Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Forsøgene på nano-Imaging strålinger ID16A blev udført inden for rammerne af ESRF-forslag LS2430, LS2303 og LS2765.

<ol>
	<li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage/genotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors.">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li><li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging.">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li><li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , (2000).</li><li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity,+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions,+and+down+regulation+of+MAO-B.">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li><li>Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+low+calcium+concentrations+in+cryosectioned+cells+by+parallel-EELS+mapping.">Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping.</a> Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).</li><li>Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+scanning+electron+microscopy+to+X-ray+analysis+of+frozen+hydrated+sections.+I.+Specimen+handling+techniques.">Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques.</a> Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).</li><li>Saubermann, A. J., Heyman, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections.">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, 169-182 (1987).</li><li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells.">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1875-1882 (1984).</li><li>Wroblewski, J., M&#252;ller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+X-ray+microanalysis+of+semi-thick+cryosections.">Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections.</a> Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).</li><li>Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreparation+of+mammalian+tissue+for+X-ray+microanalysis+in+STEM.">Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM.</a> Journal of Microscopy. 125, 149-156 (1982).</li><li>Harkiolaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-soft+X-ray+tomography:+Using+soft+X-rays+to+explore+the+ultrastructure+of+whole+cells.">Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).</li><li>McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+X-ray+tomography+and+cryogenic+light+microscopy:+the+cool+combination+in+cellular+imaging.">Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).</li><li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy.">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).</li><li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MISTRAL:+a+transmission+soft+X-ray+microscopy+beamline+for+cryo+nano-tomography+of+biological+samples+and+magnetic+domains+imaging.">MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).</li><li>Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+tomography+of+adherent+cells+at+European+synchrotrons.">Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons.</a> Methods in Cell Biology. 124, 151-175 (2014).</li><li>Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+single+cell+quantitative+elemental+imaging+using+proton+or+synchrotron+radiation+focused+beams.">Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+elemental+content+in+adherent+mammalian+cells+for+analysis+by+synchrotron-based+x-ray+fluorescence+microscopy.">Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+manganese+on+primary+hippocampal+neurons+from+rodents.">Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents.</a> Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+Cytotoxicity+Assay+on+Hippocampal+Neuronal+Cell+Culture.">Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture.</a> Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).</li><li>Gibon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+over-expression+of+TRPC6+channels+in+HEK-293+cells+favours+the+intracellular+accumulation+of+zinc.">The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).</li><li>Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Uptake+and+Storage+During+the+Formation+of+the+Cerebral+Cortex+in+Mice.">Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice.</a> Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).</li><li>Villar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopositioning+for+the+ESRF+ID16A+Nano-Imaging+Beamline.">Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline.</a> Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).</li><li>Kosior, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+hard+X-ray+phase+contrast+imaging+and+X-ray+fluorescence+microscopy+for+subcellular+metal+quantification.">Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification.</a> Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).</li><li>Bohic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrotron+hard+X-ray+microprobe:+fluorescence+imaging+of+single+cells.">Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells.</a> Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Development+of+Electron+Cryo-Microscopy+(Nobel+Lecture).">On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture).</a> Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).</li><li>Da Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+concentration+of+high-energy+X-rays+for+diffraction-limited+imaging+resolution.">Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution.</a> Optica. 4 (5), 492-495 (2017).</li><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high-pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+pratice+of+high+pressure+freezing.">Theory and pratice of high pressure freezing.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrarapid+freezing+for+the+preservation+of+cellular+ultrastructure.">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).</li><li>Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryo-Tomography.">Electron Cryo-Tomography.</a> Cellular Imaging. , 61-94 (2018).</li><li>Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+metal+content+and+intracellular+distribution+in+primary+hippocampal+neurons+with+synchrotron+X-ray+fluorescence.">Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence.</a> PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).</li><li>Vavpeti&#269;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+distribution+and+sample+integrity+comparison+of+freeze-dried+and+frozen-hydrated+biological+tissue+samples+with+nuclear+microprobe.">Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).</li><li>Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-preparation+procedures+for+elemental+imaging+by+sims+and+eftem.">Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem.</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 499-536 (2008).</li><li>Gramaccioni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+quantification+of+intracellular+element+concentration+by+X-ray+fluorescence+microscopy+combined+with+X-ray+phase+contrast+nanotomography.">Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography.</a> Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).</li><li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+and+Copper+Effects+on+Stability+of+Tubulin+and+Actin+Networks+in+Dendrites+and+Spines+of+Hippocampal+Neurons.">Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons.</a> ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).</li><li>Ortega, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+over-expression+induces+increased+iron+accumulation+and+redistribution+in+iron-exposed+neurons.">&#945;-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).</li><li>Fartmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+atomic+and+molecular+species+in+cancer+cultures+with+TOF-SIMS+and+Laser-SNMS.">Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS.</a> Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).</li><li>P&#229;lsg&#229;rd, E., Lindh, U., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+freeze-substitution+techniques+for+X-ray+microanalysis+of+biological+tissue.">Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue.</a> Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Cryo-Electron mikroskopi (Cryo-EM) vandt 2017 Nobelprisen i kemi og som sådan udvikling foretaget af J. dubochet om forvitning af biologisk materiale til højopløsnings struktur bestemmelse af biomolekyler i opløsning25. Som rapporteret af Dubochet i hans nobel forelæsning "at vide, hvordan man vitrify en dråbe vand er én ting, forbereder en biologisk prøve for biologisk observation er en anden"25. Cryopreparation trin er nu betragtes som standard teknik til at afbøde strålingsdosis skader og studere celler tæt på deres oprindelige tilstand. Forberedelsen er dog stadig kedelig. Dette skyldes elektronmikroskopi, på grund af sin uovertruffen rumlig opløsning, er følsom over for enhver ultrastrukturel artefakt, der opstår under prøven forberedelse. Synchrotron cryonanopkåber nærmer sig nu lignende vanskeligheder, der går ned til rumlige opløsninger så lavt som 13 nm i den høje energi X-ray Range26. Hård røntgen mikroskopi kan analysere hele celler, mens elektronmikroskopi lider under den dårlige indtrængningsdybde af elektroner, der kun gør det muligt at iagttage meget tynde celle skiver.
Monolayers af celler er tynde nok, så ved dybfrysning i flydende Ethan opnås de nødvendige afkølingshastigheder for vand vitrifikation. I teorien, køling satser så højt som 108 K/s er muligt ved hjælp af højtryks frysning27 som tillader forglasning af prøver for tyk til springet frysning. En afkølingshastighed på 105 K/s, der kræves for at muliggøre fuld vitrifikation af prøven ved omgivende Tryk28, opnås reproducerbart ved hjælp af den automatiske dybfrysnings maskine og de parametre, som præsenteres her. Dette giver en forsker til at vitrify tynde biologiske prøver (< 10 μm) såsom en enkeltlags af celler12,13,14,15,29,30 ved springet-frysning i flydende Ethan.
En vigtig udfordring med denne protokol er også at bevare så meget som muligt den kemiske integritet af det intracellulære indhold for at give pålidelige elementært distributioner i cellen i 2D eller 3D. Som offentliggjort andetsteds2,16,17,31, i tilfælde af elementær billeddannelse på subcellulært niveau, bør analysen af frosne hydrerede celler overvejes. Ellers kan kombinationen af dykfrysning og frysetørring af celler anvendes til rumtemperatur analyse. For sidstnævnte, den amorfe is fjernes gennem processen med Sublimation, mens de bundne vandmolekyler fjernes gennem processen med desorption. Denne proces kan være langt fra ideel i forhold til frosne hydrerede prøver på grund af den mulige ændring af de cellulære membraner og morfologien af nogle subcellulære strukturer32. Også, for artsbestemmelse undersøgelser, vand udvinding kan føre til metal artsbestemmelse artefakter. Stadig, det har været en succes og det bedste alternativ til frosne hydrerede prøver for elementær billeddannelse på sub-100 nm niveauer2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Som det er blevet rapporteret37, kvaliteten af kryopræserverede cellulære præparater kan evalueres gennem kalium-til-natrium K/na ratio. Desværre kan det endnu ikke bestemmes med den hårde røntgen-nanoprobe, der anvendes her, på grund af den lave energi cut-off af Silicon drift detektor anvendes til at detektere røntgenstråler fluorescens fotoner af elementerne (E ≥ 1,3 keV magnesium). Faktisk en høj K/na ratio (> 10), der kan måles ved hjælp af TOF-Sims, EPMA, eller nuklear mikroprobe pixe16,37 er en indikation af den bevarede kemiske integritet af cellen i forhold til den forventede K/na af 25 i en levende celle37. Dette kan understøttes af et samtidigt lavt CL/K-forhold38. Stadig, ufuldkommen forvitrifikation, især hvis hastigheden af prøven afkøling er for lav, kan føre til dannelsen af store iskrystaller, der kan beskadige cellemembraner og organeller, dermed ændre fordelingen af kemiske elementer. Selv om der ikke er nogen rutine procedure for at overvåge denne potentielle skade og indvirkning på den intracellulære fordeling, de ovennævnte elementært nøgletal og muligheden for at billedet cellen ved høj opløsning ved hjælp af røntgen fasekontrast eller Cryo-Soft røntgen mikroskopi kan være de bedste tilgange til at støtte god bevaring af intracellulære rum med samtidig bevarelse af elementært integritet. Kombinationen af disse teknikker og brugen af nyudviklede kryocorrelative fluorescens optiske mikroskoper vil hjælpe med at vurdere, i hvilket omfang denne skade opstår og påvirker den intracellulære elementale fordeling.
Samlet set præsenteres en detaljeret og omfattende protokol til forberedelse af cellulære prøver for Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse. Det er et godt udgangspunkt for forskersamfundet, der hjælper med at løse det vanskelige spørgsmål om, hvordan man forbereder passende cellulære prøver til 2D og 3D elementært Imaging på (Cryo) hårde X-ray nanopkåber. Disse tilgange kan fusioneres med optisk fluorescens og elektronmikroskopi kapaciteter til dybtgående korrelativ kemisk og strukturel billeddannelse af celler.

Nydesignet Synchrotron røntgen fluorescens (SR-XRF) nanopkåber tillader visualisering af den subcellulære fordeling af elementer i en fuldt kvantitativ måde. Som et eksempel, denne analytiske kapacitet tillader undersøgelse af optagelsen af nanopartikler1 eller organometalliske molekyler såsom osmium-baserede komplekser2, giver indsigt i den intracellulære optagelse af metal-baserede molekyler med potente anticancer egenskaber. Som en multielement teknik, SR-XRF3 med en nanoprobe giver en måde at samtidig kvantificere og lokalisere intracellulært mest biologisk vigtige elementer, herunder fosfor, svovl, kalium, calcium, jern, kobber, og zink. Faktisk, brugen af hårde røntgenstråler giver stor penetration dybde til billede hele frosne-hydrerede celler i en etiket-fri mode. Desuden, giver adgang til K-kanten af de fleste elementer af interesse, røntgenstråler Fluorescens er spændt mest effektivt. Brugen af kryogene tilgange tillader reduktion af strålingsskader og optimering af bevarelsen af cellestrukturen og elementær distribution.
De fleste tilgængelige rumligt løste analytiske teknikker til at studere metaller i celler er overflade teknikker, der kræver meget tynde og flade sektioner af celler, der skal produceres. Dette omfatter primært scanning transmission elektronmikroskopi med energi-dispersive røntgen analyse (Stem-EDX), energi-filtreret transmission elektronmikroskopi (EF-tem), og nanoskala sekundær ion massespektrometri (nanosims). Sidstnævnte kan ikke udføres på frosne, hydrerede celle sektioner, mens Cryo-analyse kan gøres med elektronmikroskopi med uovertruffen rumlig opløsning, men dårlig elementær følsomhed. Partikel induceret røntgen emission (PIXE) har gjort det muligt at studere elementær distributioner i hele celler. Det har fordelen af at være fuldt kvantitativ med en rimelig elementær følsomhed på micron skalaen og selv ved submikron resolution4, men lider af strålingsskader og mangel på kryogene kapaciteter til at studere frosne-hydrerede celler. Alle disse analytiske teknikker supplerer hinanden i elementær billeddannelse af celler, men for alle teknikker er prøveforberedelsesproceduren et afgørende skridt. Det bør holdes enkelt at begrænse eventuel kontaminering samt elementær omfordeling og/eller lækage for at opnå meningsfulde resultater. Som påvist i elektronmikroskopi, en kryogen arbejdsgang, herunder Cryo-immobilisering af cellen og kryooverførsel til en kryoscanning fase, tillader en optimal elementær bevaring på subcellulære niveauer så tæt som muligt på den indfødte tilstand5,6,7,8,9,10. Denne forståelse er blevet implementeret med succes i udviklingen af Synchrotron Cryo-Soft røntgen mikroskopi (f. eks. fuld felt mikroskoper og scannings mikroskoper) for at producere ultrastrukturel billeddannelse af hele frosne-hydrerede celler i 2D eller 3D. Der blev udviklet forskellige kryogene arbejdsprocesser11 for bløde røntgen mikroskoper på strålinger 2,1 (Xm-2) af den avancerede lyskilde på Lawrence Berkeley National Laboratory12, strålinger U41-XM på elektron lagrings ringen Bessy II (Tyskland)13, strålinger MISTRAL af Alba Light source (Spanien)14, og på strålinger B24 af diamant lyskilden15, blandt andre. En lignende Workflow blev for nylig vist sig at være den mest pålidelige forberedelse og bevaring metode til intracellulære elementært analyse ved hjælp af X-ray microprobes16,17.
Selv om X-ray nanoprobe teknikker er begyndt at blive udbredt til cellulær elementær analyse, især med fremkomsten af Cryogen SR-XRF kapaciteter, ingen trinvis protokol er blevet formidlet indtil videre til forskersamfundet. Her er der en detaljeret procedure for at forberede kryofaste klæbriste celler, der dyrkes som monolag på silicium nitrid membraner til at blive analyseret under kryogene forhold. Et frysetørret trin, der skal anvendes efter protokollen i tilfælde af røntgen analyse skal udføres ved stuetemperatur er også forudsat. Mens den foreslåede protokol er blevet anvendt med succes med humane brystkræft celler MD-MB-2312 og frysetørring blev demonstreret blandt andre på mus neuroner18,20,21, det kan nemt udvides til forskellige typer af humane eller animalske celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

Meget lidt vides om fordelingen af metalioner på subcellulært niveau. Disse kemiske elementer har imidlertid væsentlige reguleringsfunktioner, og deres forstyrrede homøostase er involveret i forskellige sygdomme. State-of-the-art Synchrotron X-ray fluorescens nanopkåber giver den nødvendige følsomhed og rumlig opløsning til at belyse den todimensionelle (2D) og tredimensionale (3D) fordeling og koncentration af metaller inde i hele celler ved organelle niveau. Dette åbner nye spændende videnskabelige områder af undersøgelsen om rollen af metaller i fysiopatologi af cellen. Den cellulære forberedelse er en nøgle og ofte kompleks procedure, især for grundlæggende analyse. Selv om røntgen-fluorescens teknikker nu er udbredte, og der er anvendt forskellige tilberedningsmetoder, har meget få undersøgelser undersøgt bevarelsen af det elementære indhold af celler i bedste fald, og ingen trinvis detaljeret protokol til kryopreparation af overholder celler til røntgen fluorescens nanopkåber er blevet frigivet indtil videre. Dette er en beskrivelse af en protokol, der giver den trinvise cellulære forberedelse til hurtig kryofikse ring for at muliggøre Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse af celler i en frosset hydreret tilstand, når et kryogen miljø og overførsel er til rådighed. I tilfælde af Nano-analyse skal udføres ved stuetemperatur, en yderligere procedure for fryse-tørring af cryofixed klædning cellulære præparat er tilvejebragt. De foreslåede protokoller er blevet anvendt med succes i tidligere værker, senest i studiet af 2D og 3D intracellulær fordeling af en Organometallisk forbindelse i brystkræft celler.

En typisk optisk video mikroskop visning af frosne hydrerede MDA-MB-231 celler, der blev under kultiveret på en poly-L-lysin belagt si3N4 membran støtte er vist i figur 7a. Den optiske visning af prøven i vakuumkammeret blev opnået i refleksions tilstand ved hjælp af det dedikerede online video mikroskop af ID16A strålinger i ESRF22. Mens elektron eller Soft røntgen mikroskopi kræver islaget indlejring af cellen for at være så tynd som muligt (typisk < 0,5 μm), har hårde røntgenstråler (> 10 keV) Fordelen ved en meget højere indtrængningsdybde og lavere dosis deposition. Istykkelsen kan derfor være større, typisk < 10 μm inklusive cellen, således at isen indlejring cellen er et par μm i tykkelse. Dette kan anslås gennem den målte røntgen intensitet i transmissionen sammenlignet med intensiteten uden prøven, under hensyntagen til absorptionen af 500 nm tyk si3N4 membran. Denne istykkelse kan opnås gennem manuel blotting som beskrevet i denne protokol. I Newton Rings regionen kan istykkelsen være endnu tyndere (ikke målt).
X-ray fluorescens elementært kortlægning af den frosne hydrerede celle er vist i figur 7B med repræsentative fordelinger af fysiologiske elementer såsom kalium (K), svovl (S) og zink (Zn). Disse kort repræsenterer den elementale areal masse (dvs. elementær projekteret masse). Selv om det ikke er gjort i det foreliggende tilfælde, kan sådanne kort normaliseres gennem røntgen overførsels baseret fasekontrast Imaging, der giver en vurdering af den forventede masse af prøven23. Som rapporteret af mange undersøgelser, den meget diffusible K ion i celler bevaret i deres Near-Native tilstand blev antaget at være homogent fordelt i hele cellen23,24,16. Som vist i 2D X-ray fluorescens elementale billeder i figur 7B, var det tæt bundne element S jævnt fordelt i cellen, på samme måde som K, og repræsenterer et godt estimat af cellernes masse profil. Zn-distributionen havde et højere signal i kernen end i cytosol og klart skitseret kernen. Det kan konstateres, at små Zn-berigede regioner kan påvises ved den fysiske opløsning (50 nm) i det nukleare område.
De eksisterende X-ray nanopkåber eller dem, der skal bygges ikke nødvendigvis rumme kryogene kapaciteter. I dette tilfælde er det bedste alternativ til at få røntgen fluorescensbilleder af celler ved sub-100 nm rumlige opløsninger at udføre en frysetørring procedure beskrevet i denne protokol efter springet-frysning af cellen. Figur 8a viser en typisk lys felt mikroskopi visning af resulterende frysetørret primær mus hippocampus neuroner direkte dyrket på si3N4 membran. I dette tilfælde kan prøverne, hvis de opbevares i et rent udtørret kammer, forberedes 1 − 2 uger i forvejen og observeres med et almindeligt oprejst optisk mikroskop til registrering af områder af interesse. Der bør udvises forsigtighed for at undgå udsættelse for omgivende luftfugtighed, da det kan blive fanget af frysetørret prøve og føre til beskadigelse under røntgenstråle nanostrålen. Denne procedure blev anvendt med succes til meget følsomme celler (dvs., neuronal celler) og endnu bedre resultater blev opnået med andre mere robuste typer af celler, såsom kræftceller. Som for dybfrosne celler, røntgenstråler fluorescensbilleder af K, S, og Zn på hele frysetørret celle display ligner dem, der er beskrevet ovenfor. De er repræsentative for de elementale fordelinger, der findes i forskellige typer af frysetørret celler ved 50 − 100 nm rumlig opløsning. Mens frysetørring hele celler er et alternativ til at bevare elementær integritet, det er på bekostning af en perfekt bevarelse af cellen morfologi16, især cellemembraner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> Figur 1: typisk prøve støtte til røntgen-fluorescens Nano-analyse. En si3N4 membran støtte i sin beskyttende kapsel. Denne type substrat kan bruges både til rumtemperatur analyse (springet-fryse cellulære præparat efterfulgt af lav temperatur og lav vakuum fryse-tørring proces) eller til kryogen røntgen fluorescens analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk visning af silicium nitrid vinduerne efter celle såning. Cellerne dyrkes direkte på poly-L-lysin coated flad overflade af si3N4 membran støtte. Sommetider luftbobler kan være fanget i bagsiden hulrum af si3N4 membran støtte og skal fjernes som beskrevet i protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> Figur 3: in-House udviklet 3D trykt Cryo-Box til langsigtet opbevaring af springet frosne si3N4 membran støtter i flydende kvælstof Dewar. A) Cryo-box demonteres med beholderen og hætter (nedre del) og (B) den samlede kryo-boks med låste hætter. Caps kan manipuleres med pincet, åbning eller låsning ved rotation. En detaljeret plan for 3D-udskrivning er tilgængelig efter anmodning fra ESRF ID16A. Designet er lavet til at rumme silicium nitrid TEM gitre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> Figur 4: blotting af celler kultiveret på si3N4. Før dykfrysning af celle enkeltlags, der dyrkes på en si3N4 membran, skal skylles i ammonium acetat opløsning (a) og omhyggeligt manuelt blottet ved hjælp af filtrerpapir (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> Figur 5: automatisk springet-FRYSNING EM-GP maskine. (A) den automatiske dybfryser. (B) miljøkammer med pincet låst inde.C) Ethan-koppen, som er dækket med Leica liquefier tilsluttet en Ethan-flaske. D) det dybfrysende kabinet, der viser den sorte kop fuld af flydende Ethan og Cryo-boksen til yderligere opbevaring i LN2 af de vitrificerede si3N4 membraner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> Figur 6: prøve kryooverførings samling til frysetørret procedure. A) den første messing modtager til si3N4 membraner monteres oven på prøve overførings holderen, som leveres af fryse tørrer leverandøren. (B) og (C) viser, at den anden flade messing skive anvendes som et dæksel og fungerer som en kold fælde kabinet, der skal indsættes i vakuum kabinettet på fryse tørrer. D) den komplette samling med den fjederbelastede overførings stang. E) prøveholderen, der transporterer det forvilede celle præparat, der dyrkes på si3N4 -membranen, skal indsættes yderligere i den2-kølede fryse tørrer. Alle trin til montering af samlingen er udført i LN2 i en Styrofoam boks. For klarhedens skyld blev alle billederne produceret i fravær af LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> Figur 7: Cryo-røntgenstråler fluorescensbilleder af en frosset hydreret celle ved hjælp af hård X-ray nanoprobe. (A) typisk online visning i refleksions tilstand ved hjælp af det dedikerede optiske videomikroskop i ESRF ID16A beamline. Efter manuel blotting blev der opnået en samlet istykkelse på ca. 5 − 10 μm, som giver et klart over syn af de frosne hydrerede celler. En region med Newton ringe, der indikerer endnu meget tyndere is, er mærkbar. B) repræsentative Cryo-røntgen-fluorescens cellulære fordelinger af fysiologiske elementer kalium (K), svovl (S) og zink (Zn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> Figur 8: røntgen fluorescensbilleder af en frysetørret neuronal celle ved hjælp af hård x-ray nanoprobe. (A) typisk lyse felt mikroskopi visning af resulterende frysetørret primær kortikale neuronal celler direkte dyrket på si3N4 membran. Scale bar = 200 μm (B) repræsentativ rumtemperatur røntgen fluorescensbilleder af en enkelt frysetørret hippocampus Neuron, der viser Fordelingerne af fysiologiske elementer kalium (K), svovl (S) og zink (Zn). Scale bar = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Præsenteret her er en protokol for cellekultur på silicium nitrid membraner og springet-frysning forud for røntgenstråler fluorescens Imaging med en Synchrotron kryogen X-ray nanoprobe. Når kun rumtemperatur Nano-analyse er forudsat, de frosne prøver kan yderligere frysetørret. Disse er kritiske skridt til at indhente oplysninger om den intracellulære elementært sammensætning.

Cellekultur på silicium nitrid membraner og Cryopreparation for Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Nydesignede synkrotron x-ray fluorescens nano-sonder tillader visualisering af elementær fordeling af en prøve. Brugen af kryogene tilgange er obligatorisk for at bremse røntgenstråling skader. Derfor er en hurtig kryofiksation afgørende for at opnå frosne hydrerede celler for at optimere bevarelsen af cellestrukturen og dens kemiske integritet.Specificiteten af de cellulære præparater til synkrotronundersøgelser fører til optimering af denne protokol til erhvervelse af frosne hydrerede cellemonslayers. Visuel demonstration er vigtig for at forstå, hvordan man kan manipulere cellemonstratorprøverne for at opnå reproducerbare kryofikserede celler indlejret i et tyndt lag is. For at forberede en siliciumnitridmembranstøtte skal du åbne kapslen med membranstøtten og forsigtigt presse kapslen for at løsne støtten let.Brug tynde pincet til at gribe det ene hjørne af siliciumrammen og passe på ikke at røre siliciumnitridmembranen i midten af rammen og placere rammen i en udækket petriskål i et laminar flowkabinet. Derefter steriliseres membranen i 25 til 30 minutter. I slutningen af steriliseringen tilsættes 10 mikroliter af fastgørelsesfaktor som poly-L-lysin.Inkuberes i 25 minutter ved 37 grader Celsius og ved 5% kuldioxid med fugtighed. Fyld derefter brøndene på en steril 48-brøndplade med 200 til 250 mikroliter på 0,22 mikrometer filtreret ultra rent og ultrasporingsvand pr. brønd. Brug fine pincet til omhyggeligt at nedsænke membranen lodret med tre på hinanden følgende 10-sekunders skylninger i en brønd vand.Efter skylning, placere membranen lodret i en tom brønd af en steril 96-brønd plade under laminar flow hætte og lad det natten over, indtil tør. Til såning af celler af interesse, placere den belagte membran med den flade side vender opad i en brønd af en steril fire-brønd plade. Der tilsættes fem gange 10 til de fire celler i 10 mikroliter af et passende kulturmedium til overfladen af siliciumnitridmembranen uden at røre membranen.Dråben skal dække hele membranen. Derefter kultur cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid med fugtighed. Når cellerne er begyndt at binde sig til substratet, langsomt tilføje en milliliter komplet kultur medium ned væggen i hver brønd, der dækker hver membran.Derefter kultur cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid med fugtighed. For kryoimmobilisering af cellulære forberedelse, først tænde en automatisk springet fryser og fylde det passende antal brønde i en 12-brønd plastplade med 37 grader Celsius ammoniumacetat buffer. Umiddelbart før skylning og frysning af membranen, skal du fjerne prøven fra inkubatoren og bruge den sorte klemmering af et par hurtige slip pincet til at låse pincet.Brug de ulåste pincet til at gribe membranstøtten og nedsænke membranen lodret i ammoniumacetatbufferopløsningen i ca. fem sekunder. For at fjerne overskydende buffer skal du trykke bunden af membranstøtten på filterpapir og skamplet hver side af rammen på filterpapiret uden at lade membranen røre papiret. Når den overskydende buffer er fjernet, skal du åbne miljøkammerdøren, hurtigt skubbe pincet ind i pincet låsen, og luk døren til kammeret.Tryk på blot Et springet. Pinceterne, der holder siliciumnitridmembranen, vil hurtigt blive kastet ud i kryogenet. Efter frysning af styrtdyk fjernes låget på overførsbeholderen med forkølede scefæcef, og tryk på overførslen.Siliciumnitridmembranen vil blive flyttet lidt over kryogen. I en hurtig enkelt bevægelse, glide og lidt vippe pincet ud af pincet låse for at bringe pincet direkte ind i en tom slot af kryoboksen i overførselsbeholderen fyldt med nitrogen væske. Slip derefter den sorte klemmering for at frigøre membranen.Til frysetørring af de dybfrosne celler skal du bruge den vippekontakt, der er placeret på frysetørringsinstrumentets bagpanel, til at tænde for instrumentet. Displayet viser tryk enter, når du er klar til at indlæse prøven. Sæt siliciumnitridmembran messingholderen på toppen af prøveoverførselsholderen, som leverandøren har leveret i polystyrenbeholderen, og væskens indhold skal holde niveauet af flydende nitrogen på ca. en til to millimeter under den øverste kant af det første messingstykke.Membranen med celleprøvesiden vender opad i messingholderens nummererede hulrum, og afkøl overførselsstangen for at være forkøl i en flydende nitrogenfyldt polystyrenskumkasse. Brug stangen til at låse i hele samlingen, tryk ind for at bryde vakuum for at frigøre låget af frysetørrerkammeret, overfør straks prøven i frysetørrerkammeret, og luk frysetørrerkammerets låg. Tryk derefter straks på start for at fortsætte med frysetørringscyklussen.Ved afslutningen af frysetørringscyklussen skal du trykke på stop for at udlufte kammeret og fjerne hele samlingen for at få adgang til de frysetørrede prøver. Her en typisk optisk video mikroskop opfattelse af frosne hydreret brystkræft cellelinje celler subkultureret på en poly-L-lysin belagt silicium nitride membran støtte som vist er vist. Røntgenfluorescens elementær kortlægning af de frosne hydrerede celler afslører fordelingen af fysiologiske elementer såsom kalium, svovl og zink.I dette repræsentative eksempel blev det tætbundne svovlelement jævnt fordelt i cellen i et mønster, der svarede til det, der blev observeret for kalium, og repræsenterer et godt skøn over den cellulære masseprofil. Zinkfordelingen udviste imidlertid højere signal i kernen end i cytosolen med en klart defineret adskillelse af signalet mellem cytosolen og kernen. I denne typiske Brightfield mikroskopi opfattelse af frysetørret primær mus hippocampal neuroner direkte dyrket på en silicium nitril membran som påvist, cellerne udviser en typisk neural morfologi, der er upåvirket af deres kultur eller konservering metode.Røntgenfluorescensbilleddannelse af dybfrosne celler afslører også typiske elementære fordelinger som udstillet af disse repræsentative frysetørrede celler ved en 50 til 100 nanometer rumlig opløsning. Plotning af siliciumnitridvinduet er afgørende for at opnå det tyndeste mulige ilag af celler efter dybfrysning. Bevarelse af cellernes kemiske integritet på det subcellulære niveau gør det muligt at udforske cellernes metallome med synkrotronnanosonder samt med andre mikroanalytiske teknikker.Da ikke alle synchrotron nano-sonde analyse kan udføres ved kryogen temperatur, de frosne hydrerede celler kan frysetørres yderligere for at lette deres analyse ved stuetemperatur. Husk at bruge passende personlige værnemidler, når du arbejder med flydende nitrogen, og brug altid ethangas i en røghætte væk fra flammerne.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Online Size-udelukkelse og ionbytningskromatografi på en SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomar skala strukturelle undersøgelser af makromolekylære forsamlinger af Solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombinere røntgenkrystallografi med lille vinkel X-Ray spredning til Model ustruktureret regioner af Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin Fold af røntgenkrystallografi og biofysiske metoder

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle undersøgelser af makromolekyler i løsning ved hjælp af små vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En all-in-One-prøve holder til makromolekylær røntgenkrystallografi med minimal baggrunds spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray krystallografi at studere oligomeric stat Overgang af Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Fluorescensbaserede målinger af fosfatylserin/Fosfatylinositol 4-fosfatudveksling mellem membraner

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Fast target seriel dataindsamling på Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...