ottenuti da pazienti umani richiede un metodo imparziale. Qui, descriviamo un metodo efficiente per il rilevamento di batteri associati ai tessuti nelle sezioni di biopsia umana. Questo metodo utilizza l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) con una sonda oligonucleotide universale etichettata fluorescentmente per 16S rRNA per etichettare i batteri associati ai tessuti all'interno delle sezioni di biopsia della vescica acquisite da pazienti affetti da ricorrenti infezione delle vie urinarie. Attraverso l'uso di una sonda rRNA 16S universale, i batteri possono essere rilevati senza una conoscenza preliminare di specie, generi o caratteristiche biochimiche, come il lipopolisaccharide (LPS), che sarebbe necessario per il rilevamento da esperimenti di immunofluorescenza. Descriviamo un protocollo completo per 16S rRNA FISH dalla fissazione della biopsia all'imaging mediante microscopia confocale. Questo protocollo può essere adattato per l'uso in quasi tutti i tipi di tessuto e rappresenta un potente strumento per la visualizzazione imparziale delle interazioni batterico-ospite clinicamente rilevanti nel tessuto del paziente. Inoltre, utilizzando sonde specifiche di specie o generi, questo protocollo può essere adattato per il rilevamento di specifici patogeni batterici all'interno del tessuto del paziente.

Il protocollo è stato ottimizzato per il rilevamento imparziale di batteri associati alla mucosa della vescica nelle sezioni di biopsia della vescica incorporate in paraffina. La figura 1 illustra micrografie confocali rappresentative di un esperimento che utilizza questo protocollo su sezioni di biopsie della vescica ottenute da donne con infezione ricorrente delle vie urinarie. Due sezioni seriali sono state ibridate con le sonde universali 16S rRNA (pannelli superiori) o scramble (pannelli inferiori). Sono state scattate immagini dalla stessa regione del tessuto e i batteri (verde) sono chiaramente visibili nel tessuto ibridato con le sonde rRNA 16S e non con la sonda scramble. La figura 2 rappresenta un risultato falso positivo. Il segnale corrispondente al collagene autofluorescente o all'elastina viene rilevato nei canali 405 e 488 nelle sezioni di biopsia 16S rRNA e scramble con sonda ibridata evidenziando l'importanza di utilizzare sempre un controllo sonda scramble.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>sonda</td>
			<td>sequenza</td>
			<td>Tm</td>
			<td>Fluoroforo</td>
			<td>connessione f</td>
		</tr>
<tr>
<td>RRNA Universale 16S</td>
			<td>5'-GCTGCCTCCCC GTAGGAGT-3'</td>
			<td>54.9</td>
			<td>Alexa-488 (5' e 3')</td>
			<td>NHS Ester</td>
		</tr>
<tr>
<td>strapazzare</td>
			<td>5'-ACTCCTACGG GAGGCAGC-3'</td>
			<td>Na</td>
			<td>Alexa-488 (5' e 3')</td>
			<td>NHS Ester</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Sequenze e caratteristiche della sonda FISH. Tm indica la temperatura di fusione e NHS è un'abbreviazione per N-hydroxysuccinimide.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig1.jpg"> Figura 1: Micrografie confocali rappresentative di FISH di rRNA universale 16S e sonda scramble in una biopsia della vescica umana. Actin e Mucin sono etichettati in rosso, i nuclei cellulari sono etichettati in blu e i batteri in verde. I batteri associati ai tessuti vengono rilevati solo con la sonda 16SrRNA e non con la scramble. Immagini scattate con un ingrandimento di 63 volte. Barra della scala: 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig2.jpg"> Figura 2: Micrografie confocali rappresentative di autofluorescenza verde falsa positiva in una biopsia della vescica umana. Actin e mucin sono etichettati in rosso, i nuclei cellulari sono etichettati in blu e i batteri e i componenti autofluorescenti della matrice extracellulare (ad esempio, collagene ed elastina) sono verdi. La fluorescenza verde è osservata sia con le sonde 16S rRNA che con sonde scramble che indicano un risultato falso positivo. Le immagini vengono scattate con un ingrandimento di 63 volte. Barra della scala: 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Questo protocollo è per il rilevamento imparziale di batteri associati ai tessuti nelle biopsie dei pazienti da parte di 16S rRNA nell'ibridazione situ e microscopia confocale.

Rilevamento di batteri residenti nei tessuti nelle biopsie della vescica mediante 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Qui presentiamo un solido protocollo per il rilevamento di batteri all'interno del tessuto vescicale biopsied, che ha ampie applicazioni a molti tipi di tessuti in cui si sospetta che i batteri siano presenti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è imparziale. Permette al ricercatore di rilevare batteri all'interno dei tessuti senza conoscere a priori quali specie batteriche sono presenti.Questa tecnica può aiutare a determinare se i batteri hanno invaso le pareti vescicali delle donne con infezione ricorrente del tratto urinario e informare le scelte terapeutiche come la selezione di antibiotici penetranti nei tessuti. Sebbene progettata per i tessuti vescicale, questa tecnica può essere ampiamente applicata ad altri tessuti con popolazioni batteriche residenti con un'ottimizzazione minima. Gli individui che sono nuovi a questa tecnica possono avere difficoltà con il posizionamento delle copertine e l'imaging.Concentrati sull'ottimizzazione del posizionamento delle copertine per ridurre le bolle e praticare l'imaging su campioni non preziosi. Ad aiutare a dimostrare questa procedura sarà Jashkaran Gadhvi, uno studente laureato nel mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, pulire una cappa aspirante vuota o un armadio di biosicurezza opportunamente montato con il 70% di etanolo.Preparare tutti i buffer e i reagenti necessari come indicato nel protocollo di testo. Quindi, pulire cinque barattoli di Coplin con 70% di etanolo e lasciare asciugare i barattoli. Quando i barattoli sono asciutti, etichettarli come mostrato qui e riempirli con 100 millilitri della soluzione appropriata.Nella cappa dei fumi, posizionare due diapositive per biopsia in un porta scorrevole verticale. Posizionare il porta scorrevole verticale nel barattolo Xylenes 1 Coplin per 10 minuti. Successivamente, rimuovere il portapacchi dal barattolo e asciugare il fondo su un tovagliolo di carta per rimuovere gli xileni in eccesso.Posizionare il rack nel barattolo Xylenes 2 per 10 minuti. E poi reidratare le sezioni di tessuto de-paraffinato in lavaggi di etanolo successivi per 10 minuti ciascuno. Una volta completati i lavaggi, asciugare la parte inferiore del portapacchi sugli asciugamani di carta per rimuovere l'etanolo in eccesso e posizionare il rack nel barattolo Coplin contenente 100 millilitri di filtro sterilizzato, acqua distillata doppia per 10 minuti.Durante questo lavaggio, diluire le sonde a 10 nanomolari nel tampone di ibridazione per creare la soluzione di colorazione, assicurandosi di preparare 150 microlitri di soluzione di colorazione per diapositiva. Preparare una camera umidificante per ogni sonda aggiungendo una salvietta delicata imbevuta e accartocciata e acqua sterile a un serbatoio di una scatola di punta P1000. Posizionare la cartuccia porta punta sopra in quanto è qui che si siederanno le diapositive.Al termine del lavaggio finale, rimuovere lo scivolo dal porta scorrevole e posizionarlo su un tovagliolo di carta fresco, lato tessuto verso l'alto. Utilizzare una delicata salvietta per asciugare lo scivolo, facendo attenzione solo delicatamente tamponare vicino ma non sulla sezione della biopsia per assorbirla. Utilizzando una penna idrofobica, disegnare un bordo intorno alla sezione della biopsia e posizionare il lato del tessuto di scorrimento nella camera umidificante.Quindi, posizionare la camera umidificante in un'incubatrice impostata su 50 gradi Celsius. Pipetta tra 50 e 150 microlitri della soluzione di colorazione direttamente sopra il tessuto in modo che il rettangolo realizzato dal bordo idrofobico intorno al tessuto sia riempito e chiudere delicatamente la scatola. Incubare durante la notte a 50 gradi Celsius al buio.Se l'incubatore ha una finestra, coprirla con un foglio di alluminio per creare un ambiente buio. La mattina seguente, rimuovere le diapositive dalle camere umidificanti e rimuovere rapidamente qualsiasi soluzione di ibridazione rimanente con una delicata salvietta per compiti. Quindi posizionare i lati in un rack di colorazione verticale.Posizionare il rack di colorazione in un barattolo coplin avvolto in alluminio contenente 100 millilitri del tampone di lavaggio prerischiato per 10 minuti. Ripeti questo passaggio di lavaggio altre due volte con tampone di lavaggio fresco in nuovi barattoli Coplin. Durante queste fasi di lavaggio, preparare la contro-macchia diluire una soluzione stock di Hoechst 33342 in tampone di lavaggio, con un rapporto da uno a 1000.Allo stesso tubo, aggiungere l'agglutinina germinale di grano Alexa-555 ad una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro e Alexa-555 Phalloidin ad una concentrazione finale di 33 nanomolare. Conservare al buio fino a quando non è pronto per l'uso. Al termine del lavaggio finale, rimuovere le diapositive dal barattolo Coplin e rimuovere delicatamente qualsiasi tampone di lavaggio in eccesso con una delicata salvietta per compiti.Posizionare il lato tissutale delle diapositive su un tovagliolo di carta e aggiungere tra 50 e 150 microlitri di contromacchina direttamente sopra il tessuto in modo che il bordo idrofobico sia riempito, ma non traboccante. Coprire fino a quattro diapositive con un criobox-top e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, riposizionare le diapositive nel rack di colorazione e lavarle altre due volte in barattoli Coplin contenenti tampone di lavaggio fresco, con ogni lavaggio della durata di 10 minuti.Quindi asciugare accuratamente gli scivoli e posizionarli sul lato tissutale su un tovagliolo di carta sotto una criobox-top. Spremere una goccia di supporti di montaggio direttamente sopra il tessuto e posizionare delicatamente un coverslip di dimensioni appropriato sulla parte superiore. Premere delicatamente eventuali bolle e lasciare che le diapositive di coverslip si curino durante la notte al buio.Il giorno successivo, sigillare i bordi delle copertine allo scivolo con una leggera mano di smalto chiaro e lasciare asciugare al buio per 10 minuti, prima di conservarli al buio a quattro gradi Celsius. Quando sei pronto per l'immagine delle biopsie macchiate, accendi il microscopio confocale e il software associato al microscopio. Inizia con una diapositiva positiva FISH e passa alla modalità di visualizzazione del computer.Selezionare i canali per 405, 488 e 555. Impostare il foro stenopeica utilizzando il canale di lunghezza d'onda più lungo, che in questo caso è 555. Quindi trova l'attuale piano focale per la visualizzazione dei batteri etichettati nel canale 488.Senza modificare il piano focale, impostare il guadagno, la potenza laser e l'offset per ogni canale in modo che il segnale non sia saturo e lo sfondo non sia sovra-corretto. Acquisisci l'immagine in tutti e tre i canali. In questo studio, i batteri associati ai tessuti vengono rilevati nelle biopsie della vescica umana da 16S rRNA FISH.Questo protocollo è stato ottimizzato per il rilevamento imparziale di batteri associati alla mucosa vescica nelle sezioni di biopsia della vescica incorporate nella paraffina. Qui sono mostrate le micrografie confocali rappresentative di un esperimento che utilizza questo protocollo su sezioni di biopsie vescicali ottenute da donne con infezioni ricorrenti del tratto urinario. Due sezioni seriali sono ibridate con l'rRNA universale 16S o le sonde scramble.Le immagini prese dalla stessa regione del tessuto e dei batteri sono chiaramente visibili nel tessuto ibridato con le sonde 16S rRNA, ma non sono con la sonda scramble. Sono possibili anche risultati falsi positivi. In questo rappresentante falso positivo, un segnale corrispondente al collagene autofluorescente o all'elastina viene rilevato nei canali 405 e 488 sia nelle sezioni di biopsia ibridata a rRNA 16S che scramble probe, evidenziando l'importanza di utilizzare sempre un controllo della sonda scramble.Per prevenire lo sbiancamento fotografico, ridurre al minimo l'esposizione dei tessuti alla luce dopo l'applicazione delle sonde. Mentre questa tecnica consente il rilevamento imparziale di batteri nei tessuti umani, non fornisce informazioni specifiche alla specie. Multiplex-FISH con sonde specifiche della tassonomia potrebbe essere usato per identificare il genere o le specie presenti.Prima dello sviluppo di questa tecnica, non era stato precedentemente dimostrato che i batteri potessero invadere la parete della vescica dei pazienti affetti da UTI ricorrenti nell'uomo. Ora stiamo usando sonde specifiche per genere e specie per determinare quali specie batteriche sono presenti. Gli xileni devono essere utilizzati in una cappa aspirante a causa della loro tossicità.Si deve fare attenzione a non guardare direttamente nel laser durante l'imaging. Il laser deve essere spento durante il posizionamento dello scivolo sotto l'obiettivo.

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