Name: detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2019-10-18T15:00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Ким Орт и Марсела де Соуза Сантос за консультацию по протоколу и Аманда Аруте за техническую поддержку. Эта работа была частично поддержана Сесил Х. и Ида Грин кафедры системной биологии науки провел К.П.

<ol>
	<li>Abraham, S. N., Miao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+immune+responses+to+urinary+tract+infections.">The nature of immune responses to urinary tract infections.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).</li><li>Wolfe, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+uncultivated+bacteria+in+the+adult+female+bladder.">Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).</li><li>Grist, M., Chakraborty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mucin+layer+in+the+urinary+bladder.">Identification of a mucin layer in the urinary bladder.</a> Urology. 44 (1), 26-33 (1994).</li><li>Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uroplakins+in+urothelial+biology,+function,+and+disease.">Uroplakins in urothelial biology, function, and disease.</a> Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).</li><li>Ingersoll, M. A., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+infection+to+immunotherapy:+host+immune+responses+to+bacteria+at+the+bladder+mucosa.">From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa.</a> Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).</li><li>Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+tract+infections:+epidemiology,+mechanisms+of+infection+and+treatment+options.">Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).</li><li>Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+Host+Cells+and+Tissues+by+Uropathogenic+Bacteria.">Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria.</a> Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).</li><li>Horsley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+subverts+and+invades+the+host+urothelium+in+patients+with+chronic+urinary+tract+infection.">Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection.</a> PLoS One. 8 (12), (2013).</li><li>Rosen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+an+intracellular+bacterial+community+pathway+in+Klebsiella+pneumoniae+urinary+tract+infection+and+the+effects+of+FimK+on+type+1+pilus+expression.">Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression.</a> Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).</li><li>Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+bacterial+communities+in+human+urinary+tract+infection.">Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection.</a> PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).</li><li>Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+efficacy+of+fulguration+of+trigonitis+for+recurrent+urinary+tract+infections+in+women.">Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women.</a> Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).</li><li>De Nisco, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Detection+of+Tissue-Resident+Bacteria+and+Chronic+Inflammation+in+the+Bladder+Wall+of+Postmenopausal+Women+with+Recurrent+Urinary+Tract+Infection.">Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection.</a> Journal of Molecular Biology. , (2019).</li><li>Amann, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+16S+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+with+flow+cytometry+for+analyzing+mixed+microbial+populations.">Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).</li><li>Vaishnava, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+lectin+RegIIIgamma+promotes+the+spatial+segregation+of+microbiota+and+host+in+the+intestine.">The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine.</a> Science. 334 (6053), 255-258 (2011).</li><li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers:+new+features+2016.">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).</li><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications.">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li><li>Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+uropathogenic+Escherichia+coli+persistence+and+eradication+from+the+urinary+tract.">Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).</li><li>Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+yeast+by+fluorescence+in+situ+hybridisation+from+broth+and+blood+cultures.">Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures.</a> Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning.">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+black+B+reduces+autofluorescence+in+murine+renal+tissue.">Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).</li><li>Ludwig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARB:+a+software+environment+for+sequence+data.">ARB: a software environment for sequence data.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).</li><li>Jaziri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhylOPDb:+a+16S+rRNA+oligonucleotide+probe+database+for+prokaryotic+identification.">PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification.</a> Database (Oxford). , (2014).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Здесь мы описываем протокол для обнаружения тканей связанных бактерий в биопсии мочевого пузыря человека 16S rRNA FlSH. Этот протокол может быть легко адаптирован для биопсии взяты из других тканей, таких как желудочно-кишечного тракта или кожи, и может быть распространен на ткани, собранные из различных организмов млекопитающих модели. Описанный здесь протокол также может быть адаптирован для использования нескольких фиксацийи (например, формалин, этанол, метакарн) и методов подготовки тканей (например, парафин или встроенная посевная, и криоконсервированные ткани). Двойной маркировкой универсальный зонд 16S rRNA позволяет объективное обнаружение всех бактериальных видов, присутствующих в ткани и может обеспечить ценную информацию о том, как патогенные микроорганизмы и микробиота пространственно взаимодействуют с слизистыми поверхностями при болезни и здоровой Государств. Используя такие ресурсы, как probeBase, PhylOPDb или инструмент PROBE-DESIGN программного пакета ARB для выбора или проектирования видов или родов, специфических 16S или 23S rRNA зондов, этот протокол может быть адаптирован для обнаружения конкретных видов бактерий или родов в пределах ткани15,21,22. Важным направлением для этого метода является мультиплексирование с использованием видов или родов конкретных зондов помечены различными, дискретные флюорофоры для оценки микробного разнообразия в слизистой оболочке мочевого пузыря.
Основным ограничением этого метода для использования на человеческих образцах является наличие биопсии ткани. Для получения биопсии требуется одобрение Институционального совета по обзору и информированное согласие пациента, и для оптимального сбора образцов и доступа к метаданным пациента необходимо прямое сотрудничество с врачом, выполняющим эту процедуру. Процедура CEFT сама разрушает эпителий мочевого пузыря, поэтому мы смогли оправдать биопсию этих областей перед процедурой. Дым капот или надлежащим образом оборудованы биобезопасности шкаф требуется для этого протокола из-за использования токсичных ксиленов в шаге депарафинизации и необходимость поддержания стерильной среды на протяжении всей процедуры. Флуоресцентный микроскоп, предпочтительно confocal, с 63x или 100x объективных и соответствующих наборов фильтров для визуализации Hoechst, Alexa-555, и Alexa-488 требуется для этого протокола. Репрезентативные результаты, изображенные на рисунке 1, были изображены с помощью лазерного сканирования конфокального микроскопа. Подобные лазерные сканирующие микроскопы должны создавать сопоставимые изображения. Этот протокол ограничен своей способностью обнаруживать только связанные с тканями бактерии, а не, например, грибы. Зонды конкретных грибковых 18S или 28S rRNA должны быть использованы для выявления грибковых патогенов в ткани18.
Критические шаги к этому протоколу включают поддержание стерильной среды на протяжении всей процедуры и обеспечение того, чтобы ткань не высохла между гибридизацией и этапами окрашивания. Если ткань высыхает во время процедуры, сигнал может быть смочен или ткань может упасть с горки во время стирки шага. Также важно всегда использовать два серийных раздела для этого протокола - один для зонда 16S rRNA и один для зонда скремблирования. Без этого контроля может быть очень трудно различить ложные срабатывания, а полученные данные могут быть бесполезными или информативными. Если этот протокол адаптируется для использования с зондом, кроме универсального зонда 16S rRNA, необходимо позаботиться о том, чтобы выбрать соответствующую температуру гибридизации, примерно на 5 градусов ниже прогнозируемой температуры плавления зонда. Для поддержания интенсивности сигнала, ткань не должна подвергаться воздействию света в течение длительных периодов времени после того, как зонд был добавлен и не должны быть переэкспонированы во время микроскопии. Наконец, во время микроскопии те же настройки для канала, соответствующие флюорофору, спряженному с зондом FISH, должны быть согласованы между экспериментальным (16S rRNA зонд) и контролем (скремб-зонд) слайдами. Визуализация пространственной связи бактерий в слизистых поверхностях тканей, полученных из пациента, имеет решающее значение для понимания и построения клинически значимых гипотез о взаимодействии хозяина-патогена, лежащих в основе инфекционных заболеваний.

Мочевые тракты, состоящие из уретры, мочевого пузыря, мочеточников и почек постоянно подвергаются воздействию бактерий, которые составляют микробиом мочевыводящих путей, а также вторжение уропатогенов, как уропатогенный кишечной палочки (UPEC), из желудочно-кишечного тракта 1,2. Слой гидратасной слизи, состоящий из гликозаминогликанов и непроницаемого налета гликозилатированных уроплакиновых белков, выраженных на поверхности поверхностных клеток, образует барьер, который регулярно защищает эпителий мочевого пузыря от вторжения адептов бактерии3,4. Во время инфекции мочевыводящих путей (UTI), эти барьеры нарушаются или разрушаются, облегчая привязанность к эпителию мочевого пузыря уропатогенными бактериями5,6. Работа в моделях мурин показала, что многие уропатогенные бактерии, включая UPEC, Klebsiella pneumoniaeи Enterococcus faecalis могут образовывать репликационные внутриклеточные сообщества (МКК) в цитоплазме поверхностных клеток и тихие внутриклеточные резервуары (ЗР) в переходных эпителиальных клетках7,8,9. Хотя UPEC был определен в сарае эпителиальных клеток от человека UTI пациентов, взаимодействие уропатогенов с слизистой оболочки мочевого пузыря у людей ранее не были визуализированы10.
Мы адаптировали общую технику, флуоресценцию на месте гибридизации (FISH), для обнаружения бактерий в слизистой оболочке биопсии мочевого пузыря, полученных от пациентов в постменопаузе, проходящих цистоскопию с электрофулгуляцией тригонита (CEFT) для передовых управление антибиотико-огнеупорной рецидивирующей UTI11. Используя универсальный зонд для 16S rRNA, мы смогли объективно обнаружить бактериальные виды, связанные с слизистой оболочки мочевого пузыря рецидивирующих пациентов UTI и определить их положение в стенке мочевого пузыря12. Универсальный нуклеотидный зонд 16S rRNA ранее был разработан для целевой области бактериальной 16S rRNA13,которая соответствует позициям 388-355 из E. coli 16s rRNA. 16S rRNA и карабкаться зонд последовательности были ранее проверены и опубликованы для использования в желудочно-кишечном тракте мыши14,15. Последовательности и свойства зондов описаны в таблице 1. Важно использовать два последовательных раздела в этом протоколе, один для зонда 16S rRNA и один для зонда схватки, чтобы иметь возможность различать истинный и фоновый сигнал, как эпителий мочевого пузыря, коллагена и эластина экспонат автофлюоресценции16 . В этом протоколе, 16S rRNA и карабкаться зонды были разработаны с флуоресцентными Alexa Fluor 488 этикетки на 3' и 5 ' termini через N-hydroxysuccinimide (NHS) эфир ные звенья для увеличения флуоресцентного сигнала.
Хотя этот протокол был разработан для использования на секциях биопсии мочевого пузыря человека, он может быть легко адаптирован для использования на парафин-встроенных разделов из любой ткани, где бактерии, как полагают, проживают. В отличие от экспериментов иммуногистохимии, нацеленных на конкретные антигены (например, липополисахарид) на бактериальной поверхности, этот метод не требует предварительного знания антигенов, выраженных бактериями, связанными с тканями10,17 . Использование универсального зонда 16S rRNA позволяет объективное обнаружение всех видов бактерий в образце, но не позволяет определить их личность. Для определения выявленных бактерий, видов или рода конкретных 16S или 23S rRNA зонды должны быть использованы. Этот протокол также не будет обнаруживать грибковые патогены, такие как Candida albicans, связанные с тканью хозяина. Для обнаружения грибковых патогенов необходимо использовать 28С или 18S rRNA зонды18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34055</td>
			<td>Staining Actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>W32464</td>
			<td>Staining Mucin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-07</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M900-12W</td>
			<td>Deparaffinization/washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-224</td>
			<td>Rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>TE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H21492</td>
			<td>Staining Nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic marker</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Hydrophobic barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersol 518 F</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-624-66A</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TJ274997</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>Hybridization buffer/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75486-756</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>TE/Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-754-29</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization

Визуализация взаимодействия бактерий с слизистыми поверхностями и тканями-хозяинами может дать ценную информацию о механизмах патогенеза. В то время как визуализация бактериальных патогенов в животных моделях инфекции может опираться на бактериальные штаммы, разработанные для выражения флуоресцентных белков, таких как GFP, визуализация бактерий в слизистой оболочке биопсии или тканей, полученных от пациентов, требует беспристрастный метод. Здесь мы описываем эффективный метод обнаружения связанных с тканями бактерий в секциях биопсии человека. Этот метод использует флуоресцентные на месте гибридизации (FISH) с флуоресцентно помечены универсальный олигонуклеотидный зонд для 16S rRNA для обозначения тканей связанных бактерий в разделе биопсии мочевого пузыря, приобретенных у пациентов, страдающих от периодических инфекции мочевыводящих путей. С помощью универсального зонда 16S rRNA бактерии могут быть обнаружены без предварительного знания видов, родов или биохимических характеристик, таких как липополисахарид (LPS), которые потребуются для обнаружения с помощью иммунофлюоресценции экспериментов. Мы описываем полный протокол для 16S rRNA FISH от биопсии фиксации до визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Этот протокол может быть адаптирован для использования практически в любом типе тканей и представляет собой мощный инструмент для объективной визуализации клинически значимых взаимодействий бактериального хозяина в тканях пациента. Кроме того, используя виды или гены конкретных зондов, этот протокол может быть адаптирован для обнаружения конкретных бактериальных патогенов в тканях пациента.

Протокол был оптимизирован для объективного обнаружения бактерий, связанных с слизистой оболочкой мочевого пузыря в парафин-встроенных секций биопсии мочевого пузыря. На рисунке 1 изображены репрезентативные конфокальные микрографы из эксперимента с использованием этого протокола на участках биопсии мочевого пузыря, полученных от женщин с рецидивирующей инфекцией мочевыводящих путей. Два серийных раздела были гибридизированы либо с универсальными 16S rRNA (верхние панели) или карабкаться (нижние панели) зондов. Изображения из той же области ткани были приняты и бактерии (зеленый) четко видны в ткани, гибридизированной с 16S rRNA зондов, а не с карабкаться зонда. Рисунок 2 представляет собой ложноположительный результат. Сигнал, соответствующий аутофлуоресцентному коллагену или эластину, обнаруживается в 405 и 488 каналах как в 16S rRNA, так и в секциях биопсии, связанных с зондом, подчеркивая важность всегда использования контроля скрембл-зонда.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Зонд</td>
			<td>Последовательности</td>
			<td>Тм</td>
			<td>Флюрофор</td>
			<td>Связь</td>
		</tr>
<tr>
<td>Универсальный 16S rRNA</td>
			<td>5'-GCTGCCTCCC Гастаггагт-3'</td>
			<td>54.9</td>
			<td>Алекса-488 (5' и 3')</td>
			<td>ГСЗ Эстер</td>
		</tr>
<tr>
<td>Схватка</td>
			<td>5'-АКТЧТАКГ GAGGCAGC-3'</td>
			<td>Na</td>
			<td>Алекса-488 (5' и 3')</td>
			<td>ГСЗ Эстер</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Последовательности и характеристики зонда FISH. Тм указывает на температуру плавления и ГСЗ является аббревиацией для N-гидроксисуччинимид.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig1.jpg"> Рисунок 1: Представитель конфокальных микрографов FISH универсального 16S rRNA и карабкаться зонд в биопсии мочевого пузыря человека. Актин и Муцин помечены красным цветом, клеточные ядра помечены синим, а бактерии - зеленым. Ткань связанных бактерий обнаруживаются только с 16SrRNA зонд, а не схватка. Изображения, сделанные при 63x увеличении. Шкала бар 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig2.jpg"> Рисунок 2: Представитель конфокальных микрографов ложно-положительной зеленой аутуфлуоресценции в биопсии мочевого пузыря человека. Актин и муцин помечены красным цветом, клеточные ядра помечены синим цветом, а бактерии и аутофлуоресцентные компоненты внеклеточной матрицы (например, коллаген и эластин) зеленые. Зеленая флуоресценция наблюдается как с 16S rRNA и карабкаться зондов, указывающих на ложноположительный результат. Изображения принимаются при 63x увеличении. Шкала бар 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Этот протокол предназначен для объективного обнаружения связанных с тканями бактерий в биопсии пациента 16S rRNA на месте гибридизации и конфокальной микроскопии.

Обнаружение бактерий, резидентов тканей в биопсии мочевого пузыря 16S rRNA Флуоресценция В ситу гибридизации

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Здесь мы представляем надежный протокол для обнаружения бактерий в биопсии ткани мочевого пузыря, который имеет широкое применение для многих типов тканей, где бактерии, как подозреваются, присутствуют. Основным преимуществом этой техники является то, что она непредвзята. Это позволяет исследователю обнаруживать бактерии в тканях без априори знания о том, какие бактериальные виды присутствуют.Этот метод может помочь определить, если бактерии вторглись стенки мочевого пузыря женщин с рецидивирующей инфекции мочевыводящих путей и информировать терапевтический выбор, такие как выбор тканевых проникающих антибиотиков. Хотя предназначен для тканей мочевого пузыря, этот метод может быть широко применен к другим тканям с резидентов бактериальных популяций с минимальной оптимизацией. Лица, которые являются новыми для этой техники могут бороться с обложки размещения и изображения.Сосредоточьтесь на оптимизации размещения крышки, чтобы уменьшить пузырьки и практики изображения на не-драгоценных образцов. Помочь продемонстрировать эту процедуру будет Яшкаран Гаджви, аспирант моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, очистить пустой капот дыма или надлежащим образом установлен биобезопасности шкаф с 70%этанола.Подготовь все необходимые буферы и реагенты, изложенные в текстовом протоколе. Затем очистите пять банок Coplin с 70% этанола и дайте банкам высохнуть. Когда банки высохнут, обозначить их, как показано здесь, и заполнить их 100 миллилитров соответствующего решения.В капоте дыма поместите два слайда на биопсию в вертикальную стойку слайда. Поместите вертикальную стойку слайда в банку Xylenes 1 Coplin в течение 10 минут. После этого, удалить слайд стойку из банки и пятно дно на бумажное полотенце, чтобы удалить избыток ксилеонов.Поместите стойку в банку Xylenes 2 в течение 10 минут. А затем регидратировать де-парафинизированных секций тканей в последовательных этанола моет в течение 10 минут каждый. Когда моет полны, пятно нижней части слайд стойки на бумажные полотенца, чтобы удалить избыток этанола и поместить стойку в банку Coplin, содержащий 100 миллилитров фильтра стерилизованной, двойной дистиллированной воды в течение 10 минут.Во время этой стирки разбавьте зонды до 10 наномолярных в буфере гибридизации, чтобы создать окрашивающий раствор, убедившись, что приготовьте 150 микролитров раствора окрашивания на слайд. Подготовьте увлажняющую камеру для каждого зонда, добавив пропитанную, скомканную деликатную протрите задачу и стерильную воду в резервуар коробки чаевых P1000. Поместите картридж держателя наконечника на вершине, как это, где слайды будут сидеть.Когда окончательная стирка завершена, удалите слайд со слайда стойку и поместите их на свежее бумажное полотенце, ткани вверх. Используйте деликатную задачу протрите, чтобы высушить слайд, будучи осторожным, чтобы только осторожно мазок рядом, но не на разделе биопсии, чтобы фитиль от воды. Используя гидрофобную ручку, нарисуйте границу вокруг секции биопсии и поместите сторону слайд-ткани в увлажняющую камеру.Затем поместите увлажняющую камеру в инкубатор, установленный до 50 градусов по Цельсию. Пипетт между 50 и 150 микролитров окрашивания раствора непосредственно на верхней части ткани, так что прямоугольник, сделанный гидрофобной границы вокруг ткани заполнены и закрыть коробку мягко. Инкубировать ночь при 50 градусах по Цельсию в темноте.Если инкубатор имеет окно, накройте его остроумием алюминиевой фольги для создания темной среды. На следующее утро, удалить слайды из увлажняющих камер и быстро фитиль от любого оставшегося решения гибридизации с деликатной задачей протрите. Затем поместите стороны в вертикальную стойку окрашивания.Поместите окрашивание стойки в алюминиевую фольгу завернутый Coplin банку, содержащую 100 миллилитров предварительно разогретого буфера мытья в течение 10 минут. Повторите этот шаг мытья еще два раза со свежим буфером мытья в новых банках Coplin. Во время этих шагов мытья, подготовить контр-пятно путем разбавления фондового раствора Hoechst 33342 в буфере мытья, в соотношении от одного до 1000.В ту же трубку добавьте агглютинин зародыша пшеницы Alexa-555 к окончательной концентрации в пять микрограмм на миллилитр и фаллоидин Alexa-555 до конечной концентрации 33 наномолярных. Хранить в темноте до готовности к использованию. Когда окончательная стирка завершена, удалите слайды из банки Coplin и аккуратно фитиль от любого избыточного буфера мыть с деликатной задачей протрите.Поместите слайды ткани стороне вверх на бумажное полотенце и добавить от 50 до 150 микролитров контр-пятно непосредственно на верхней части ткани, так что гидрофобные границы заполнены, но не переполнены. Обложка до четырех слайдов с криокабикатом и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого поместите слайды обратно в окрашивание стойки и мыть их в два раза больше в Coplin банки, содержащие свежий буфер мытья, с каждой стирки продолжительностью 10 минут.Затем тщательно высушите горки и поместите их ткани стороне вверх на бумажное полотенце под криокамбокс-топ. Сожмите одну каплю монтажных средств массовой информации непосредственно на верхней части ткани и аккуратно поместите соответствующий размер крышки на вершине. Аккуратно нажмите любые пузыри и позволить слайды coverslip вылечить на ночь в темноте.На следующий день, печать края coverslips на слайд с легким слоем ясно лака для ногтей и дайте высохнуть в темноте в течение 10 минут, прежде чем хранить их в темноте при четырех градусах по Цельсию. Когда вы будете готовы к изображению окрашенных биопсий, включите конфокальный микроскоп и программное обеспечение, связанное с микроскопом. Начните с положительного слайда FISH и переключитесь в режим визуализации компьютера.Выберите каналы для 405, 488 и 555. Установите пинхол с помощью самого длинного волнового канала, который в данном случае составляет 555. Затем найдите текущую фокусную плоскость для визуализации помеченных бактерий в канале 488.Без изменения фокусной плоскости установите усиление, лазерную мощность и компенсируйте для каждого канала так, чтобы сигнал не был насыщен и фон не был перекорректирован. Приобрети изображение во всех трех каналах. В этом исследовании, ткани связанных бактерий обнаруживаются в биопсии мочевого пузыря человека 16S rRNA FISH.Этот протокол был оптимизирован для объективного обнаружения бактерий, связанных с слизистой оболочкой мочевого пузыря в парафин-встроенных участках биопсии мочевого пузыря. Здесь показаны репрезентативные конфокальные микрографы из эксперимента с использованием этого протокола на участках биопсии мочевого пузыря, полученных от женщин с рецидивирующими инфекциями мочевыводящих путей. Две серийные секции гибридизированы либо с универсальной 16S rRNA или карабкаться зондов.Изображения ар взяты из той же области ткани и бактерий чисто видны в ткани гибридизированы с 16S rRNA зондов, но не с карабкаться зонд. Возможны также ложные положительные результаты. В этом репрезентативном ложноположительном сигнале, соответствующем аутофторесцентного коллагена или эластина обнаруживается в 405 и 488 каналах как в 16S rRNA, так и в гибридизированных секциях биопсии, подчеркивая важность постоянного использования контроля зонда схватки.Чтобы предотвратить отбеливание фотографий, свести к минимуму воздействие ткани на свет после применения зондов. Хотя этот метод позволяет объективно обнаруживать бактерии в тканях человека, он не дает видам конкретной информации. Мультиплекс-FISH с таксономией конкретных зондов могут быть использованы для идентификации рода или вида настоящее время.До того, как этот метод был разработан, ранее не было продемонстрировано, что бактерии могут вторгнуться в стенку мочевого пузыря человека рецидивирующих пациентов UTI. В настоящее время мы используем род и виды конкретных зондов, чтобы определить, какие бактериальные виды присутствуют. Xylenes должны быть использованы в дым капот из-за их токсичности.Следует позаботиться о том, чтобы не заглянуть непосредственно в лазер во время визуализации. Лазер должен быть выключен при позиционировании слайда под целью.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Флуоресценция На месте Гибридизации (FISH) протокола в человеческой сперме

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Обнаружение вирусной РНК с помощью флуоресцентного<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Анализ одноклеточных транскрипции гена РНК-флуоресцентный<em&gt; В Situ</em&gt; Гибридизация (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Простой метод ДНК флуоресценции<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация, чтобы раздавил хромосом

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Эффективное нуклеиновые кислоты Добыча и 16S рРНК генов Секвенирование для Бактериальные сообщества Характеристика

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Наблюдение и Количественная теломер и повторяющихся последовательностей с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация (FISH) с зондами PNA<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Метод для маркировки стенограммы в клетках отдельных кишечная палочка для одной молекулы флуоресценции в Situ гибридизация экспериментов

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Руководствуясь протокол для фекальных микробиологических характеристик путем Sequencing 16S рРНК ампликонами

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Характеристика микрофлора клеща, следующего поколения 16S рРНК ампликон последовательности

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...