Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

أجريت التجارب علي النانو التصوير beamline ID16A في اطار مقترحات ESRF LS2430 ، LS2303 ، و LS2765.

<ol>
	<li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage/genotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors.">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li><li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging.">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li><li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , (2000).</li><li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity,+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions,+and+down+regulation+of+MAO-B.">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li><li>Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+low+calcium+concentrations+in+cryosectioned+cells+by+parallel-EELS+mapping.">Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping.</a> Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).</li><li>Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+scanning+electron+microscopy+to+X-ray+analysis+of+frozen+hydrated+sections.+I.+Specimen+handling+techniques.">Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques.</a> Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).</li><li>Saubermann, A. J., Heyman, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections.">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, 169-182 (1987).</li><li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells.">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1875-1882 (1984).</li><li>Wroblewski, J., M&#252;ller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+X-ray+microanalysis+of+semi-thick+cryosections.">Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections.</a> Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).</li><li>Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreparation+of+mammalian+tissue+for+X-ray+microanalysis+in+STEM.">Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM.</a> Journal of Microscopy. 125, 149-156 (1982).</li><li>Harkiolaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-soft+X-ray+tomography:+Using+soft+X-rays+to+explore+the+ultrastructure+of+whole+cells.">Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).</li><li>McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+X-ray+tomography+and+cryogenic+light+microscopy:+the+cool+combination+in+cellular+imaging.">Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).</li><li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy.">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).</li><li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MISTRAL:+a+transmission+soft+X-ray+microscopy+beamline+for+cryo+nano-tomography+of+biological+samples+and+magnetic+domains+imaging.">MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).</li><li>Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+tomography+of+adherent+cells+at+European+synchrotrons.">Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons.</a> Methods in Cell Biology. 124, 151-175 (2014).</li><li>Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+single+cell+quantitative+elemental+imaging+using+proton+or+synchrotron+radiation+focused+beams.">Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+elemental+content+in+adherent+mammalian+cells+for+analysis+by+synchrotron-based+x-ray+fluorescence+microscopy.">Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+manganese+on+primary+hippocampal+neurons+from+rodents.">Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents.</a> Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+Cytotoxicity+Assay+on+Hippocampal+Neuronal+Cell+Culture.">Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture.</a> Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).</li><li>Gibon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+over-expression+of+TRPC6+channels+in+HEK-293+cells+favours+the+intracellular+accumulation+of+zinc.">The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).</li><li>Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Uptake+and+Storage+During+the+Formation+of+the+Cerebral+Cortex+in+Mice.">Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice.</a> Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).</li><li>Villar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopositioning+for+the+ESRF+ID16A+Nano-Imaging+Beamline.">Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline.</a> Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).</li><li>Kosior, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+hard+X-ray+phase+contrast+imaging+and+X-ray+fluorescence+microscopy+for+subcellular+metal+quantification.">Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification.</a> Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).</li><li>Bohic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrotron+hard+X-ray+microprobe:+fluorescence+imaging+of+single+cells.">Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells.</a> Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Development+of+Electron+Cryo-Microscopy+(Nobel+Lecture).">On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture).</a> Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).</li><li>Da Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+concentration+of+high-energy+X-rays+for+diffraction-limited+imaging+resolution.">Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution.</a> Optica. 4 (5), 492-495 (2017).</li><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high-pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+pratice+of+high+pressure+freezing.">Theory and pratice of high pressure freezing.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrarapid+freezing+for+the+preservation+of+cellular+ultrastructure.">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).</li><li>Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryo-Tomography.">Electron Cryo-Tomography.</a> Cellular Imaging. , 61-94 (2018).</li><li>Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+metal+content+and+intracellular+distribution+in+primary+hippocampal+neurons+with+synchrotron+X-ray+fluorescence.">Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence.</a> PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).</li><li>Vavpeti&#269;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+distribution+and+sample+integrity+comparison+of+freeze-dried+and+frozen-hydrated+biological+tissue+samples+with+nuclear+microprobe.">Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).</li><li>Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-preparation+procedures+for+elemental+imaging+by+sims+and+eftem.">Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem.</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 499-536 (2008).</li><li>Gramaccioni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+quantification+of+intracellular+element+concentration+by+X-ray+fluorescence+microscopy+combined+with+X-ray+phase+contrast+nanotomography.">Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography.</a> Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).</li><li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+and+Copper+Effects+on+Stability+of+Tubulin+and+Actin+Networks+in+Dendrites+and+Spines+of+Hippocampal+Neurons.">Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons.</a> ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).</li><li>Ortega, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+over-expression+induces+increased+iron+accumulation+and+redistribution+in+iron-exposed+neurons.">&#945;-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).</li><li>Fartmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+atomic+and+molecular+species+in+cancer+cultures+with+TOF-SIMS+and+Laser-SNMS.">Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS.</a> Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).</li><li>P&#229;lsg&#229;rd, E., Lindh, U., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+freeze-substitution+techniques+for+X-ray+microanalysis+of+biological+tissue.">Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue.</a> Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).</li></ol>

ولا يوجد تضارب في المصالح بين أصحاب البلاغ.

[برد-الكترون] مجهريه ([برد-م]) يربح ال 2017 [نوبل بريز] في كيمياء وبما ان مثل هذا التطوير يجعل ب [ج.]. [دوبوشت] علي تزجيج من ماده احيائيه ل ال [هيغ-ديكايشن] بنيه تحديد الجزيئات احيائيه في حل25. وكما ذكر دوبوشيت في محاضرته التي ألقاها بجائزه نوبل "ان معرفه كيفيه القيام بالتزجيج لقطره من الماء شيء واحد ، فان اعداد عينه بيولوجية للمراقبة البيولوجية هو آخر"25. وتعتبر الآن خطوات التعويض عن البرد التقنية القياسية للتخفيف من الضرر الناجم عن الجرعة الاشعاعيه ودراسة الخلايا القريبة من حالتها الاصليه. غير ان الاعداد لا يزال مملا. وذلك لان المجهر الكتروني ، نظرا لدقته المكانية غير المسبوقة ، حساس لأي قطعه أثريه بنيوية تحدث اثناء اعداد العينة. وتقترب الآن المجسات المتزامنة من الصعوبات المماثلة التي تنخفض إلى القرارات المكانية بحيث تصل إلى 13 نانومتر في نطاق الاشعه السينية العالية الطاقة26. من الصعب الاشعه السينية المجهر يمكن تحليل الخلايا بأكملها في حين يعاني المجهر الكترون من عمق تغلغل الفقراء من الكترونات تمكين فقط شرائح رقيقه جدا الخلية التي يمكن ملاحظتها.
أحاديه الخلايا هي رقيقه بما يكفي بحيث يغرق-تجميد في الإيثان السائل ، يتم تحقيق معدلات التبريد المطلوبة لتزجيج المياه. من الناحية النظرية ، معدلات التبريد عاليه مثل 108 ك/س ممكنة باستخدام الضغط العالي التجميد27 الذي يسمح التزجيج من العينات سميكه جدا ليغرق تجميد. يتم الوصول إلى معدل تبريد 105 ك/ثانيه ، المطلوبة للسماح بالتزجيج الكامل للعينه في الضغط المحيط28، التكرار باستخدام التلقائي يغرق-تجميد اله والمعلمات المعروضة هنا. وهذا يسمح للباحث بان يرمم العينات البيولوجية الرقيقة (< 10 ميكرومتر) مثل الطبقة الاحاديه من الخلايا12،13،14،15،29،30 بالتجميد في الإيثان السائل.
ومن التحديات الهامه مع هذا البروتوكول هو أيضا الحفاظ علي قدر الإمكان السلامة الكيميائية للمحتوي داخل الخلايا لتوفير توزيعات عنصري موثوق بها في الخلية في 2D أو 3D. كما نشرت في مكان آخر2،16،17،31، في حاله التصوير العنصري علي المستوي تحت الخلوي ، ينبغي النظر في تحليل الخلايا الرطبة المجمدة. والا ، يمكن استخدام مزيج من يغرق-تجميد وتجميد تجفيف الخلايا لتحليل درجه حرارة الغرفة. بالنسبة لهذا الأخير ، يتم أزاله الجليد غير متبلور من خلال عمليه التسامي ، في حين يتم أزاله جزيئات الماء المنضم من خلال عمليه الامتصاص. قد تكون هذه العملية بعيده عن المثالية مقارنه بالعينات الرطبة المجمدة بسبب التغير المحتمل في الاغشيه الخلوية وشكل بعض الهياكل الخلوية32. أيضا ، بالنسبة للدراسات المحددة ، قد يؤدي استخراج المياه إلى قطع أثريه معدنيه. ومع ذلك ، فقد كان ناجحا وأفضل بديل لعينات رطبه المجمدة للتصوير عنصري في المستويات الفرعية 100 nm2،16،17،18،20،33،34،35،36.
كما تم الإبلاغ عن37، ويمكن تقييم نوعيه الاستعدادات الخلوية بالتبريد من خلال نسبه K/Na البوتاسيوم إلى الصوديوم. لسوء الحظ ، فانه لا يمكن حتى الآن ان تحدد مع الصلبة الاشعه السينية نانوسبر المستخدمة هنا ، وذلك بسبب انخفاض الطاقة المنخفضة للكشف عن الانجراف السيليكون المستخدمة للكشف عن الفوتونات الاشعه السينية من العناصر (E ≥ 1.3 كيلو المغنيسيوم). في الواقع ، نسبه عاليه K/Na (> 10) التي يمكن قياسها باستخدام توف-سيمز ، epma ، أو ميكروسبر النووية pixe16،37 هو مؤشر علي سلامه المواد الكيميائية المحفوظة للخلية مقارنه بالمتوقع ك/نا من 25 في خليه حيه37. ويمكن دعم ذلك بنسبه منخفضه من Cl/K المصاحبة38. ومع ذلك ، فان التزجيج الناقص ، خاصه إذا كانت سرعه تبريد العينة منخفضه جدا ، يمكن ان تؤدي إلى تشكيل بلورات جليدية كبيره يمكن ان تتلف اغشيه الخلايا والأرغن ، التالي تغيير توزيع العناصر الكيميائية. علي الرغم من انه لا يوجد اجراء روتيني لمراقبه هذا الضرر المحتمل والتاثير علي التوزيع داخل الخلايا ، فان نسب العنصري المذكورة أعلاه وامكانيه تصوير الخلية بدقه عاليه باستخدام الاشعه السينية المتباينة أو المجهرية السينية بالاشعه السينية يمكن ان تكون أفضل الطرق لدعم الحفاظ علي سلامه المقصورات الجمع بين هذه التقنيات واستخدام المجاهر البصرية كريوكوريلاتيفي مضان المتقدمة حديثا سوف تساعد علي تقييم إلى اي مدي يحدث هذا الضرر ويؤثر علي توزيع عنصري داخل الخلايا.
وعموما ، يتم تقديم بروتوكول مفصل وشامل لاعداد عينات الخلوية لتحليل الاشعه السينية الشعاعية السنكروتروني. وهو نقطه انطلاق جيده للمجتمع البحثي ، مما يساعد علي حل القضية الصعبة لكيفيه اعداد عينات الخلوية المناسبة ل 2D و 3D التصوير العنصري في (البرد) الصلبة الاشعه السينية النانو. ويمكن دمج هذه النهج مع القدرات الضوئية البصرية والمجهرية الكترونيه للتصوير الكيميائي النسبي العميق والتصوير الهيكلي للخلايا.

المصممة حديثا السنكروتروني الاشعه السينية الفلورية (SR-xrf) النانو تحقيقات تسمح التصور للتوزيع تحت الخلوية من العناصر بطريقه كميه بالبالكامل. وعلي سبيل المثال ، تسمح هذه القدرة التحليلية بالتحقيق في امتصاص جزيئات جسيمات نانويه1 أو فلزي مثل المجمعات المستندة إلى الاوزميوم2، وتوفر نظره ثاقبه علي الامتصاص داخل الخلايا للجسيمات القائمة علي المعادن مع خصائص مضاده للسرطان قويه. كتقنية متعددة العناصر ، يوفر SR-XRF3 مع نانوسبر وسيله لقياس وتعريب اينتراسيلولارلي معظم العناصر الهامه بيولوجيا في وقت واحد ، بما في ذلك الفوسفور والكبريت والبوتاسيوم والكالسيوم والحديد والنحاس والزنك. في الواقع ، فان استخدام الاشعه السينية الصلبة يوفر عمق اختراق كبير للصورة كامله الخلايا المجمدة الرطبة في أزياء خاليه من التسمية. وعلاوة علي ذلك ، وتوفير الوصول إلى الحافة K من معظم عناصر الفائدة ، والاشعه السينية الفلورية هو متحمس أكثر كفاءه. ويسمح استخدام النهج المبردة بالحد من الضرر الإشعاعي والتحسين الأمثل للحفاظ علي هيكل الخلية والتوزيع العنصري.
ومعظم التقنيات التحليلية المتاحة التي تحل مكانيا لدراسة الفلزات في الخلايا هي تقنيات سطحيه تتطلب إنتاج أجزاء رقيقه جدا ومسطحه من الخلايا. ويشمل هذا أساسا مسح المجهر الكترون الإرسال مع تحليل الطاقة التشتت الاشعه السينية (الجذعية-EDX) ، والطاقة المصفاة المجهر الكترون الإرسال (EF-TEM) ، والنانو الثانوية الطيف الكتلة الايونيه (نانوسيمس). لا يمكن اجراء هذا الأخير علي أقسام الخلايا المجمدة والمائية بينما يمكن اجراء تحليل التبريد باستخدام المجهر الكتروني مع دقه مكانيه غير مسبوقة ولكن الحساسية العنصرية الضعيفة. وقد سمحت انبعاثات الاشعه السينية المستحثة بالجسيمات بدراسة التوزيعات العنصرية في الخلايا الكاملة. لديها ميزه كونها كميه تماما مع حساسية عنصري عادله علي مقياس ميكرون وحتى في submicron القرار4، ولكن يعاني من الاضرار الاشعاعيه وعدم وجود قدرات المبردة لدراسة الخلايا المتجمدة الرطب. كل هذه التقنيات التحليلية تكمل بعضها البعض في التصوير العنصري للخلايا ، ولكن بالنسبة لجميع التقنيات ، يعد اجراء اعداد العينات خطوه حاسمه. وينبغي الإبقاء عليه بسيطا للحد من التلوث المحتمل فضلا عن أعاده التوزيع العنصري و/أو التسرب للحصول علي نتائج ذات مغزى. كما هو موضح في المجهر الكتروني ، وسير العمل المبردة ، بما في ذلك تجميد التبريد من الخلية والكريوترانسفير إلى مرحله كرويوكانينج ، يسمح الحفاظ علي عنصري الأمثل في مستويات شبه الخلوية أقرب ما يمكن إلى الدولة الاصليه5،6،7،8،9،10. وقد تم تنفيذ هذا الفهم بنجاح في تطوير المجهرية السينية الاشعه السينية اللينة (علي سبيل المثال ، المجاهر الميدانية الكاملة والمجاهر المسح الضوئي) لإنتاج التصوير الهيكلي الشامل لكامل الخلايا المجمدة الرطب في 2D أو 3D. تم تطوير مهام سير العمل المبردة المختلفة11 لمجاهر الاشعه السينية الناعمة في Beamline 2.1 (XM-2) من مصدر الضوء المتقدم في مختبر لورانس بيركلي الوطني12، beamline U41 في حلقه تخزين الكترون Bessy الثاني (ألمانيا)13، BEAMLINE MISTRAL من مصدر الضوء البا (اسبانيا)14، وفي Beamline B24 من مصدر ضوء الماس15، من بين أمور أخرى. وقد تبين مؤخرا ان سير العمل المماثل هو الطريقة الأكثر موثوقيه للاعداد والحفظ للتحليل العنصري داخل الخلايا باستخدام الاشعه السينية المجهرية16،17.
علي الرغم من ان تقنيات النانو الاشعه السينية بدات تستخدم علي نطاق واسع لتحليل عنصري الخلوية ، وخاصه مع ظهور قدرات المبردة SR-XRF ، لم يتم نشر بروتوكول متدرج حتى الآن إلى المجتمع البحثي. هنا ، يتم توفير اجراء مفصل لاعداد كريوفيكسيد الخلايا الملتصقة المستزرعة كطبقات أحاديه علي اغشيه نيرايد السيليكون ليتم تحليلها في ظل الظروف المبردة. وتقدم أيضا خطوه التجفيف بالتجميد بعد البروتوكول في حاله وجوب اجراء تحليل الاشعه السينية في درجه حرارة الغرفة. في حين تم استخدام البروتوكول المقترح بنجاح مع خلايا سرطان الثدي الإنسان MD-MB-2312 وتم التدليل علي تجميد التجفيف من بين أمور أخرى علي الخلايا العصبية الماوس18،20،21، ويمكن توسيعها بسهوله إلى أنواع مختلفه من الإنسان أو الخلية الحيوانية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

ولا يعرف سوي القليل جدا عن توزيع أيونات المعادن علي المستوي دون الخلوي. ومع ذلك ، فان هذه العناصر الكيميائية لها وظائف تنظيميه أساسيه والتوازن المضطرب وتشارك في مختلف الامراض. الدولة من بين الفن السنكروتروني الاشعه السينية النانو الفلورية توفير الحساسية المطلوبة والدقة المكانية لتوضيح ثنائي الابعاد (2d) وثلاثي الابعاد (3d) توزيع وتركيز المعادن داخل الخلايا بأكملها في مستوي عضيه. وهذا يفتح مجالات علميه جديده مثيره للتحقيق في دور المعادن في الفيزيولوجيا الفسيولوجية للخلية. ويعد الاعداد الخلوي اجراء رئيسيا ومعقدا في كثير من الأحيان ، ولا سيما بالنسبة للتحليل الأساسي. علي الرغم من ان تقنيات الاشعه السينية الآن علي نطاق واسع واستخدمت أساليب الاعداد المختلفة ، والدراسات قليله جدا وقد حققت في الحفاظ علي محتوي عنصري من الخلايا في أحسن الحال ، وليس بروتوكول مفصل متدرج للتعويض عن البرد وقد تم الإفراج عن الخلايا الملتصقة للاشعه السينية النانو الفلورية حتى الآن. هذا هو وصف للبروتوكول الذي يوفر اعداد الخلوية تدريجيا لكريوفيكسيشن السريع لتمكين السنكروتروني الاشعه السينية الشعاعية التحليل نانو الخلايا في حاله رطبه المجمدة عندما تتوفر بيئة المبردة ونقل. في حاله النانو-تحليل يجب ان يؤديها في درجه حرارة الغرفة ، ويتم توفير اجراء إضافي لتجميد التجفيف الاعداد الخلوي كريوفيكسيد. وقد تم استخدام البروتوكولات المقترحة بنجاح في الاعمال السابقة ، ومؤخرا في دراسة التوزيع الثنائي الابعاد والثلاثي الابعاد لمركب فلزي في خلايا سرطان الثدي.

عرض مجهر الفيديو البصرية نموذجيه من الخلايا المجمدة الرطبة MDA-ميغابايت-231 التي كانت شبه مثقف علي بولي-L-يسين المغلفة Si3ن4 ويظهردعم غشاء في الشكل 7ا. تم الحصول علي الرؤية البصرية للعينه في غرفه فراغ في وضع التفكير باستخدام المجهر الفيديو مخصصه علي الإنترنت من ID16A beamline من ESRF22. في حين يتطلب الكترون أو الاشعه السينية الناعمة المجهرية طبقه الجليد تضمين الخلية لتكون رقيقه قدر الإمكان (عاده < 0.5 μm) ، والاشعه السينية الصلبة (> 10 كيلو) لديها ميزه عمق الاختراق اعلي بكثير وترسب الجرعة المنخفضة. سمك الجليد التالي يمكن ان تكون أكبر ، عاده < 10 μm بما في ذلك الخلية بحيث الجليد تضمين الخلية هو عدد قليل ميكرون في سمك. ويمكن تقدير هذا من خلال كثافة الاشعه السينية تقاس في انتقال مقارنه مع كثافة دون العينة ، مع الأخذ بعين الاعتبار امتصاص 500 nm سميكه Si3N4 غشاء. ويمكن تحقيق هذا السمك الجليدي من خلال دليل التنقيط علي النحو المبين في هذا البروتوكول. في المنطقة حلقات نيوتن ، سمك الجليد يمكن ان يكون حتى ارق (لا يقاس).
ويبين الشكل 7باء رسم الخرائط العنصرية بالاشعه السينية للخلية الرطبة المجمدة ، مع توزيع العناصر الفسيولوجية مثل البوتاسيوم (K) ، والكبريت (ق) ، والزنك (Zn). وتمثل هذه الخرائط الكتلة المساحية العنصرية (اي الكتلة المسقطة العنصرية). وفي حين ان هذه الخرائط لم يتم القيام بها في هذه الحالة ، فانه يمكن تطبيعها من خلال تصوير تباين المراحل القائم علي الانتشار بالاشعه السينية الذي يوفر تقدير العينة المتوقعة من الكتلة23. كما ذكرت من قبل العديد من الدراسات ، ويفترض ان أيون شديد التشتت في الخلايا المحفوظة في دولتهم القريبة من السكان الأصليين ان تكون متجانسة توزيعها في جميع انحاء الخلية23،24،16. وكما هو مبين في الصور العنصرية ثنائيه الابعاد بالاشعه السينية في الشكل 7ب، فان العنصر المنضم باحكام قد وزع بالتساوي داخل الخلية ، بالمثل إلى K ، ويمثل تقديرا جيدا للتشكيل الشامل الخلوي. وكان توزيع الزنك اشاره اعلي في النواة مما كانت عليه في عصارة وحددت بوضوح النواة. ويمكن الاشاره إلى ان المناطق الصغيرة المخصبة بالزنك يمكن الكشف عنها عند الاستبانة المكانية (50 نانومتر) في المنطقة النووية.
ان النانو الموجودة في الاشعه السينية أو تلك التي سيتم بناؤها لا تستوعب بالضرورة القدرات المبردة. في هذه الحالة ، فان أفضل بديل للحصول علي صور شعاعي الاشعه السينية من الخلايا في القرارات المكانية الفرعية 100 nm هو اجراء تجميد التجفيف المنصوص عليها في هذا البروتوكول بعد يغرق-تجميد الخلية. الشكل 8a يظهر نموذجي مشرق عرض المجهر الميداني من الناتجة تجميد المجفف الرئيسية الماوس هيبوكامبال الخلايا العصبية المزروعة مباشره علي الغشاء Si3N4 . في هذه الحالة ، إذا كانت مخزنه في غرفه المجففة نظيفه ، يمكن اعداد عينات 1 − 2 أسابيع مقدما وان يلاحظ مع المجهر البصري تستقيم العادية لتسجيل المناطق ذات الاهميه. وينبغي توخي الحذر لمنع التعرض للرطوبة المحيطة لأنه قد يتم الاستيلاء عليها بواسطة العينة المجففة بالتجميد وتؤدي إلى تلف تحت الاشعه السينية نانوبي. تم تطبيق هذا الاجراء بنجاح علي الخلايا الحساسة جدا (اي الخلايا العصبية) وتم الحصول علي نتائج أفضل مع أنواع أخرى أكثر قوه من الخلايا ، مثل الخلايا السرطانية. اما بالنسبة للخلايا المجمدة ، فان صور الاشعه السينية من K و S و Zn علي كامل عرض الخلية المجففة تشبه تلك المذكورة أعلاه. وهي تمثل التوزيعات العنصرية التي يمكن العثور عليها في أنواع مختلفه من الخلايا المجففة بالتجميد باستبانة مكانيه بدقه 50 − 100 نانومتر. في حين تجميد التجفيف الخلايا الكاملة هو بديل للحفاظ علي سلامه عنصري ، فمن علي حساب الحفاظ علي الكمال من الشكل الخلية16، وخاصه اغشيه الخلايا.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> الشكل 1: نموذج الدعم النموذجي للاشعه السينية لتحليل النانو. دعم الغشاء Si3N4 في الكبسولة الواقية. ويمكن استخدام هذا النوع من الركيزة علي حد سواء لتحليل درجه حرارة الغرفة (يغرق تجميد اعداد الخلوية تليها درجه حرارة منخفضه وانخفاض فراغ تجميد التجفيف عمليه) أو لتحليل المبردة الاشعه السينية الفلورية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> الشكل 2: عرض تخطيطي للنوافذ نيرايد السيليكون بعد بذر الخلية. يتم استزراع الخلايا مباشره علي السطح المسطح بولي-L-ليسين المغلفة لدعم الغشاء Si3N4 . في بعض الأحيان يمكن ان تكون المحاصرين فقاعات الهواء في تجويف المؤخر لدعم الغشاء Si3ن4 ويجب ازالتها كما هو موضح في البروتوكول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> الشكل 3: في المنزل وضعت 3D المطبوعة البرد مربع للتخزين علي المدى الطويل من يغرق المجمدة Si3N4 غشاء يدعم في ديوار النيتروجين السائل. (ا) صندوق التبريد المفكك مع الحاوية والاغطيه (الجزء السفلي) و (ب) صندوق التبريد المجمع مع قبعات مقفله. يمكن التلاعب القبعات مع ملاقط ، فتح أو قفل بالتناوب. تتوفر خطه مفصله للطباعة ثلاثية الابعاد عند الطلب من ESRF ID16A. وقد تم تصميم لاستيعاب شبكات السيليكون نيتريد TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> الشكل 4: التنقيط من الخلايا المستزرعة علي Si3N4. قبل يغرق-تجميد الخلية أحاديه الطبقة المستزرعة علي الغشاء Si3N4 يحتاج إلى شطف في محلول خلات الأمونيوم (ا) وبعناية يدويا باستخدام ورقه فلتر (ب). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> الشكل 5: التلقائي يغرق تجميد الام-GP الجهاز. (ا) يغرق الفريزر التلقائي. (ب) الغرفة البيئية مع ملاقط مقفله في. (ج) كوب الإيثان المغطي بالتسييل لأيكا المتصل بزجاجه الإيثان. (د) الضميمه المبردة التي تظهر الكوب الأسود الكامل من الإيثان المسال وصندوق التبريد لمزيد من التخزين في LN2 من الاغشيه Si3N4 اللاذعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> الشكل 6: عينه كريوترانسفير تجميع لاجراء تجميد التجفيف. (ا) المتلقي النحاس الأول ل Si3N4 الاغشيه هي التي شنت علي راس العينة حامل النقل المقدمة من قبل المورد تجميد مجفف. (ب) و (ج) تبين ان القرص النحاسي المسطح الثاني يستخدم كغطاء ويعمل كالضميمه الباردة لادراجها في الضميمه فراغ من مجفف تجميد. (د) التجميع الكامل مع قضيب النقل المحمل بالزنبرك. (ه) يجب أضافه حامل العينة الذي يحمل الاعداد الخلوي اللاذع المزروع علي غشاء Si3N4 في مجفف التجميد المبرد LN2. يتم اجراء كافة الخطوات لتركيب التجميع في LN2 في مربع الستايروفوم. للتوضيح ، تم إنتاج جميع الصور في غياب LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> الشكل 7: صور فلورية بالاشعه السينية لخليه رطبه مجمده باستخدام القرص الصلب للاشعه السينية النانويه. (ا) العرض النموذجي علي الإنترنت في وضع الانعكاس باستخدام مجهر الفيديو البصري المخصص ل ESRF ID16A beamline. بعد التنقيط اليدوي ، تم تحقيق سماكه الجليد الاجماليه من حوالي 5 − 10 ميكرومتر التي تسمح برؤية واضحة للخلايا الرطبة المجمدة. منطقه مع نيوتن حلق دلاله من حتى كثير ارق جليد ملحوظة. (ب) التوزيعات الخلوية بالاشعه السينية التمثيلية للعناصر الفسيولوجية البوتاسيوم (K) ، والكبريت (ق) ، والزنك (Zn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> الشكل 8: صور الاشعه السينية للخلايا العصبية المجففة بالتجميد باستخدام القرص الصلب للاشعه السينية النانويه. (ا) عرض المجهر الميداني الساطع النموذجي للخلايا العصبية القشرية الاوليه الناتجة عن التجميد التي تم استزراعها مباشره علي الغشاء Si3N4 . شريط مقياس = 200 μm (ب) درجه حرارة الغرفة التمثيلية الصور الشعاعية الاشعه السينية من الخلايا العصبية هيبوكامبال المجففة واحده تظهر توزيعات العناصر الفسيولوجية البوتاسيوم (K) ، والكبريت (ق) ، والزنك (Zn). شريط مقياس = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

ويرد هنا بروتوكول لثقافة الخلية علي الاغشيه نيتريد السيليكون ويغرق-تجميد قبل التصوير الشعاعي الاشعه السينية مع السنكروتروني المبردة الاشعه السينية نانوسبر. عندما يتم توفير درجه حرارة الغرفة فقط نانو التحليل ، يمكن ان تكون العينات المجمدة مزيد من التجميد المجفف. هذه هي الخطوات الحاسمة للحصول علي معلومات حول تكوين عنصري داخل الخلايا.

ثقافة الخلية علي اغشيه نيرايد السيليكون والتعويض عن البرد لل Synchrotron الاشعه السينية الفلورية نانو-تحليل

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

المصممة حديثا سينكروترون الأشعة السينية الفلوريسنس نانو تحقيقات تسمح التصور من التوزيع عنصري لعينة. استخدام النهج المبردة إلزامي لإبطاء الأضرار الإشعاعية بالأشعة السينية. ولذلك، فإن التبريد السريع ضروري للحصول على الخلايا المائية المجمدة لتحسين الحفاظ على بنية الخلية وسلامتها الكيميائية.خصوصية الاستعدادات الخلوية لدراسات السنكروترون تؤدي إلى تحسين هذا البروتوكول للحصول على monolayers الخلية المرطبجة المجمدة. العرض التوضيحي المرئي مهم لفهم كيفية التعامل مع عينات أحادية الطبقة الخلية لتحقيق خلايا مُكَرَبة مُكَرَبة مُضمنة ضمن طبقة رقيقة من الجليد. لإعداد دعم غشاء نيتريد السيليكون، افتح الكبسولة التي تحتوي على دعم الغشاء وضغط بلطف على الكبسولة لتخفيف الدعم بخفة.استخدام ملاقط رقيقة لفهم زاوية واحدة من إطار السيليكون مع الحرص على عدم لمس غشاء نيتريد السيليكون في وسط الإطار ووضع الإطار في طبق بيتري كشف في مجلس الوزراء تدفق لارينار. ثم تعقيم الأشعة فوق البنفسجية الغشاء لمدة 25 إلى 30 دقيقة. في نهاية التعقيم، إضافة 10 ميكرولترات من عامل المرفق مثل بولي-L-ليسين.احتضان لمدة 25 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. ثم ملء آبار صفيحة 48-جيدا مع 200 إلى 250 ميكرولتر من 0.22 ميكرومتر تصفية المياه نقية جدا و ultras ultra ونقية في كل بئر. استخدام ملاقط غرامة لغمر بعناية الغشاء عموديا مع ثلاثة شطف متتالية 10 ثانية في بئر واحدة من الماء.بعد الشطف، ضع الغشاء عموديا في بئر فارغة من صفيحة 96-جيدا عقيمة تحت غطاء محرك التدفق الفاتن واتركه بين عشية وضحاها حتى يجف. لبذات الخلايا من الفائدة، وضع الغشاء المغلفة مع الجانب المسطح التي تواجه في بئر واحد من لوحة أربعة-بئر عقيمة. إضافة خمس مرات 10 إلى الخلايا الأربع في 10 ميكرولترات من متوسطة مناسبة للثقافة إلى سطح غشاء نيتريد السيليكون دون لمس الغشاء.وينبغي أن القطرة تغطي الغشاء بأكمله. ثم زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. عندما بدأت الخلايا في التعلق بالركيزة ، أضف ببطء ملليلتر واحد من المتوسط الكامل للثقافة أسفل جدار كل بئر يغطي كل غشاء.ثم زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. للتبريد من إعداد الخلوية، أولا بدوره على الفريزر يغرق التلقائي وملء العدد المناسب من الآبار في لوحة بلاستيكية 12-جيدا مع 37 درجة مئوية الأمونيوم خلات العازلة. مباشرة قبل الشطف والغطس تجميد الغشاء، وإزالة العينة من الحاضنة واستخدام حلقة المشبك الأسود من زوج من ملاقط الإفراج السريع لفتح ملاقط.استخدام ملاقط مقفلة لفهم دعم الغشاء وتزج الغشاء عموديا داخل محلول العازلة خلات الأمونيوم لمدة خمس ثوان تقريبا. لإزالة أي العازلة الزائدة، اضغط على الجزء السفلي من دعم الغشاء على ورقة التصفية ولطخة كل جانب من الإطار على ورقة التصفية دون السماح للغشاء للمس ورقة. عندما تم إزالة العازلة الزائدة، وفتح باب غرفة البيئية، حرك بسرعة الملاقط في تعشيق ملقط، وإغلاق باب الغرفة.اضغط على لطخة هبوط. الملاقط التي تحمل غشاء نيتريد السيليكون سوف تغرق بسرعة في cryogen. بعد الغطس تجميد، وإزالة غطاء حاوية نقل مع ملقط قبل تبريد ونقل الصحافة.سيتم نقل غشاء نيتريد السيليكون قليلا فوق الكريوجين. في حركة واحدة سريعة، والانزلاق وإمالة قليلاً ملاقط من تعشيق ملقط لجلب ملاقط مباشرة إلى فتحة فارغة من صندوق التبريد في حاوية نقل مليئة السائل النيتروجين. ثم حرر حلقة المشبك الأسود لتحرير الغشاء.لتجميد تجفيف الخلايا المتجمدة يغرق، استخدم مفتاح الروك الموجود على اللوحة الخلفية لأداة تجميد التجفيف إلى السلطة على الصك. ستظهر الشاشة الضغط على إدخال عندما تكون جاهزة لتحميل العينة. جبل السيليكون نيتريد غشاء النحاس حامل على رأس حامل نقل العينة المقدمة من المورد في حاوية تخزين البوليسترين حفظ مستوى النيتروجين السائل إلى حوالي 1-2 ملليمتر تحت الحافة العليا من أول قطعة النحاس.وضع الغشاء مع الجانب عينة الخلية التي تواجه في تجويف حامل النحاس المرقم وpre-cool قضيب نقل في مربع رغوة البوليسترين السائل مملوءة بالنيتروجين. استخدام قضيب لقفل في التجمع الكامل، اضغط على دخول لكسر الفراغ للافراج عن غطاء غرفة مجفف تجميد، ونقل على الفور العينة في غرفة مجفف تجميد، وإغلاق غطاء غرفة مجفف تجميد. ثم اضغط على الفور ابدأ في الاستمرار في دورة التجفيف تجميد.في نهاية دورة التجفيف تجميد، اضغط على وقف لتنفيس الغرفة وإزالة التجمع الكامل للوصول إلى عينات تجميد المجففة. هنا عرض نموذجي مجهر الفيديو البصرية من خلايا خلية سرطان الثدي المجمدة خلية فرعية استزراع على بولي-L-ليسين المغلفة السيليكون نيتريد دعم غشاء كما هو مبين. يكشف رسم خرائط الفلوراسين الشعاعي بالأشعة السينية للخلايا المرطبية المجمدة عن توزيع العناصر الفسيولوجية مثل البوتاسيوم والكبريت والزنك.في هذا المثال التمثيلي، تم توزيع عنصر الكبريت المقيد بإحكام داخل الخلية في نمط مماثل لذلك الملاحظ للبوتاسيوم ويمثل تقديرًا جيدًا لملف تعريف الكتلة الخلوية. ومع ذلك، أظهر توزيع الزنك إشارة أعلى داخل النواة مما هو عليه في السيتوسول مع فصل محدد بوضوح للإشارة بين السيتوسول ونواة. في هذا العرض المجهري النموذجي لـ Brightfield من الخلايا العصبية فرس النهر الأولية المجففة بالتجميد المستزرعة مباشرة على غشاء نيتريد السيليكون كما هو موضح ، تظهر الخلايا مورفولوجيا عصبية نموذجية لا تتأثر بثقافتها أو طريقة الحفظ.كما يكشف التصوير المفلور بالأشعة السينية للخلايا المجمدة من توزيعات عنصرية نموذجية كما تظهرها هذه الخلايا المجففة بالتجميد التمثيلية بدقة مكانية من 50 إلى 100 نانومتر. رسم نافذة نيتريد السيليكون أمر بالغ الأهمية للحصول على أنحف طبقة الجليد ممكن من الخلايا بعد الغطس تجميد. الحفاظ على السلامة الكيميائية للخلايا على المستوى دون الخلوية يسمح للمعادن من الخلايا التي يمكن استكشافها مع مسابير نانو السنكروترون وكذلك مع تقنيات أخرى microanalytical.كما لا يمكن إجراء كل تحليل المسبار النانوي السنكروترون في درجة حرارة المبردة، يمكن أن تكون الخلايا المائية المجمدة مزيد من تجميد المجففة لتسهيل تحليلها في درجة حرارة الغرفة. تذكر أن تستخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة عند العمل مع النيتروجين السائل واستخدام غاز الإيثان دائمًا في غطاء الدخان بعيدًا عن اللهب.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

على الانترنت الحجم الاستبعاد والتبادل الأيوني اللوني على SAXS خط الأشعة

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

الحجم الذري الدراسات الهيكلية للتجميعات الجزيئات بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي الصلبة

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

الجمع بين علم البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية نموذج المناطق غير منظم من Nsa1 من سيريفيسيا س.

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

وصف جليكوبروتينس مع حظيرة الغلوبولين المناعي علم البلورات بالأشعة السينية والتقنيات الفيزيائية الحيوية

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

الدراسات الهيكلية "للجزيئات الكبيرة" في الحل باستخدام "تبعثر الأشعة السينية زاوية صغيرة"

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

حامل عينة الكل في واحد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع الحد الأدنى من تشتت الخلفية

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

التصوير البلوري بالأشعة السينية لدراسة انتقال الدولة أوليغومريك من Thermotoga maritima M42 أمينوببتيداسي TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

القياسات القائمة على الفلورسينس من فوسفاتيديلسيرين / فوسفاتيديلينوزيتول 4-تبادل الفوسفات بين الأغشية

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

مجموعة بيانات تسلسلية هدف ثابت في مصدر ضوء الماس

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...