Name: a tuberculosis molecular bacterial load assay (tb-mbla)
Uploaded: 2020-04-30T13:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA at JoVE.com

Исследование стало возможным благодаря финансированию со стороны Европейских и развивающихся стран клинических испытаний партнерства (EDCTP) - Панафриканский биомаркер расширение программы (PanBIOME) грант SP.2011.41304.008. Поддержка была также получена Университет Сент-Эндрюс школы медицины научно-исследовательский грант. Публикация этой рукописи и протокола TB-MBLA в качестве визуального ресурса стала возможной благодаря финансированию из Шотландского совета по финансированию и Исследовательского фонда глобальных вызовов Университету Сент-Эндрюса. Благодаря Мапуту материнской больницы и Мавалане медицинский центр, который предоставил клинические образцы моспы, и Мапуту лечения туберкулеза группы, которые помогли с тепловисактивации экспериментов клинических образцов мопуты.

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=END+TB+Global+Tuberculosis+Report+2017.">END TB Global Tuberculosis Report 2017.</a> World Health Organization. , (2017).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tuberculosis+report+2018.">Global tuberculosis report 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TB+Elimination+in+Low-Incidence+Countries.">TB Elimination in Low-Incidence Countries.</a> World Health Organization. , (2014).</li><li>Boehme, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=diagnostic+accuracy,+and+effectiveness+of+decentralised+use+of+the+Xpert+MTB/RIF+test+for+diagnosis+of+tuberculosis+and+multidrug+resistance:+a+multicentre+implementation+study.">diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study.</a> The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xpert+MTB/RIF+assay+for+the+diagnosis+of+pulmonary+and+extrapulmonary+TB+in+adults+and+children.">Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Friedrich, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+sensitivity+and+specificity+of+Xpert+MTB/RIF+assay+as+an+early+sputum+biomarker+of+response+to+tuberculosis+treatment.">Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).</li><li>Desjardin, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Sputum+Mycobacterium+tuberculosis+Messenger+RNA+as+a+Surrogate+for+Response+to+Chemotherapy.">Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy.</a> American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).</li><li>Hellyer, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Viable+Mycobacterium+tuberculosis+by+Reverse+Transcriptase-Strand+Displacement+Amplification+of+mRNA.">Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).</li><li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Bacterial+Load+Assay+,+a+Culture-Free+Biomarker+for+Rapid+and+Accurate+Quantification+of+Sputum+Mycobacterium+tuberculosis+Bacillary+Load+during+Treatment.">Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+Mycobacterium+tuberculosis+mRNA+as+a+Marker+of+Bacteriologic+Clearance+in+Response+to+Antituberculosis+Therapy.">Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).</li><li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Bacterial+Load+Assay+Replaces+Solid+Culture+for+Measuring+Early+Bactericidal+Response+to+Antituberculosis+Treatment.">The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).</li><li>Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+mRNA+as+a+Marker+for+Viability+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).</li><li>Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Live+and+Antibiotic-Killed+Bacteria+by+Quantitative+Real-Time+PCR+of+Specific+Fragments+of+rRNA.">Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA.</a> Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).</li><li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+RNA+in+bacteria:+Comparison+of+mRNA+and+stable+RNA.">Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA.</a> Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).</li><li>Gupta, R. K., Srivastava, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resuscitation+Promoting+Factors:+A+Family+of+Microbial+Proteins+in+Survival+and+Resuscitation+of+Dormant+Mycobacteria.">Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria.</a> Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).</li><li>Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resuscitation-promoting+factors+reveal+an+occult+population+of+tubercle+bacilli+in+sputum.">Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum.</a> American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).</li><li>Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+by+Reverse+Transcription-PCR+as+an+Indicator+of+Viability+in+Escherichia+coliCells+Detection+of+mRNA+by+Reverse+Transcription-PCR+as+an+Indicator+of+Viability+in+Escherichia+coli+Cells.">Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells.</a> Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).</li><li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+bacterial+load+assay,+a+culture-free+biomarker+for+rapid+and+accurate+quantification+of+sputum+Mycobacterium+tuberculosis+bacillary+load+during+treatment.">Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).</li><li>Sabiiti, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Bacterial+Load+Assay:+a+Fast+and+Accurate+Means+for+Monitoring+Tuberculosis+Treatment+Response.">Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response.</a> BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).</li><li>Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K., Bishop, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mybacterial+Load+Assay.">Mybacterial Load Assay.</a> Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. , 89-105 (2017).</li><li>Juffs, H., Deeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+Evaluation+of+Pasteurisation+for+Pathogen+Reduction+in+Milk+and+Milk+Products.">Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products.</a> Food Standards Australia New Zealand. , (2007).</li><li>Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+Various+Chemical+Disinfectants+versus+Cleaning+Combined+with+Heat+Disinfection+on+Pseudomonas+Biofi+lm.">Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm.</a> Blood Purification. 22, 461-468 (2004).</li><li>Chedore, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+inactivating+and+fixing+unstained+smear+preparations+of+Mycobacterium+tuberculosis+for+improved+laboratory+safety.">Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).</li><li>Cardoso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Tubercle+Bacilli+in+Heat-fixed+and+Stained+Sputum+Smears.">Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).</li><li>Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+the+heat+killing+of+Mycobacterium+tuberculosis.">The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).</li><li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+bacterial+load+assay+replaces+solid+culture+for+measuring+early+bactericidal+response+to+antituberculosis+treatment.">The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).</li><li>Sabiiti, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+Inactivation+Renders+Sputum+Safe+and+Preserves+Mycobacterium+tuberculosis+RNA+for+Downstream+Molecular+tests.">Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).</li><li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry.">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).</li><li>Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MPT+64+Antigen+detection+for+Rapid+confirmation+of+M.+tuberculosis+isolates.">MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates.</a> BMC Research Notes. 4, 79 (2011).</li><li>Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rendering+of+mycobacteria+safe+for+molecular+diagnostic+studies+and+development+of+a+lysis+method+for+strand+displacement+amplification+and+PCR.">Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).</li><li>Blackwood, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+testing+of+material+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis+prior+to+removal+from+a+Containment+Level-III+Laboratory+as+part+of+a+Laboratory+Risk+Assessment+Program.">Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program.</a> BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).</li><li>Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+Mycobacterium+tuberculosis+DNA:+a+Question+of+Contaiment.">Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).</li><li>Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Mycobacterium+tuberculosis+for+DNA+typing+analysis.">Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).</li><li>McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rRNA+stability+in+heat+killed+and+UV-irradiated+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+and+Escherichia+coli+O157:H7.">rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7.</a> Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).</li><li>Blank, A., Dekker, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+of+Human+Serum,+Urine,+Cerebrospinal+Fluid,+and+Leukocytes.+Activity+Staining+following+Electrophoresis+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gels.">Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels.</a> Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).</li><li>O'Leary, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+impact+of+endogenous+ribonucleases+on+reverse+transcription-PCR+assay+systems.">Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems.</a> Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).</li><li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+virulent+Mycobacterium+tuberculosis,+which+survives+with+only+700+ribosomes+per+0.1+fl+of+cytoplasm.">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm.</a> PLoS One. 10, 1-14 (2015).</li><li>Yang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+species-specific+features+of+the+ribosome+from+the+human+pathogen+Mycobacterium+tuberculosis.">Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis.</a> Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

В этой статье показано, что тепловая обработка в течение 20 мин при температуре 80 градусов по Цельсию, 85 градусов по Цельсию и 95 градусов по Цельсию эффективно инактивирует образцы туберкулеза, что позволяет ТБ-МБЛА проводиться в не-CL3 объекте без риска заражения лабораторных работников. Выводы подтверждают наблюдения, сделанные в предыдущих исследованиях, в отличие от некоторых по эффективности тепловой инактивации Mtb25,30. Например, некоторые сообщения показывают, что отопление при 80 градусах Цельсия не эффективно на образцах высокой бацилллярной нагрузки25,,31,,32,,33. Эффект инокулума высокой плотности удалось избежать в нашем исследовании, гарантируя, что все песка и чистых культур нагреваются при 1 мл объема на 15 мл центрифуги трубки, обеспечивая достаточное пространство, чтобы подвергать каждую часть образца кипения27.
Сохранение РНК после тепловой инактивации позволяет провести ТБ-МБЛА. Этот вывод совпадает с двумя исследованиями, которые продемонстрировали сохранение РНК после тепловой инактивации12,34. Мы показали, что РНК в теплоинактивированных пробах стабильна при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 4 дней, что означает, что лаборатории могут проводить пакетные тесты путем поддержания инактивированных образцов при комнатной температуре в течение недели. Применяя комплекты для экстракции РНК, требующие охлаждения или замораживания, способность поддерживать теплоинактивированные пробы при комнатной температуре устраняет необходимость как для холодовой цепи, так и для лабораторий категории 3 для выполнения TB-MBLA в ограниченных ресурсах условиях.
Менее 1лог бактериальной нагрузки был потерян с помощью 16S rRNA в качестве маркера. Хотя существует разница между живым и теплоинактивированным образцом, количество потерянных в результате тепловой инактивации слишком мало, чтобы поставить под угрозу результаты вниз по течению. Повышение температуры не увеличило количество потерянных РНК, подразумевая, что наблюдаемая потеря не зависит от тепловой обработки. Тепловая обработка при высоких температурах, скорее всего, вызывает лизис клеток, подвергая РНК деградации RNases. Действительно, экзогенное добавление RNase A к тепловой инактивированной фракции увеличило скорость деградации РНК. Кипение не снизило активность RNase, подразумевая, что это очень устойчивый белок.
Важно отметить, что средняя деградация РНК 1,5 журнала10 eCFU/mL не является большой потерей. С этой целью мы предполагаем, что нагревание лизирует небольшую часть бацилл Mtb, тем самым подвергая небольшое количество РНК RNase. Используя TEM, мы показали, что морфология Mtb клеток и целостность стенок клеток практически не зависят от нагрева при 95 градусах Цельсия. Это означает, что это может потребовать различных физиологических факторов и достаточного питания RNases, таких как в принимающей значительно ухудшить РНК35,36. Кроме того, будучи структурной рибосомы, 16S rRNA потенциально менее восприимчивы к RNase37,38. Одна ячейка Mtb содержит 700 рибосом/0,1 мм3 цитоплазмы37,что означает, что на одну клетку содержится больше рРНК. Таким образом, меньшее количество RNase может иметь меньшее влияние38. Наличие большого количества рибосом дает преимущество TB-MBLA с точки зрения чувствительности и способности выявлять низкое бремя больных туберкулезом.
Существует тесная корреляция между бактериальной нагрузкой, измеренной ТТП культуры ТТР ТТР ТТР ТТР ТТР. Это подтверждает бактериальную нагрузку как драйвер культурного позитива в некоторой степени. Однако преимущество TB-MBLA заключается в том, что она непосредственно количественно оценивает бациллную нагрузку, присутствуюую в образце, и не требует пролиферации клеток Mtb до обнаружения. Это контрастирует с культурой, время которой в позитиве зависит от уровня бактериальной нагрузки и скорости пролиферации клеток Mtb. Будущие исследования будут оценивать рабочий процесс TB-MBLA, включая тепловую инактивацию, в обычных клинических условиях. Исследование будет также изучить образцы с рядом бактериальных нагрузок, чтобы понять количество, которое может измениться от положительного к отрицательному (т.е. те, с меньшим количеством бактерий после тепловой инактивации).
Протокол TB-MBLA для молекулярной количественной оценки бактериальной нагрузки является первым в своем роде в бактериологии. Метод непосредственно количественно Mtb бациллы нагрузки от пациента sputum и не требует культуры, чтобы сделать это. Это ускоряет его и увеличивает его потенциал для информирования клинического решения о прогрессе пациента. Шаг тепловой инактивации снижает риск заражения и повышает применимость ТБ-МБЛА в условиях, где нет лаборатории категории 3. После тепловой инактивации образца, есть три протокольных шага для достижения результатов TB-MBLA: экстракция РНК, обратная транскриптаза (RT)-qPCR и анализ результатов qPCR.
Чем выше эффективность изоляции РНК Mtb от образца пациента, тем выше качество результатов. Важно отметить, что качество образца косы влияет на количество РНК изолированы. Например, слюнная слюнная слюнная слюнная выпуклость считается низкокачественной и была связана с низкой бацильной нагрузкой. Это означает, что обучение пациента для получения ожидаемого качества sputum имеет важное значение. Для оценки эффективности процесса экстракции в образец до извлечения проводится контроль добычи (т.е. известное количество не-МТБ-клеток). Извлечение контроля добычи подтверждает эффективность процесса извлечения РНК. Процесс изоляции РНК не может быть действительным, если контроль извлечения не был извлечен. Учитывая тот факт, что Mtb является устойчивым организмом делает механический лисис важной частью процесса. Гомогенизация образца на высокой скорости (600 об/мин) при наличии бисера (т.е. лизирующей матрицы) эффективно лизает клетки. Очистка лизата дает экстракт, содержащий как РНК, так и ДНК. Удаление ДНК является важным последним шагом экстракции РНК. TB-MBLA стремится измерить жизнеспособные бациллы путем количественной оценки РНК. Таким образом, неспособность удалить геномную ДНК означает, что результаты будут иметь сигнал от ДНК, который не является хорошим маркером для жизнеспособности клеток6.
RT-qPCR представляет собой дуплекс, работающий с двойными маркированными зондами для Mtb и контроля добычи. Она включает в себя три этапа: 30 минут обратной транскрипции путем обратной транскрипции при 50 градусах По квадроцита, 15 мин денатурации при 95 градусах Цельсия и 40 циклов усиления при 94 градусах И 60 градусов по Цельсию. Приобретение флуоресценции у зондов происходит при 60 градусах Цельсия (т.е. стадии удлинения фрагмента). Важно отметить, что TB-MBLA был оптимизирован с помощью конкретной машины qPCR, поэтому операторы, использующие другие платформы qPCR, должны оптимизировать условия для своего оборудования. Эффективность удаления ДНК контролируется путем запуска одной реакции на образец в отсутствие RT. Положительный результат этой реакции означает неполное удаление ДНК. Высокое бремя образцов, которые имеют большое количество ДНК может потребовать в два раза больше фермента DNase, чтобы полностью удалить ДНК. К счастью, в образцах высокой бацилловой нагрузки наличие небольших количеств ДНК менее вероятно, повлияет на результат РНК. Рибосомальная РНК, цель TB-MBLA, естественно, происходит в два раза больше ДНК37. В ПЦР, нет шаблона управления (NTC), который является вода, используемая для растворения рагентов ПЦР, контроль для перекрестного загрязнения с экзогенной ДНК или РНК. Положительный сигнал в НТЦ подразумевает перекрестное загрязнение, и результат считается недействительным. Это означает, что все решения, образовавшиеся с помощью этой воды, должны быть отброшены, а новые, сделанные с использованием свежего флакона с водой. Рекомендуется держать пЧр воды в отдельных aliquots, чтобы избежать загрязнения всей воды. Положительный контроль (Mtb RNA) используется для контроля для общей эффективности ПЦР.
Анализ результатов включает в себя преобразование ПЦР Cqs в бактериальную нагрузку (т.е. расчетные единицы формирования колонии на мл) с использованием стандартной кривой. Настройка и оптимизация стандартной кривой имеет решающее значение для этого шага. Рекомендуется стандартная эффективность кривой 0,95-1. Стандартные кривые для MTb и контроля извлечения должны быть настроены и оптимизированы до того, как пациенты или другие тестовые образцы будут запущены на машине. Стандартные образцы оснастят комплектом TB-MBLA. Десятикратное разбавление экстракта РНК рекомендуется для ПЦР. Это означает, что результат бактериальной нагрузки должен быть умножен на 10 раз, чтобы получить конечный результат бактериальной нагрузки на мл. Важно отметить, что Cqs выше 30 считаются отрицательными для TB-MBLA. Минимум два перспективных результатов бактериальной нагрузки измеряется в разных точках времени требуется сделать вывод о реакции лечения. Настоятельно рекомендуется, чтобы один из двух результатов должен быть базовым, до начала лечения. Однако, если пациент инициировал оценку бактериальной нагрузки происходит в середине лечения, должно быть второе время точки бактериального измерения нагрузки для оценки реакции лечения. TB-MBLA может различать бактериальную нагрузку в течение 3 дней на лечение, но в идеале два бактериальных измерений нагрузки приняты 7 дней друг от друга.
Хотя протокол генерирует информативные количественные результаты для лечения ответ, он по-прежнему в значительной степени руководство и требует существенных рук на время для извлечения РНК. Техники в занятых лабораториях, возможно, не на этот раз. В настоящее время принимаются меры по автоматизации процессов экстрапроизводства РНК и ПЦР.

Вызванные микобактериями туберкулеза (Mtb), более 7 х 106 новых случаев туберкулеза (ТБ) регистрируются во всем мире, из которых более 1 х 106 умирают в год1,2. Чтобы обратить вспять эту тенденцию, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) запустила трехстоловый подход, включающий разработку эффективных диагностических и лечебных инструментов3. Классифицированный как опасное биологическое вещество B ООН, работа с образцами, предположительно положительными для Mtb, требует уровня сдерживания (CL) 3. Лаборатории CL3 являются дорогостоящими в строительстве и обслуживании. Вследствие этого большинство стран имеют централизованные культурные службы по борьбе с туберкулезом на региональном или национальном уровнях. Это означает, что мазковая микроскопия является наиболее доступным диагностическим инструментом в периферийных медицинских учреждениях.
Существует одобрение ВОЗ на осуществление быстрых молекулярных тестов, таких как Xpert MTB/RIF на уровне 4 медицинских учреждений, в основном расположенных на районных уровнях4,,5. Некоторые районы довольно большие и менее доступны для некоторых людей. В то время как полезно, Xpert MTB / RIF работает путем обнаружения ДНК Mtb. ДНК является стабильной молекулы, которая выживает долго после клетки умерли и, таким образом, не является хорошим стандартом для измерения жизнеспособных клеток решающее значение для мониторинга лечения ответ5,6. Анализы на основе РНК предлагают альтернативу для точного измерения жизнеспособных ячеек77,8,,9,,10,,11,,12,,13. РНК существует в различных видах различной устойчивости: рибосомальной РНК (рнка), переносица РНК (tRNA) и рнке-мессенджере (мРНК). Messenger РНК связана с экспрессией генов и, таким образом, наиболее тесно связана с активностью клеток и жизнеспособностью14. Важно отметить, что отсутствие экспрессии генов не эквивалентно гибели клеток, потому что патогенные микроорганизмы, как Mtb, как известно, существуют в неактивных (спящих), но жизнеспособных состояний15,16. Стабильные виды РНК, такие как рнка, являются лучшими маркерами как активных, так и неактивных состояний жизнеспособных клеток.
Использование Escherichia coli , Шериданпоказал, что 16S rRNA пропорционально увеличилось с бактериальным ростом измеряется колонии формирования единиц (CFU) насчитывает17. Одновременно езстало снижение количества CFU и 16S rRNA, когда бактерии кишечной палочки подвергались воздействию антибиотиков. Падение rRNA после смерти клетки было индикатором что оно смогло быть использовано как маркер для жизнеспособностиклетки 13,,17. Исходя из этого принципа, анализ молекулярной бактериальной нагрузки на туберкулез (TB-MBLA) был разработан для ориентации M. tuberculosis 16S rRNA для измерения жизнеспособной нагрузки на туберкулез ную ч. 00 м. в качестве маркера ответной меры на лечение пациентов на противотуберкулезную терапию11,18,19. Мы дополнительно разработали и оптимизировали TB-MBLA, чтобы включить контроль клеточной экстракции, который отражает лисис бациллы M. tuberculosis и является надежным в различных экологических условиях20. Процедура TB-MBLA требует, чтобы первые шаги изоляции РНК от Mtb проводились в лаборатории CL3 до тех пор, пока клетки Mtb не будут полностью лиизированы для обеспечения безопасности работников. Она также включает в себя сохранение образцов для ретроспективного пакетного анализа, который будет поддерживаться при -80 градусов по Цельсию в гуанидине тиоцианате, токсичном веществе уровня 4. С этой целью мы использовали тепло для инактивации Mtb и сделать образцы безопасными для TB-MBLA, которые будут выполняться в лабораториях уровня мазка микроскопии.
Использование тепла в лабораторных и клинических приложениях было вокруг на протяжениивеков 21,22. Тем не менее, некоторые микроорганизмы, как Mtb трудно убить, и короче воздействие тепла недостаточно, чтобы убить все клетки23,24. Исследование показало, что 20 мин нагрева тБ культур на 80 градусов по Цельсию убил все Mtb бациллы, не разрушая ДНК, необходимые для ПЦР25. Впоследствии, ряд методов лабораторной добычи ДНК в настоящее время тепла до 95 градусов по Цельсию. Мы применили тот же принцип, чтобы показать, что кипячение образцов Туберкулеза при температуре 80 градусов по Цельсию, 85 градусов по Цельсию или 95 градусов по Цельсию инактивирует Mtb, сохраняя при этом достаточную РНК для ТБ-МБЛА. Инактивированная культура или мокрота могут поддерживаться в плотно закрытых контейнерах при комнатной температуре или храниться в холодильнике в течение 7 дней без уменьшения количества количественной rRNA.
TB-MBLA, в настоящее время используется в качестве исследования использовать только (RUO) тест адаптируется и был применен к различным типам образцов, включая косму, ткани легких, и спинномозговой жидкости. Он еще предстоит нанести на бронхиальной альвеолярной жидкости, крови и других типов образцов. Использование sputum в качестве образца, результаты многоузловой оценки в Африке (неопубликованные данные) и предыдущих публикаций18,26 показывают, что чувствительность MBLA согласуется с микобактериями индикатор ажиотажа (MGIT) жидкой культуры. Тем не менее, TB-MBLA быстрее, давая результаты в часах, в отличие от дней или недель культуры, конкретные, не пострадавших от нетбных микроорганизмов в выборке, и дает количественную меру тяжести заболевания. Недавно ВОЗ признала TB-MBLA кандидатом на замену мазковой микроскопии и культуры для мониторинга лечения туберкулеза2.
В этой статье мы подробно описываем тепловую инактивацию и протокол TB-MBLA, опубликованный в Sabiiti et al.27. Этот подробный протокол обеспечит единый визуальный ресурс для пользователей TB-MBLA по всему миру.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:753px;" width="752">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Heat inactivation:</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">15 mL Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:99px;">Fisher-Scientific</td>
			<td>10136120</td>
			<td style="width:283px;">50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:265px;">15 mL Wire Tube rack</td>
			<td style="width:99px;">Fisher-Scientific</td>
			<td>11749128</td>
			<td style="width:283px;">Other brands with similar make can be used</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:265px;">Water bath</td>
			<td style="width:99px;">Fisher-Scientific</td>
			<td>15700619</td>
			<td style="width:283px;">Other brands with similar make can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">RNA extraction:</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chloroform</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td>372978-1L</td>
			<td style="width:283px;">Not necessary in other RNA extraction kit brands</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, absolute 99-100%</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Larger volume available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Extraction control</td>
			<td style="width:99px;">SOI group St Andrews</td>
			<td style="width:107px;">VitalbacteriaEC</td>
			<td style="width:283px;">Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">FASTRNA Pro blue Kit</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td>116025050</td>
			<td>Supplied with lysing matrix tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Molecular grade water (RNase free)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td style="width:283px;">Qiagen, Fisherscientific can also supply same product</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Precellys 24 homogeniser</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td>432-3750</td>
			<td style="width:283px;">FastPrep MP Biomedicals can be used too</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus</td>
			<td style="width:99px;">Fisher-Scientific</td>
			<td>15352117</td>
			<td style="width:283px;">Other brands with similar capacity can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:99px;">Eppendorf</td>
			<td>BLD-455-010C</td>
			<td>Works with 1-2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">TURBO DNA-free</td>
			<td style="width:99px;">Fisher-Scientific</td>
			<td>AM1907M</td>
			<td style="width:283px;">Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">RT-qPCR:</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:265px;">Primers and Taqman probes</td>
			<td style="width:99px;">SOI group St Andrews</td>
			<td style="width:107px;">VitalbacteriaPP</td>
			<td style="width:283px;">Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit</td>
			<td style="width:99px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">204845</td>
			<td>PCR mix plus the RT enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">RotorGene Q 5plex machine</td>
			<td style="width:99px;">Qiagen</td>
			<td>9001580</td>
			<td style="width:283px;">Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;">Strip Tubes and Caps, 0.1 ml</td>
			<td style="width:99px;">Qiagen</td>
			<td>981103</td>
			<td style="width:283px;">Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-heat inactivation Sample preservation materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">93313</td>
			<td>Supplied ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">63689</td>
			<td>Many competent suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidine thiocyanate (GTC)</td>
			<td style="width:99px;">Promega</td>
			<td style="width:107px;">V2791</td>
			<td>Promega brand recommended for quality</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Molecular grade water (RNase free)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">W4502-1L</td>
			<td style="width:283px;">Ensures that GTC solution is free of nucleases</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">General materials (used but not specific to TB-MBLA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 mL plastic containers</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;">734-5087</td>
			<td>Nalgene brand recommeded</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biological waste discard jars</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Many competent suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chemical waste discard jars</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Many competent suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Disposable gloves, chemical resistant</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Many competent suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Many competent suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Many competent suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fridge (0-8 &#176;C)</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Many competent suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fume hood</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For safe handling of toxic reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laboratory scales</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For accurate measurement of reagents</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Measuring cylinders, plastic</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:283px;">To ensure accurate measurement of reagents</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR reaction tubes</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:283px;">Should be suitable to the PCR instrument used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Pipettes and matching sterile filtered pipette tips,</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:283px;">DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Qiagility loading plates</td>
			<td style="width:99px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:283px;">5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAgility Pipetting Robot</td>
			<td style="width:99px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Important for high throughput pipetting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:283px;">Chemical-resistant and autoclavable recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">RNase Away (Removes RNases enzymes from working space)</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">10666421</td>
			<td style="width:283px;">Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Safety goggles, chemical resistant</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:283px;">Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL - 3 mL</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Many competent suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterile RNAse-free microtubes</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:283px;">1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 &#176;C recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:283px;">Ensure it is freshly prepared or prepared within a week</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Vortex</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Genie 2 brand recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Glutaldehyde (8%)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td>G7526-10ML</td>
			<td style="width:283px;">Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">HEPES (pH 7.4, 100 mM)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td style="width:283px;">Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica FCS ultracryo</td>
			<td style="width:99px;">Leica</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Cryomicrotome for tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGG6425</td>
			<td>Cold mounting resin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Paraformaldehyde (4% in PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td style="width:283px;">Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td>84097-250G</td>
			<td style="width:283px;">Preservation and mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:265px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:99px;">Agar Scientific</td>
			<td>AGR1260A</td>
			<td>Universal Electron microscopy stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tuberculosis molecular bacterial load assay (tb-mbla)

Туберкулез вызывается микобактериями туберкулеза (МТБ), патогена, классифицируемого Организацией Объединенных Наций (ООН) как опасное биологическое вещество категории В. В целях безопасности рабочих обработка всех образцов, предположительно перевосоставляемых на Mtb, должна проводиться в лаборатории сдерживания (CL) 3. Тест на молекулярную бактериальную нагрузку на ТБ (TB-MBLA) представляет собой тест обратной транскриптазной количественной полимеразы (RT-qPCR), который количественно оценивает bacillary нагрузку Mtb с использованием грунтовок и двухмаркированных зондов для 16S rRNA. Мы описываем использование тепловой инактивации для того, чтобы сделать образцы туберкулеза неинфекционными, сохраняя РНК для ТБ-МБЛА. Аликот 1 мл образца манкуса в плотно закрытых 15 мл центрифуговых труб кипятят в течение 20 минут при температуре 80 градусов по Цельсию, 85 кВ или 95 градусов по Цельсию, чтобы инактивировать бациллы Mtb. Культивирование теплового инактивированных и контрольных (живых) образцов в течение 42 дней подтвердили смерть от туберкулеза. Инактивированный образец затем шипами с 100 зл из контроля добычи и РНК извлекается в соответствии со стандартной процедурой изоляции РНК. Роста в культурах теплообработанных образцов не наблюдалось. Изолированная РНК подвергается в режиме реального времени RT-qPCR, что усиливает конкретную цель в гене Mtb 16S rRNA, что дает результаты в виде циклов количественной оценки (Cq). Стандартная кривая используется для перевода Cq в бактериальную нагрузку, или расчетливые единицы формирования колонии на мл (eCFU/mL). Существует обратная связь между Cq и бактериальной нагрузки образца. Ограничение состоит в том, что теплоинактивация лизает некоторые клетки, подвергая РНК RNases, которые вызывают потерю lt;1 журнал10eCFU/mL (т.е., lt;10 CFU/mL). Дальнейшие исследования определят долю пациентов с очень низкой нагрузкой, которые вызывают ложные отрицательные результаты из-за тепловой инактивации.

Тепло инактивирует все бациллы M. tuberculosis Оптическая плотность (OD) элементов управления (живые клетки) увеличилась с течением времени, (0.04OD-0.85OD)и никаких изменений OD не наблюдалось в теплоинактивированных образцах, что означает рост и отсутствие роста соответственно (Рисунок 1)27. Аналогичным образом, контроль клинической sputum вырос положительным на 3 день в MGIT в то время как тепло инактивированных клинических образцов не флаг положительный до конца инкубации. Рост Mtb в MGIT был подтвержден циль-Нилсен мазка микроскопии и антигенА MPT6429.
РНК в инактивированных образцах стабильна при 37 градусах по Цельсию в течение 4 дней Теплоинактивированные образцы были инкубированы при температуре 37 градусов по Цельсию, чтобы определить, деградирует ли РНК после тепловой инактивации клеток. Не было найдено никакой разницы между РНК, собранной в день (D) 0 сразу после тепловой инактивации и РНК изолированы на D1, 2, 3 и 4 в обеих культурах BCG(Рисунок 2A-C) и ТБ положительный sputum (Рисунок 2D).
Экзогенный RNase увеличивает скорость деградации РНК в теплоинактивированных фракциях Чтобы определить, почему РНК не деградирует, фермент RNase A был экзогенно добавлен на 1000 U/mL до и/или после тепловой инактивации. Это привело к потере РНК, эквивалентной бактериальной нагрузке 1,5 и 0,3 -, 1,8 и 0,2 -, и 1,3 и 0,1 - журнал10 eCFU/mL при 80 градусах По Цельсия, 85 градусов по Цельсию и 95 градусов соответственно в течение 4 дней инкубации. Существовала разница в РНК деградировали в образцах, где RNase был добавлен до и / или после тепловой инактивации(рисунок 3A-C).
Достаточная РНК сохраняется для TB-MBLA с использованием 16S rRNA в качестве эталонного маркера Влияние тепловой инактивации на РРНК измерялось в культурах BCG и sputum от больных туберкулезом. Измеренная бактериальная нагрузка культуры управления BCG, 5,3 и 0,227журнала10 eCFU/mL, была 0,2 и 0,1 бревна10 eCFU/mL выше, чем комбинированные 5,1 и 0,3 бревены10 eCFU/mL теплаFigure 4Aв активированной культуре (ANOVA p qlt; 0.0001) при 80 Аналогичным образом, бактериальная нагрузка контрольного пациента, 7,1 журнала10 eCFU/mL, была 0,8 и 0,1 журнала10 eCFU/mL выше, чем комбинированные 6,3 и 0,41 журнала10eCFU/mL при 80 C, 85 C, и 95 C (Рисунок 4B)27. Снижение бактериальной нагрузки было сокращено в двух типах проверенных образцов.
Тест несколько сравнений Сидака выявил существенную разницу между бактериальной нагрузкой на уровне 95 градусов по Цельсию по сравнению с 80 градусов по Цельсию и 85 градусов по Цельсию (р- 0,001). Никакой разницы в пробах туберкулеза при всех температурах не обнаружено, р- 0,8.
Целостность клеточной стенки не разрушается теплом в большинстве клеток Mtb Используя электронную микроскопию передачи (TEM), мы исследовали, были ли клетки лизинировать тепловой инактивацией. Тонкие участки параформальдегида фиксированные гранулы клеток были сделаны и встроены в богатую электроном среду до исследования TEM. Осмотр клеток при нижнем и более высоком увеличении выявил нетронутую клеточную стенку и видимые внутриклеточные липидные тела. Клетки морфологически появились удлиненные, но не лисиченые. Рисунок 5 иллюстрирует морфологию клеток микобактерий при различных увеличениях. Две верхние панели показывают внутриклеточные липидные тела и беспрепятственную веревку, похожую на проводку, морфологическую характеристику, характерную для видов микобактерий. Нижние две панели имеют более высокое увеличение, расширяющее вид липидных тел и раскрывающее некоторые микровнутриклеточные структуры.
Бактериальная нагрузка, измеренная TB-MBLA, обратно коррелирует с временем культуры MGIT с позитивом Для пациентов, реагируя на терапию, бактериальная нагрузка падает в среднем на 1 журнал10 eCFU/mL в неделю в течение лечения. Быстрые ответчики очищаются быстрее, превращаясь в отрицательную (нулевую бактериальную нагрузку) на 2 недели лечения. Падение бактериальной нагрузки, измеряемое ТБ-МБЛА, соответствовало росту времени культуры МГИТ до положительности (ТТП). Рисунок 6 демонстрирует обратную корреляцию между бактериальной нагрузкой и МГИТ ТТП. Разница, однако, заключается в том, что результаты ТБ-МБЛА доступны в 4 ч и время к результату не зависит от уровня бактериальной нагрузки. Это контрастирует с 5-25 дней для мгитовых культурных тестов. Загрязнение бактериями, не внедёмыми в ТБ, еще больше подрывает результаты культурных тестов.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig1v3.jpg"> Рисунок 1: Проверка инактивации BCG на уровне 80 градусов по Цельсию (кривая точечного шаблона), 85 градусов по Цельсию (кривая шаблона dot-dash) и 95 градусов по Цельсию (кривая шаблона тире). Контроль (черная кривая) была живой (неотапливаемой) культурой BCG, привитой в ту же среду роста. Рост контроля был подтвержден увеличением ОД культуры в течение инкубационного периода. Эта цифра была изменена с Sabiiti и др.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig2v3.jpg"> Рисунок 2: Стабильность количественной РНК в теплоинактивированном образце инкубируется при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 4 дней (D0-D4). (A), (B), и (C) показать BCG культур инактивированы на 80 C, 85 C, и 95 C соответственно. (D) показывает, что туберая гнусная часть инактивирована при 80 градусах Цельсия. Контроль представляет собой необработанную (живую) часть одного и того же образца. Бары ошибок - стандартное отклонение. Три повтора, девять повторов за пробег. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig3v2.jpg"> Рисунок 3: Более высокая деградация РНК после экзогенного добавления фермента RNase A. (A) Тепло инактивации (HI) при 80 c, (B) HI при 85 C, и (C) HI 95 C. Бары ошибок - стандартная ошибка среднего. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig4v2.jpg"> Рисунок 4: Сохранение достаточной РНК для измерения бактериальной нагрузки TB-MBLA с использованием 16S rRNA в качестве маркера. (A) Бактериальная нагрузка оценивается из культур in vitro BCG. (B) Бактериальная нагрузка оценивается от туберкулеза положительной косточки. Бары ошибок - стандартная ошибка среднего значения (n No 18 и 20 репликатов для A и B соответственно). Эта цифра была изменена с Sabiiti и др.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig5.jpg"> Рисунок 5: Электронные микрографы нетронутых btb бацилл после инактивации при 95 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Чистая нетронутая клеточная стенка и перечисленные липидные тела наблюдались с помощью TEM. Вверху: низкое увеличение изображения группы клеток выявления непрерывный микобактериальной веревки, как кордивная морфология и внутриклеточного липидных органов. Внизу: высокое увеличение верхних панелей для расширения зрения липидных тел и выявления некоторых микровнутриклеточных структур. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig6.jpg"> Рисунок 6: 12-недельная кривая реакции на лечение пациента на противотуберкулезную терапию, показывающая обратную корреляцию измеренная бактериальная нагрузка TB-MBLA и МГИТ ТТП. Бактериальная нагрузка (синяя кривая) падает в то время как ТТП поднимается (красная кривая), как пациент реагирует на лечение. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Мастер микс</td>
			<td>Позитивная реакция RT</td>
			<td>Негативная реакция RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Объем на реакцию x no. реакций No 5</td>
			<td>Объем на реакцию x no. реакций No 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Квантитектная смесь</td>
			<td>10,0 л</td>
			<td>10,0 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mtb16S грунтовка микс (F и R)</td>
			<td>0,4 л</td>
			<td>0,4 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Зонд Mtb16S</td>
			<td>0,2 л л</td>
			<td>0,2 л л</td>
		</tr>
<tr>
<td>EC грунтовка микс (F и R)</td>
			<td>0,4 л</td>
			<td>0,4 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>EC зонд</td>
			<td>0,2 л л</td>
			<td>0,2 л л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Фермент RT</td>
			<td>0,2 л л</td>
			<td>-------</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase бесплатная вода</td>
			<td>4,6 л л.</td>
			<td>4,8 л л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий объем</td>
			<td>16 Зл</td>
			<td>16 Зл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Мастер-микс-руководство по подготовке к TB-MBLA qPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Тип</td>
			<td>Канал МТБ</td>
			<td>Канал ЕС</td>
			<td>Интерпретации</td>
		</tr>
<tr>
<td>Образец</td>
			<td>Положительные</td>
			<td>Положительные</td>
			<td>Действительны</td>
		</tr>
<tr>
<td>Образец</td>
			<td>Положительные</td>
			<td>Отрицательные</td>
			<td>Неопределенное</td>
		</tr>
<tr>
<td>Образец</td>
			<td>Отрицательные</td>
			<td>Положительные</td>
			<td>Действительны</td>
		</tr>
<tr>
<td>Образец</td>
			<td>Отрицательные</td>
			<td>Отрицательные</td>
			<td>Недопустимый</td>
		</tr>
<tr>
<td>МТБ - Контроль</td>
			<td>Положительные</td>
			<td>Отрицательные</td>
			<td>Действительны</td>
		</tr>
<tr>
<td>Контроль добычи (EC)</td>
			<td>Отрицательные</td>
			<td>Положительные</td>
			<td>Действительны</td>
		</tr>
<tr>
<td>Контроль ДНК</td>
			<td>Отрицательные</td>
			<td>Отрицательные</td>
			<td>Действительны</td>
		</tr>
<tr>
<td>Отрицательный контроль (NTC)</td>
			<td>Отрицательные</td>
			<td>Отрицательные</td>
			<td>Действительны</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Руководство по интерпретации результатов ТБ-МБЛА.

Watch this Scientific Journal Video about A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA at JoVE.com

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

Мы описываем тест анализа молекулярной бактериальной нагрузки на туберкулез, проведенный после тепловой инактивации косточки. Тепловая инактивация делает образцы косточки неинфекционными и устраняет необходимость в лабораториях 3-го уровня сдерживания для молекулярных тестов на туберкулез.

Анализ молекулярной бактериальной нагрузки на туберкулез (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Это туберкулез молекулярной бактериальной анализа, ответы на три ключевых вопроса. Первое: Какова величина бремени болезни пациента? Второе: Как бремя болезни пациента реагирует на противотуберкулезные препараты?И три: Какова связь между бременем болезни и лечения ответ? Этот анализ дает количественный результат бремени туберкулеза пациента, и измеряет, как это бремя меняется с лечением в течение короткого времени. С модификацией эта методология может быть применена к другим бактериальным патогенам.Мы уже разработали аналогичную технологию диагностики нетрубоходных микобактерий и бактерий, связанных с хронической обструктивной болезнью легких. При выполнении этой техники в первый раз, смотреть видео и практиковать шаги. Очень важно практиковаться с образцами, которые не нужны для результатов диагностики пациентов.Визуальная демонстрация имеет решающее значение, поскольку она упрощает обучение и освоение шагов, особенно тех частей метода, которые трудно объяснить в тексте. Начните с подготовки клеточных культур. На чистой лабораторной скамейке или в одной каюте, урожай один миллилитр aliquots экспоненциальной фазы Bacille Calmette-Guerin или BCG культуры в 15 миллилитров пластиковых трубок и плотно закрыть их.При подготовке образцов мокроты пациента работайте в хорошо проветриваемом помещении и следуйте рекомендациям руководства GL One Stop TB. Аккуратно откройте чашку образца и пипетки один миллилитр aliquots в 15 миллилитров пластиковых центрифуг труб. Затем плотно закройте трубки.Перенесите пробные трубки на стойку для держивок, погруженную в водяную баню, которая разогревается до 95 градусов по Цельсию, убедившись, что 3/4 каждой трубки погружено. Отварить образцы в течение 20 минут. Затем перенесите трубки на скамейку, чтобы охладить при комнатной температуре в течение пяти минут.Выполните экстракции РНК в дым капот при использовании комплекта с фенол хлороформ или этанола опухолевых капитала. Процедура РНК, иллюстрированная здесь, является процедурой извлечения фенола хлороформа. Однако могут также использоваться альтернативные методы извлечения РНК.Перенесите один миллилитр алицитов теплового инактивированного образца в 1,5 миллилитровые трубки и шип 100 микролитров контроля экстракции в каждый образец. Закройте трубки и смешайте их, инвертирование три раза. Центрифуга труб при 20 000 раз г в течение 10 минут.Затем, аспирировать супернатант, оставляя 50 микролитров осадков. Мы приостанавливаем осадок в 950 микролитров буфера лиза путем трубопроводирования и переводим всю подвеску в лизающие матричные трубки, поставляемые с набором для извлечения РНК. Плотно закройте трубки и убедитесь, что они помечены как на крышке, так и на стороне.Затем гомогенизируйте образцы в течение 40 секунд при 6000 об/мин. Центрифуга лисировать при температуре 12 000 раз в течение пяти минут при комнатной температуре. Между тем, подготовить свежие один миллилитров трубки, и добавить 300 микролитров хлороформа.Используйте одноми миллилитровую пипетку, чтобы тщательно аспирировать супернатант, не касаясь матрицы лизирования и перенести его в трубку с хлороформом. Vortex труб в течение пяти секунд и оставить их поселиться в течение пяти минут или до трех этапов хорошо видны. Центрифуга труб на 12000 раз г в течение пяти минут.Затем осторожно пипетку верхней фазы и передать его в 1,5 миллилитров трубки. Добавить 500 микролитров ледяного 100% этанола в образец, закрыть трубку, и инвертировать его три раза, чтобы смешать. Инкубировать трубки при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 15 минут или при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение 30 минут.Затем загрузите трубки в предварительно охлажденную микро центрифугу и центрифугу в течение 20 минут при 13 000 раз г и четыре градуса по Цельсию. Откажитесь от супернатанта, добавьте 500 микролитров 70%ледяного этанола и центрифуги еще на 10 минут при 13 000 г. Отбросьте все супернатанты.И инкубировать трубки при 50 градусах по Цельсию в течение 20 минут, чтобы высушить гранулы нуклеиновой кислоты, убедившись, что держать трубы частично открытыми, чтобы позволить испарение этанола. Затем добавьте 100 микролитров воды без ядра в гранулы и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Vortex образца в течение трех секунд и приступить к удалению ДНК или хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к использованию.Подготовлена одна смесь ДНК в соответствии с рукописными указаниями и пипеткой 11 микролитров в каждую трубку, содержащую экстракт РНК. Vortex в течение трех секунд и спина вниз кратко, чтобы удалить любые капли со стенки трубки. Затем инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут в горячем блоке или инкубаторе.После инкубации добавьте еще один микролитер одного фермента ДНК непосредственно в трубку и хорошо перемешайте вихрем. Затем инкубировать трубки еще 30 минут при 37 градусах по Цельсию. Оттепель и вихрь реагент инактивации ДНК.Затем добавьте 10 микролитров к каждому экстракту РНК. И инкубировать трубки при комнатной температуре в течение пяти минут. Вихрь труб три раза во время инкубации шаг.Затем центрифуга смеси на 13000 раз г в течение двух минут и тщательно передать супернатант в 1,5 миллилитров РНК свободной трубки, убедившись, чтобы не касаться любой из матрицы инактивации. Разбавить все неизвестные образцы РНК от одного до 10 в свободной воде РНК, то, смешать их вихрем в течение пяти секунд и кратко спиннинг их вниз. Оттепель MTB и EC-РНК образцов и сделать семь и шесть десятикратных разбавления соответственно для стандартной кривой.Подготовка RT плюс и RT минус ПЦР мастер смеси в соответствии с рукописными направлениями. Vortex RT плюс смесь и передачи 16 микролитров в каждый RT плюс ПЦР трубки. Затем вихрь RT минус смесь и добавить 16 микролитров в каждый RT минус ПЦР трубки.Добавьте четыре микролитров экстракта РНК или воды и дублируйте в RT плюс трубки. Вода является не-шаблон управления или NTC. Добавьте четыре микролитров экстракта РНК или воды в трубки RT минус.Загрузите реакционной трубки в машину ПЦР в режиме реального времени, запрограммировать реакцию, описанную в рукописи, и запустить реакцию. Для интерпретации реакции на лечение используйте стандартную кривую для преобразования значений СЗ в бактериальную нагрузку и расчета реакции в качестве изменения бактериальной нагрузки в течение периода последующей обработки. Падение бактериальной нагрузки после лечения означает положительный ответ, в то время как никакие изменения или рост бактериальной нагрузки не означает негативной реакции.Для проверки того, что все бациллы М.туберкулеза были активированы теплом, была измерена оптическая плотность клеток и сопоставлена с плотностью живых клеток. Никаких изменений в OD с течением времени не наблюдалось для тепла инактивированных образцов, указывающих на отсутствие роста. Тепловые инактивированные образцы были инкубированы при температуре 37 градусов по Цельсию, чтобы определить, ухудшается ли РНК после тепловой инактивации клеток.Не было обнаружено никакой разницы между РНК, собранной сразу после тепловой инактивации, и РНК, изолированной один, два, три и четыре дня спустя как в культурах BCG, так и в положительной мокроте туберкулеза. Когда фермент РНК А был экзогенно добавлен в образцы, до и после тепловой инактивации, потеря РНК произошла во всех тепловых инактивированных образцах в течение четырех дней инкубации. Влияние тепловой инактивации на рибосомную РНК измерялось в культурах BCG и мокроте у пациентов с положительным туберкулезом.Измеренная бактериальная нагрузка контрольной культуры была выше, чем комбинированная бактериальная нагрузка тепловой инактивированной культуры на 80 градусов по Цельсию, 85 градусов по Цельсию и 95 градусов по Цельсию для образцов BCG и мокроты. Тепловая инактивация образцов приводит к минимальной потере РНК, оставляя адекватную РНК для ниже по течению TB-MBLA и других молекулярных тестов ниже по течению. Передача Электронная микроскопия была использована для исследования ли клетки литья тепловой инактивации.Проверка клеток при нижнем и более высоком увеличении выявила нетронутые клеточные стенки и видимые внутриклеточные липидные тела. Клетки казались удлиненными, но не облились. При попытке этой процедуры, очень важно помнить, чтобы добавить контроль извлечения, который контролирует любые ложные негативные результаты из-за плохой добычи РНК.Этот подход может быть применен к бактериям, связанным с хронической обструктивной болезнью легких, нетуберной микобактериальной инфекцией и другими респираторными патогенами. Количественные результаты ТБ-МБЛА позволили математическим и фармако-моделированием того, как пациенты реагируют на туберкулезную терапию. Мы с нетерпением ожидаем применения этой методики в обычном уходе, где управляются больные туберкулезом.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Использование люциферазы в Изображение Бактериальные инфекции у мышей

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Биолюминесцентный &#39;Reporter Фаг для обнаружения Категория бактериальных патогенов

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Измерение бактериальной нагрузки и иммунного ответа в мышей, инфицированных Listeria моноцитогенес</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Визуальный анализов для мониторинга T6SS-опосредованной Бактериальные конкурса

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Демонстрация с множественной лекарственной устойчивостью<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Усиление микрочипов

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; транспозонов мутанты

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ связи с казумом, который прогнозирует проникновение наркотиков в очаги туберкулеза

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Анализ 18FDG ПЭТ/КТ изображений как инструмент для обучения микобактерии инфекции и лечение в Non-human приматов

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Микобактерии изображений в мышах с флуоресценцией фермента репортер

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...