Name: detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2019-10-18T15:00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Kim Orth y Marcela de Souza Santos por el asesoramiento protocolal y a Amanda Arute por su apoyo técnico. Este trabajo fue parcialmente apoyado por la Cátedra Cecil H. e Ida Green en Ciencias de la Biología de Sistemas, en poder de K.P.

El protocolo de estudio fue aprobado y seguido por las directrices de los Comités Institucionales de Bioseguridad y Seguridad Química de UT Dallas y UT Southwestern Medical Center. El uso de biopsias de sujetos humanos en este protocolo fue aprobado por y seguido las directrices de las Juntas de Revisión Institucional de la UT Dallas y el Ut Southwestern Medical Center. Todas las personas involucradas con la recolección y procesamiento de biopsias tienen capacitación actual en protección de sujetos humanos (HSP) y HIPPA.
1. Preparación de tejidos para la fijación y la incrustación de parafina
NOTA: Se tomaron biopsias de mujeres consentidas sometidas a cistoscopia con electrofulguración de trigonitis para el manejo avanzado de la infección recurrente del tracto urinario (rTUTI). rUTI se define como 3 ITU en un período de 12 meses. La recolección de biopsias se realizó en el quirófano mientras el paciente estaba bajo anestesia después de obtener el consentimiento informado del paciente según el protocolo UTSW IRB STU 082010-016. Todas las muestras fueron codificadas y desidentificadas antes de la experimentación.
<ol><li>Obtener una biopsia de taza fría (1 mm3) de la vejiga trigón con fórceps urológicos a través de un cistoscopio flexible y colocar inmediatamente en un criovial estéril de 2 ml que contiene 1,5 ml de paraformaldehído (PFA) 4% v/v preparado en 1ss salino tampoteado fosfato estéril (PBS). NOTA: 4% PFA en 1x PBS se puede hacer por adelantado y almacenar a -20 oC hasta que sea necesario.</li>
	<li>Fijar la biopsia durante 6 h a temperatura ambiente o para 16-24 h a 4oC. NOTA: La duración de la fijación debe calcularse en función del tamaño de la muestra de tejido y se debe evitar la sobrefijación. No se recomienda utilizar glutaraldehído como un fijador, ya que introduce autofluorescencia.</li>
	<li>En una campana esterilizada o gabinete de bioseguridad, retire el fijador pipeteando y sustitúyalo por 1,5 ml de PBS estéril 1x. Mantener las muestras a 4 oC durante la noche o realizar inmediatamente el procesamiento de tejidos y la incrustación de parafina19.</li>
	<li>Utilice un microtome esterilizado para seccionar bloques de tejido de 5 m de espesor y adhiera secciones de tejido de parafina a los portaobjetos de microscopio de vidrio cargado. Se requerirá un mínimo de dos diapositivas por biopsia para el protocolo 16S rRNA FISH. NOTA: El tejido de la biopsia debe estar dispuesto transversalmente en relación con el plano de corte para asegurar la visualización de las capas uroteliales en todas las secciones. También debe tenerse en cuenta que el espesor de la sección debe optimizarse para la detección de la comunidad bacteriana. Pueden ser necesarias secciones más delgadas o muestreo de varias secciones en serie en el caso de infecciones en las que las bacterias residentes en tejidos son extremadamente escasas (por ejemplo, <1 bacteria residente en el tejido por cada 1.000 células de mamíferos).</li>
</ol>2. Hibridación In Situ de Fluorescencia con Sondas Universales 16S rRNA
NOTA: Se requieren dos diapositivas por biopsia. Se necesita una diapositiva para la sonda universal 16S rRNA y una diapositiva para una sonda de control con una secuencia codificada. Esto es importante para distinguir la señal verdadera de la señal de fondo durante la microscopía, ya que el epitelio de la vejiga es autofluorescente en múltiples canales. Además de la sonda de scramble, el bloqueo con 0.1% Sudán Negro B antes del montaje puede reducir la autofluorescencia de fondo inherente al tejido20.
<ol><li>Preparación de reactivos y campana de humos
	<ol>
<li>Limpie una campana de humo vacía (o un gabinete de bioseguridad adecuadamente equipado) con un 70% de etanol.</li>
		<li>Preparar el tampón de hibridación compuesto por cloruro de sodio de 0,9 M (NaCl), Tris-HCl de 20 mM (pH 7,2), 0,1% de dodecilo sulfato de dodecilo sódico (SDS) en 10 ml de agua filtrada estéril. NOTA: El agua filtrada estéril se puede preparar pasando el agua destilada autoclave a través de un filtro de 0,22 m. El búfer de hibridación se puede almacenar a temperatura ambiente, pero el SDS puede precipitarse de la solución. Si la SDS se precipita, caliente la solución en un baño de agua de 50 oC antes de su uso.</li>
		<li>Preparar al menos 100 ml cada uno de 95% y 90% de etanol en agua filtrada estérilmente en botellas lavadas y autoclavedas.</li>
		<li>Disolver sondas liofilizadas fluorescentes en Tris-HCl de 10 mM (pH 8.0) y 1 mM de tampón de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) (TE) preparados en agua libre de nucleasas esterilizada por filtro a una concentración final de 100 m. Prepare una dilución de 1 M en el búfer de TE para su uso en este protocolo. Almacene tanto el material concentrado de 100 m como las sondas reconstituidas de 1 m de material a -20 oC protegidas de la luz. NOTA: No disuelva las sondas etiquetadas fluorescentemente en agua. Se requiere tampón para evitar la hidrólisis del enlace éster NHS conjugando el fluoróforo a la sonda de nucleótido.</li>
		<li>Limpiar cinco tarros de Coplin con 70% de etanol, dejar secar, etiquetar de la siguiente manera: xilenos I, xilenos II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH2O, y llenar con 100 ml de la solución adecuada. Esto ayudará a evitar confusiones en pasos posteriores.</li>
	</ol></li>
	<li>Desparafinación y rehidratación de tejidos
	<ol>
<li>En la capucha, coloque dos diapositivas por biopsia en un portaobjetos vertical.</li>
		<li>Coloque una rejilla deslizante vertical en el frasco de xilenos I Coplin (que contiene 100 ml de xilenos) durante 10 min.</li>
		<li>Retire el portaobjetos de xylenes I y mancha la parte inferior de una toalla de papel para eliminar el exceso de xilenos. Colocar en el frasco de xylenes II Coplin durante 10 min. NOTA: Nunca trabaje con xilenos fuera de una campana de humo certificada.</li>
		<li>Rehidratar secciones de tejido desparafinado en lavados sucesivos de etanol (95% y 90%) durante 10 minutos cada uno en los frascos de Coplin etiquetados respectivamente. NOTA: Durante esta etapa, el búfer de hibridación caliente a 50-56 oC en un baño de agua</li>
		<li>Retire la portaobjetos del lavado de etanol al 90%, coloque la parte inferior de las toallas de papel para eliminar el exceso de etanol y colóquela en el frasco ddH2O Coplin que contiene 100 ml de ddH2O esterilizado por filtro durante 10 minutos.</li>
		<li>Mientras espera el lavado ddH2O, diluya las sondas a 10 nM en el búfer de hibridación para crear la solución de tinción. Preparar 150 sl de solución de tinción por diapositiva. NOTA: Proteja la solución de tinción de la luz envolviendo los tubos en papel de aluminio y almacenándolos en un cajón. Cuando trabaje con sondas etiquetadas fluorescentes en la mesa de trabajo, considere apagar las luces superiores cuando sea posible. Las sondas diluidas en el búfer de hibridación no deben reutilizarse.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridación y contramanchación
	<ol><li>Prepare una cámara humidificadora para cada sonda colocando Kimwipe empapada y arrugada y agua estéril en el depósito de una caja de puntas P1000. Coloque el cartucho del soporte de la punta en la parte superior - aquí es donde se sentarán las diapositivas. NOTA: Es importante utilizar una cámara humidificadora para evitar que las secciones de la biopsia se sequen durante la hibridación. Cabe señalar que las cámaras humidificadores disponibles comercialmente están diseñadas para mantener una atmósfera estable y húmeda. Sin embargo, la técnica detallada aquí controla suficientemente la humedad a un costo sustancialmente menor.</li>
		<li>Retire las diapositivas de la portaobjetos y colóquelas en una toalla de papel nueva (de lado tisular hacia arriba). Usa un Kimwipe para secar el portaobjetos. Tenga cuidado de acercarse suavemente (no en) la sección de la biopsia para eliminar el agua. Con una pluma hidrófoba, dibuje un borde alrededor de la sección de la biopsia y coloque el tejido deslizante hacia arriba en la cámara humidificadora. NOTA: Trabaje rápidamente para que los tejidos no se sequen antes de la hibridación.</li>
		<li>Colocar la cámara humidificadora en una incubadora a 50oC. Pipetear 50-150 l de la solución de tinción directamente en la parte superior del tejido para que se llene el rectángulo hecho por el borde hidrófobo alrededor del tejido. Tenga cuidado de no añadir demasiada solución para desbordar el borde hidrófobo. Cierre suavemente la caja.</li>
		<li>Incubar durante la noche (16 h) a 50oC en la oscuridad. Si la incubadora tiene una ventana, cúbrala con papel de aluminio para crear un ambiente oscuro. NOTA: Se requiere una temperatura de hibridación por debajo de la temperatura de fusión de la sonda FISH para una señal confiable. 50 oC es la temperatura óptima para la sonda universal 16S rRNA, pero puede no ser óptima para otras sondas.</li>
		<li>A la mañana siguiente, prepare al menos 500 ml de tampón de lavado compuesto por 0,9 M de NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) en ddH2O y filtre en un frasco estéril con un filtro de vacío. Caliente a 50-56 oC en un baño de agua.</li>
		<li>Retire los portaobjetos de las cámaras humidificantes y retire cuidadosamente cualquier solución de hibridación restante con un Kimwipe. Coloque las diapositivas en un estante de tinción vertical.</li>
		<li>Coloque el estante de tinción en un frasco de Coplin opaco que contenga 100 ml de tampón de lavado precalentado durante 10 minutos. Si los frascos de Coplin no son opacos (por ejemplo, vidrio), colóquelos en la oscuridad durante los pasos de incubación, tal vez debajo de una caja o en un cajón.</li>
		<li>Repita el paso de lavado dos veces con el tampón de lavado fresco en los nuevos frascos de Coplin.</li>
		<li>Durante los pasos de lavado, prepare la contramancha diluyendo una solución de stock de 100 g/ml de Hoechst 33342 1:1,000 en tampón de lavado. Al mismo tubo, agregue Alexa-555 aglutinina germinal de trigo (WGA) a una concentración final de 5 g/ml y Alexa-555 Phalloidin a una concentración final de 33 nM. Conservar en la oscuridad hasta que esté listo para su uso. NOTA: Hoechst, Alexa-555 WGA y Alexa-555 Phalloidin etiquetan ADN, mucina/uroplakins y actina, respectivamente y pueden almacenarse a largo plazo en la oscuridad según las instrucciones del fabricante. Las etiquetas fluorescentes utilizadas para sondas y contramanchas se pueden personalizar para los conjuntos de filtros disponibles para el microscopio que se utilizará.</li>
		<li>Retire los portaobjetos del último lavado y retire suavemente el exceso de tampón de lavado con un Kimwipe. Coloque las diapositivas de tejido hacia arriba sobre una toalla de papel y agregue 50-150 l de contramancha directamente sobre el tejido para que el borde hidrófobo esté lleno, pero no desbordado. Cubra hasta cuatro diapositivas con una criocaja-top e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Vuelva a colocar los lados en el estante de tinción y lávelos dos veces más en frascos de Coplin con tampón de lavado fresco, durante 10 minutos cada uno.</li>
		<li>Seque bien los portaobjetos después del último lavado y colóquelos en una toalla de papel debajo de una criocaja. Apriete una gota de soporte de montaje directamente en la parte superior del tejido. Coloque suavemente un cubreobjetos del tamaño adecuado (dependerá del tamaño de la biopsia) en la parte superior. Presione suavemente las burbujas, ya que interferirán con las imágenes y permitirán que las diapositivas resbaladizas se curen durante la noche en la oscuridad.</li>
		<li>Al día siguiente, sellar los bordes de la cubierta a la diapositiva con una capa ligera de esmalte de uñas transparente. Dejar secar durante 10 minutos en la oscuridad y luego almacenar en la oscuridad a 4 oC para microscopía confocal.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Visualización de 16S rRNA FISH por Microscopía Confocal
NOTA: Para este protocolo, los mejores resultados se logran con un microscopio confocal de escaneo láser con objetivos de 63x y 100x. Se requieren conjuntos de filtros adecuados para la visualización de la fluorescencia hoechst, Alexa-488 y Alexa-555. Sin embargo, la microscopía fluorescente estándar se puede utilizar si un microscopio confocal no está disponible. Este protocolo es para un microscopio confocal de escaneo láser.
<ol><li>Encienda el microscopio confocal y el software informático asociado con el microscopio según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Cargue la diapositiva y visualice con el objetivo 10x en el canal azul (DAPI/Hoechst). Concéntrese cuidadosamente hasta que los núcleos estén visibles.</li>
	<li>Una vez enfocado, cambie el objetivo a un aumento alto (63x o 100x). Agregue aceite encima del resbalón de la cubierta. Reenfocar con el nuevo objetivo, asegurándose de que la lente objetivo entra en contacto con el aceite mientras se enfoca. NOTA: Utilice solo enfoque fino con un aumento alto (63x o 100x). El aceite sólo debe utilizarse para un objetivo de petróleo.</li>
	<li>Evalúe rápidamente cada diapositiva a través de la pieza ocular en el canal verde (eGFP/Alexa-488) para determinar qué diapositivas son DA positivas y cuáles son FISH negativas. NOTA: Es mejor si esta evaluación/puntuación inicial es hecha ciega por un individuo separado para reducir el sesgo experimental.</li>
	<li>Para crear una imagen de las biopsias manchadas, comience con una diapositiva positiva FISH y cambie al modo de visualización del ordenador. Seleccione los canales 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Ajuste el agujero usando el canal de longitud de onda más largo, en este caso 555. Encuentre el plano focal correcto para la visualización de bacterias etiquetadas en el canal 488. Sin cambiar el plano focal, establezca la ganancia, la potencia del láser y el desplazamiento para cada canal de modo que la señal no esté saturada y el fondo no se corrija en exceso. Adquiere la imagen en los tres canales. NOTA: Utilice la misma configuración para el canal 488 para crear imágenes de cada diapositiva de un experimento. La potencia láser puede requerir un ajuste en los canales 405 y 555 si el plano focal óptimo para la visualización bacteriana cambia entre campos.</li>
	<li>Repita en campos adicionales hasta adquirir imágenes de toda la superficie epitelial. NOTA: Es posible que tenga que cambiar ligeramente el plano focal para visualizar bacterias etiquetadas en diferentes campos, pero nunca cambie la ganancia, la potencia del láser o el desplazamiento para el canal 488 entre campos. Si se trabaja en un microscopio confocal, puede ser informativo capturar una pila Z para que se pueda analizar la localización tridimensional de las bacterias dentro del tejido.</li>
	<li>Procesar imágenes y cuantificar bacterias etiquetadas dentro o asociadas con el tejido usando ImageJ o software similar. Se recomienda un procesamiento mínimo de las imágenes (por ejemplo, dividir/fusionar canales y convertir en archivos de imagen), aunque se puede realizar la corrección de fondo si es necesario. Todas las correcciones u otras alteraciones deben permanecer consistentes entre las imágenes.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un protocolo para la detección de bacterias asociadas al tejido en biopsias de vejiga humana por 16S rRNA FlSH. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para biopsias tomadas de otros tejidos, como el tracto gastrointestinal o la piel, y puede extenderse a los tejidos cosechados de una variedad de organismos modelo de mamíferos. El protocolo descrito aquí también se puede adaptar para el uso de múltiples técnicas de fijación (por ejemplo, formalina, etanol, metacarn) y preparación de tejidos (por ejemplo, parafina o resina incrustada, y tejidos crioconservados). La sonda universal de doble etiqueta 16S rRNA permite la detección imparcial de todas las especies bacterianas presentes dentro del tejido y puede proporcionar información valiosa sobre cómo los patógenos y la microbiota interactúan espacialmente con las superficies mucosas en la enfermedad y saludables Estados. Utilizando recursos como probeBase, PhylOPDb o la herramienta PROBE_DESIGN del paquete de software ARB para la selección o diseño de especies o sondas rRNA 16S o 23S específicas de géneros, este protocolo se puede adaptar para la detección de especies bacterianas o géneros específicos dentro del tejido15,21,22. Una dirección futura importante para este método es la multiplexación utilizando sondas específicas de especies o géneros etiquetadas con diferentes fluoróforos discretos para la evaluación de la diversidad microbiana dentro de la mucosa de la vejiga.
La principal limitación de este método para su uso en muestras humanas es la disponibilidad de tejido biopsiado. Se requiere la aprobación de la Junta de Revisión Institucional y el consentimiento informado del paciente para obtener biopsias y la colaboración directa con el médico que realiza el procedimiento es necesaria para una óptima recolección de muestras y acceso a los metadatos del paciente. El procedimiento CEFT en sí destruye el epitelio de la vejiga por lo que pudimos justificar la biopsia de estas áreas antes del procedimiento. Se requiere una campana de humos o un gabinete de bioseguridad adecuadamente equipado para este protocolo debido al uso de xilenos tóxicos en el paso de desparafinación y la necesidad de mantener un ambiente estéril durante todo el procedimiento. Se requiere un microscopio fluorescente, preferiblemente confocal, con un objetivo de 63x o 100x y conjuntos de filtros adecuados para la visualización de Hoechst, Alexa-555 y Alexa-488 para este protocolo. Los resultados representativos representados en la Figura 1 fueron representados utilizando un microscopio confocal de escaneo láser. Los microscopios de escaneo láser similares deben producir imágenes comparables. Este protocolo está limitado por su capacidad para detectar sólo bacterias asociadas al tejido y no, por ejemplo, hongos. Las sondas específicas del ARNr fúngico 18S o 28S deben utilizarse para identificar patógenos fúngicos dentro del tejido18.
Los pasos críticos para este protocolo incluyen mantener un ambiente estéril durante todo el procedimiento y asegurar que el tejido no se seque entre los pasos de hibridación y tinción. Si el tejido se seca durante el procedimiento, la señal puede amortiguarse o el tejido puede caerse del portaobjetos durante un paso de lavado. También es fundamental utilizar siempre dos secciones seriales para este protocolo: una para la sonda rRNA 16S y otra para la sonda de scramble. Sin este control, puede ser muy difícil distinguir falsos positivos y los datos obtenidos pueden no ser útiles o informativos. Si este protocolo se está adaptando para su uso con una sonda que no sea la sonda universal 16S rRNA, se debe tener cuidado de seleccionar una temperatura de hibridación adecuada, aproximadamente 5 oC inferior a la temperatura de fusión prevista de la sonda. Para mantener la intensidad de la señal, el tejido no debe estar expuesto a la luz durante largos períodos de tiempo después de que se haya añadido la sonda y no debe estar sobreexpuesto durante la microscopía. Por último, durante la microscopía, los mismos ajustes para el canal correspondiente según el fluoróforo conjugado con la sonda FISH deben mantenerse consistentes entre las diapositivas experimentales (sonda rRNA 16S) y control (sonda de restufon). Visualizar la relación espacial de las bacterias dentro de las superficies mucosas de los tejidos derivados del paciente es fundamental para comprender y construir hipótesis clínicamente relevantes sobre las interacciones huésped-patógeno subyacentes a la enfermedad infecciosa.

El tracto urinario, que consiste en la uretra, vejiga, uréteres y riñones está constantemente expuesto a bacterias que componen el microbioma urinario, así como uropatógenos invasores, como la E. coli uropatógena (UPEC), del tracto gastrointestinal, del tracto gastrointestinal 1,2. Una capa de moco hidratado que consiste en glicosaminoglicanos y una placa impermeable de proteínas uroplakin glicosiladas expresadas en la superficie de las células superficiales forman una barrera que protege rutinariamente el epitelio de la vejiga de la invasión por adherente bacterias3,4. Durante la infección del tracto urinario (UTI), estas barreras se perturban o destruyen, facilitando la fijación y la invasión del epitelio vesical por bacterias uropatógenas5,6. El trabajo en modelos murinos ha revelado que muchas bacterias uropatógenas incluyendo UPEC, Klebsiella pneumoniae,y Enterococcus faecalis pueden formar comunidades intracelulares replicativas (IBC) dentro del citoplasma de células superficiales y reservorios intracelulares en reposo (QiR) dentro de las células epiteliales de transición7,8,9. Aunque la UPEC se ha identificado dentro de células epiteliales derramadas de pacientes con ITU humana, la interacción de uropatógenos con la mucosa de la vejiga en humanos no se había visualizado previamente10.
Adaptamos una técnica común, la hibridación in situ por fluorescencia (FISH), para detectar bacterias dentro de la mucosa de biopsias de vejiga obtenidas de pacientes posmenopáusicos sometidos a cistoscopia con electrofulguración de trigonitis (CEFT) para el avanzado gestión de la ITU11refractaria a los antibióticos. Utilizando una sonda universal para el ARNr 16S, pudimos detectar objetivamente especies bacterianas asociadas con la mucosa de la vejiga de pacientes recurrentes con ITU y determinar su posición dentro de la pared de la vejiga12. La sonda universal de nucleótido de 16S rRNA fue diseñada previamente para apuntar a una región conservada del rRNA13bacteriano 16S, que corresponde a las posiciones 388-355 del ARNm de E. coli 16s. Las secuencias de sonda 16S rRNA y scramble han sido previamente validadas y publicadas para su uso en el tracto gastrointestinal del ratón14,15. Las secuencias y propiedades de los sondeos se describen en la Tabla 1. Es esencial utilizar dos secciones secuenciales en este protocolo, una para la sonda rRNA 16S y otra para la sonda de revuelto, para poder distinguir entre señal verdadera y de fondo, ya que el epitelio de la vejiga, el colágeno y la elastina exhiben autofluorescencia16 . En este protocolo, el rRNA 16S y las sondas de scramble fueron diseñados con etiquetas fluorescentes Alexa Fluor 488 en los 3' y 5' termini a través de enlaces de éster N-hidroxisuccinimida (NHS) para aumentar la señal fluorescente.
Aunque este protocolo fue desarrollado para su uso en secciones de biopsia de vejiga humana, se puede adaptar fácilmente para su uso en secciones incrustadas en parafina de cualquier tejido donde se cree que residen bacterias. A diferencia de los experimentos de inmunohistoquímica que se dirigen a antígenos específicos (por ejemplo, lipopolisacárido) en la superficie bacteriana, este método no requiere conocimiento previo de los antígenos expresados por las bacterias asociadas al tejido10,17 . El uso de la sonda universal 16S rRNA permite la detección imparcial de todas las especies bacterianas dentro de la muestra, pero no permite determinar su identidad. Para determinar la identificación de bacterias detectadas, se deben utilizar sondas de ARNm 16S o 23S específicas de cada género. Este protocolo tampoco detectará patógenos fúngicos, como Candida albicans, asociadoscon el tejido huésped. Para la detección de patógenos fúngicos, se deben utilizar sondas de ARN rRNA28So 18S 18 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A34055</td>
			<td>Staining Actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>W32464</td>
			<td>Staining Mucin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-741-07</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M900-12W</td>
			<td>Deparaffinization/washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-224</td>
			<td>Rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>TE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H21492</td>
			<td>Staining Nucleus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic marker</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Hydrophobic barrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Immersol 518 F</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-624-66A</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TJ274997</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>Hybridization buffer/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75486-756</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>TE/Hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-754-29</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tissue-resident bacteria in bladder biopsies by 16s rrna fluorescence in situ hybridization

La visualización de la interacción de las bacterias con las superficies y tejidos de la mucosa huésped puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos de la patogénesis. Mientras que la visualización de patógenos bacterianos en modelos animales de infección puede depender de cepas bacterianas diseñadas para expresar proteínas fluorescentes como GFP, la visualización de bacterias dentro de la mucosa de biopsias o tejido obtenido de pacientes humanos requiere un método imparcial. Aquí, describimos un método eficiente para la detección de bacterias asociadas al tejido en secciones de biopsia humana. Este método utiliza hibridación fluorescente in situ (FISH) con una sonda de oligonucleótido universal etiquetado fluorescentemente para rRNA 16S para etiquetar bacterias asociadas al tejido dentro de las secciones de biopsia de vejiga adquiridas de pacientes que sufren de recurrentes infección del tracto urinario. Mediante el uso de una sonda universal de rRNA 16S, las bacterias se pueden detectar sin conocimiento previo de especies, géneros o características bioquímicas, como lipopolisacárido (LPS), que serían necesarias para la detección por experimentos de inmunofluorescencia. Describimos un protocolo completo para 16S rRNA FISH desde la fijación de la biopsia hasta la toma de imágenes mediante microscopía confocal. Este protocolo se puede adaptar para su uso en casi cualquier tipo de tejido y representa una poderosa herramienta para la visualización imparcial de interacciones bacteriano-huésped clínicamente relevantes en el tejido del paciente. Además, utilizando sondas específicas de especies o géneros, este protocolo se puede adaptar para la detección de patógenos bacterianos específicos dentro del tejido del paciente.

El protocolo se ha optimizado para la detección imparcial de bacterias asociadas con la mucosa de la vejiga en secciones de biopsia de vejiga incrustadas en parafina. La Figura 1 muestra micrografías confocales representativas de un experimento que utiliza este protocolo en secciones de biopsias de vejiga obtenidas de mujeres con infección recurrente del tracto urinario. Dos secciones seriales se hibridaron con las sondas universales 16S rRNA (paneles superiores) o revueltos (paneles inferiores). Se tomaron imágenes de la misma región del tejido y las bacterias (verdes) son claramente visibles en el tejido hibridado con las sondas de ARNr 16S y no con la sonda de revuelto. La Figura 2 representa un resultado falso positivo. La señal correspondiente al colágeno o elastina autofluorescentes se detecta en los canales 405 y 488 en las secciones de biopsia híbrida de sonda de revuelto 16S y de sonda de revuelto que destaca la importancia de utilizar siempre un control de sonda de revuelto.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sonda</td>
			<td>Secuencia</td>
			<td>Tm</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Acoplamiento</td>
		</tr>
<tr>
<td>Universal 16S rRNA</td>
			<td>5'-GCTGCCTCCC GTAGGAGT-3'</td>
			<td>54.9</td>
			<td>Alexa-488 (5' y 3')</td>
			<td>NHS Ester</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lucha</td>
			<td>5'-ACTCCTACGG GAGGCAGC-3'</td>
			<td>Na</td>
			<td>Alexa-488 (5' y 3')</td>
			<td>NHS Ester</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Secuencias y características de la sonda FISH. Tm indica la temperatura de fusión y NHS es una abreviatura de N-hidroxisuccinimida.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig1.jpg"> Figura 1: Micrografías confocales representativas de FISH de rRNA universal 16S y sonda de revuelto en una biopsia de vejiga humana. Actin y Mucin están etiquetados en rojo, los núcleos celulares están etiquetados en azul, y las bacterias en verde. Las bacterias asociadas al tejido solo se detectan con la sonda 16SrRNA y no con la revuelta. Imágenes tomadas con un aumento de 63x. Barra de escala a 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig2.jpg"> Figura 2: Micrografías confocales representativas de autofluorescencia verde falso-positiva en una biopsia de vejiga humana. Actin y mucina están etiquetados en rojo, los núcleos celulares están etiquetados en azul, y las bacterias y componentes autofluorescentes de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno y elastina) son de color verde. La fluorescencia verde se observa con el rRNA 16S y las sondas revueltas que indican un resultado falso positivo. Las imágenes se toman con un aumento de 63x. Barra de escala a 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Este protocolo es para la detección imparcial de bacterias asociadas al tejido en biopsias de pacientes por 16S rRNA in situ hibridación y microscopía confocal.

Detección de bacterias residentes en el tejido en biopsias de vejiga por 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Aquí presentamos un protocolo robusto para la detección de bacterias dentro del tejido vesical biopsiado, que tiene amplias aplicaciones a muchos tipos de tejidos donde se sospecha que hay bacterias presentes. La principal ventaja de esta técnica es que es imparcial. Permite al investigador detectar bacterias dentro del tejido sin conocimiento a priori de qué especies bacterianas está presente.Esta técnica puede ayudar a determinar si las bacterias han invadido las paredes de la vejiga de las mujeres con infección urinaria recurrente e informar opciones terapéuticas como la selección de antibióticos que penetran en los tejidos. Mientras que está diseñado para los tejidos de la vejiga, esta técnica se puede aplicar ampliamente a otros tejidos con poblaciones bacterianas residentes con una optimización mínima. Las personas que son nuevas en esta técnica pueden tener problemas con la colocación de cubreobjetos y la toma de imágenes.Concéntrese en optimizar la colocación de los cubreobjetos para reducir las burbujas y practicar la toma de imágenes en muestras no preciosas. Ayudar a demostrar este procedimiento será Jashkaran Gadhvi, un estudiante graduado en mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, limpie una campana de humo vacía o un gabinete de bioseguridad adecuadamente instalado con 70% de etanol.Prepare todos los búferes y reactivos necesarios como se describe en el protocolo de texto. A continuación, limpie cinco frascos de Coplin con 70% de etanol y deje que los frascos se sequen. Cuando los frascos estén secos, etiquételos como se muestra aquí y llénelos con 100 mililitros de la solución adecuada.En la campana de humo, coloque dos diapositivas por biopsia en un portaobjetos vertical. Coloque el portaobjetos vertical en el tarro de Xylenes 1 Coplin durante 10 minutos. Después de esto, retire el portaobjetos del frasco y borre la parte inferior de una toalla de papel para eliminar el exceso de xilenes.Coloque el bastidor en el frasco de Xylenes 2 durante 10 minutos. Y luego rehidrata las secciones de tejido desfilinizadas en lavados sucesivos de etanol durante 10 minutos cada una. Cuando los lavados estén completos, borre la parte inferior del portaobjetos en toallas de papel para eliminar el exceso de etanol y coloque el estante en el frasco de Coplin que contiene 100 mililitros de agua destilada doble esterilizada con filtro durante 10 minutos.Durante este lavado, diluya las sondas a 10 nanomolares en el tampón de hibridación para crear la solución de tinción, asegurándose de preparar 150 microlitros de solución de tinción por diapositiva. Prepare una cámara humidificadora para cada sonda añadiendo una delicada toallita de tarea empapada y arrugada y agua estéril a un depósito de una caja de punta P1000. Coloque el cartucho del soporte de la punta en la parte superior, ya que aquí es donde se sentarán las diapositivas.Una vez completado el lavado final, retire el portaobjetos del portaobjetos y colóquelos en una toalla de papel fresca, con el lado tisú hacia arriba. Utilice una delicada toallita de tarea para secar el tobogán, teniendo cuidado de sólo deslizarse suavemente cerca, pero no en la sección de la biopsia para eliminar el agua. Usando una pluma hidrófoba, dibuje un borde alrededor de la sección de la biopsia y coloque el lado del tejido deslizante hacia arriba en la cámara humidificadora.A continuación, coloque la cámara humidificadora en una incubadora de 50 grados centígrados. Pipetear entre 50 y 150 microlitros de la solución de tinción directamente en la parte superior del tejido para que el rectángulo hecho por el borde hidrófobo alrededor del tejido se llene y cierre la caja suavemente. Incubar durante la noche a 50 grados centígrados en la oscuridad.Si la incubadora tiene una ventana, cúbrala con papel de aluminio para crear un ambiente oscuro. A la mañana siguiente, retire los portaobjetos de las cámaras humidificadora y elimine rápidamente cualquier solución de hibridación restante con una delicada limpieza de tareas. A continuación, coloque los lados en un estante de tinción vertical.Coloque el estante de tinción en un frasco de Coplin envuelto en papel de aluminio que contenga 100 mililitros del tampón de lavado precalentó durante 10 minutos. Repita este paso de lavado dos veces más con un tampón de lavado fresco en los frascos nuevos de Coplin. Durante estos pasos de lavado, prepare la contramancha diluyendo una solución de stock de Hoechst 33342 en tampón de lavado, en una proporción de uno a 1000.En el mismo tubo, añada aglutinina de germen de trigo Alexa-555 a una concentración final de cinco microgramos por mililitro y 555 de faloide a una concentración final de 33 nanomolares. Almacenar en la oscuridad hasta que esté listo para usar. Una vez completado el lavado final, retire los portaobjetos del frasco de Coplin y elimine suavemente cualquier tampón de lavado sobrante con una delicada toallita de tarea.Coloque los portaobjetos boca arriba sobre una toalla de papel y agregue entre 50 y 150 microlitros de contramancha directamente sobre el tejido para que el borde hidrófobo se llene, pero no se desborde. Cubre hasta cuatro toboganes con una nevera criobox y incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de esto, vuelva a colocar los portaobjetos en el estante de tinción y lávelos dos veces más en frascos de Coplin que contengan tampón de lavado fresco, con cada lavado que dure 10 minutos.A continuación, seque bien los portaobjetos y colóquelos del lado tisú hacia arriba en una toalla de papel debajo de una criobox-top. Apriete una gota de soporte de montaje directamente en la parte superior del tejido y coloque suavemente un cubreobjetos de tamaño adecuado en la parte superior. Presione suavemente cualquier burbuja y deje que los portaobjetos se curen durante la noche en la oscuridad.Al día siguiente, sella los bordes de los cubreobjetos a la corredera con una capa ligera de esmalte de uñas transparente y deja secar en la oscuridad durante 10 minutos, antes de guardarlos en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Cuando esté listo para tomar imágenes de las biopsias manchadas, encienda el microscopio confocal y el software asociado con el microscopio. Comience con una diapositiva positiva FISH y cambie al modo de visualización del ordenador.Seleccione los canales para 405, 488 y 555. Establezca el agujero usando el canal de longitud de onda más largo, que en este caso es 555. A continuación, busque el plano focal actual para la visualización de bacterias etiquetadas en el canal 488.Sin cambiar el plano focal, establezca la ganancia, la potencia del láser y el desplazamiento para cada canal de modo que la señal no esté saturada y el fondo no se corrija en exceso. Adquiera la imagen en los tres canales. En este estudio, las bacterias asociadas al tejido se detectan en biopsias de vejiga humana por 16S rRNA FISH.Este protocolo se ha optimizado para la detección imparcial de bacterias asociadas con la mucosa de la vejiga en secciones de biopsia de vejiga incrustadas en parafina. Aquí se muestran micrografías confocales representativas de un experimento que utiliza este protocolo sobre secciones de biopsias vesicales obtenidas de mujeres con infecciones urinarias recurrentes. Dos secciones seriales se hibridan con el rRNA universal 16S o las sondas de codificación.Las imágenes tomadas de la misma región del tejido y las bacterias son limpiamente visibles en el tejido hibridada con las sondas rRNA 16S, pero no están con la sonda de lucha. También son posibles resultados falsos positivos. En este falso positivo representativo, se detecta una señal correspondiente al colágeno o elastina autofluorescente en los canales 405 y 488 en las secciones de biopsia hibridada de sonda 16S y de codificación, destacando la importancia de utilizar siempre un control de sonda revuelto.Para prevenir el foto-blanqueo, minimice la exposición del tejido a la luz después de aplicar las sondas. Si bien esta técnica permite la detección imparcial de bacterias en los tejidos humanos, no proporciona información específica a las especies. Multiplex-FISH con sondas específicas de taxonomía podrían utilizarse para identificar el género o especie presente.Antes de desarrollar esta técnica, no se había demostrado previamente que las bacterias pudieran invadir la pared de la vejiga de los pacientes con infección urinaria recurrente humana. Ahora estamos usando sondas específicas de géneros y especies para determinar qué especies bacterianas están presentes. Los xilenos deben utilizarse en una campana de humo debido a su toxicidad.Se debe tener cuidado de no mirar directamente al láser durante la toma de imágenes. El láser debe apagarse mientras se coloca la diapositiva bajo el objetivo.

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