Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

De experimenten op de nano-Imaging beamline ID16A werden uitgevoerd in het kader van ESRF-voorstellen LS2430, LS2303 en LS2765.

<ol>
	<li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage/genotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors.">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li><li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging.">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li><li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , (2000).</li><li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity,+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions,+and+down+regulation+of+MAO-B.">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li><li>Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+low+calcium+concentrations+in+cryosectioned+cells+by+parallel-EELS+mapping.">Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping.</a> Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).</li><li>Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+scanning+electron+microscopy+to+X-ray+analysis+of+frozen+hydrated+sections.+I.+Specimen+handling+techniques.">Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques.</a> Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).</li><li>Saubermann, A. J., Heyman, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections.">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, 169-182 (1987).</li><li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells.">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1875-1882 (1984).</li><li>Wroblewski, J., M&#252;ller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+X-ray+microanalysis+of+semi-thick+cryosections.">Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections.</a> Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).</li><li>Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreparation+of+mammalian+tissue+for+X-ray+microanalysis+in+STEM.">Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM.</a> Journal of Microscopy. 125, 149-156 (1982).</li><li>Harkiolaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-soft+X-ray+tomography:+Using+soft+X-rays+to+explore+the+ultrastructure+of+whole+cells.">Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).</li><li>McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+X-ray+tomography+and+cryogenic+light+microscopy:+the+cool+combination+in+cellular+imaging.">Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).</li><li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy.">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).</li><li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MISTRAL:+a+transmission+soft+X-ray+microscopy+beamline+for+cryo+nano-tomography+of+biological+samples+and+magnetic+domains+imaging.">MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).</li><li>Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+tomography+of+adherent+cells+at+European+synchrotrons.">Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons.</a> Methods in Cell Biology. 124, 151-175 (2014).</li><li>Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+single+cell+quantitative+elemental+imaging+using+proton+or+synchrotron+radiation+focused+beams.">Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+elemental+content+in+adherent+mammalian+cells+for+analysis+by+synchrotron-based+x-ray+fluorescence+microscopy.">Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+manganese+on+primary+hippocampal+neurons+from+rodents.">Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents.</a> Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+Cytotoxicity+Assay+on+Hippocampal+Neuronal+Cell+Culture.">Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture.</a> Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).</li><li>Gibon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+over-expression+of+TRPC6+channels+in+HEK-293+cells+favours+the+intracellular+accumulation+of+zinc.">The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).</li><li>Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Uptake+and+Storage+During+the+Formation+of+the+Cerebral+Cortex+in+Mice.">Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice.</a> Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).</li><li>Villar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopositioning+for+the+ESRF+ID16A+Nano-Imaging+Beamline.">Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline.</a> Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).</li><li>Kosior, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+hard+X-ray+phase+contrast+imaging+and+X-ray+fluorescence+microscopy+for+subcellular+metal+quantification.">Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification.</a> Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).</li><li>Bohic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrotron+hard+X-ray+microprobe:+fluorescence+imaging+of+single+cells.">Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells.</a> Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Development+of+Electron+Cryo-Microscopy+(Nobel+Lecture).">On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture).</a> Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).</li><li>Da Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+concentration+of+high-energy+X-rays+for+diffraction-limited+imaging+resolution.">Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution.</a> Optica. 4 (5), 492-495 (2017).</li><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high-pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+pratice+of+high+pressure+freezing.">Theory and pratice of high pressure freezing.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrarapid+freezing+for+the+preservation+of+cellular+ultrastructure.">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).</li><li>Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryo-Tomography.">Electron Cryo-Tomography.</a> Cellular Imaging. , 61-94 (2018).</li><li>Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+metal+content+and+intracellular+distribution+in+primary+hippocampal+neurons+with+synchrotron+X-ray+fluorescence.">Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence.</a> PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).</li><li>Vavpeti&#269;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+distribution+and+sample+integrity+comparison+of+freeze-dried+and+frozen-hydrated+biological+tissue+samples+with+nuclear+microprobe.">Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).</li><li>Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-preparation+procedures+for+elemental+imaging+by+sims+and+eftem.">Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem.</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 499-536 (2008).</li><li>Gramaccioni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+quantification+of+intracellular+element+concentration+by+X-ray+fluorescence+microscopy+combined+with+X-ray+phase+contrast+nanotomography.">Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography.</a> Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).</li><li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+and+Copper+Effects+on+Stability+of+Tubulin+and+Actin+Networks+in+Dendrites+and+Spines+of+Hippocampal+Neurons.">Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons.</a> ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).</li><li>Ortega, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+over-expression+induces+increased+iron+accumulation+and+redistribution+in+iron-exposed+neurons.">&#945;-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).</li><li>Fartmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+atomic+and+molecular+species+in+cancer+cultures+with+TOF-SIMS+and+Laser-SNMS.">Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS.</a> Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).</li><li>P&#229;lsg&#229;rd, E., Lindh, U., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+freeze-substitution+techniques+for+X-ray+microanalysis+of+biological+tissue.">Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue.</a> Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Cryo-electron microscopie (Cryo-em) won de 2017 Nobel prijs voor de Scheikunde en als zodanig de ontwikkeling gemaakt door J. dubochet op vitrificatie van biologisch materiaal voor de hoge-resolutie structuurbepaling van biomoleculen in oplossing25. Zoals gerapporteerd door Dubochet in zijn Nobel College "weten hoe een druppel water te verwateren, is één ding, het voorbereiden van een biologisch monster voor biologische observatie is een andere"25. Cryopreparation stappen worden nu beschouwd als de standaardtechniek om stralingsdosis schade te verminderen en studie cellen dicht bij hun geboortestaat. De voorbereiding blijft echter vervelend. Dit komt omdat elektronenmicroscopie, vanwege zijn onovertroffen ruimtelijke resolutie, gevoelig is voor een ultrastructureel artefact dat optreedt tijdens de monstervoorbereiding. De Synchrotron cryonanoprobes naderen nu soortgelijke moeilijkheden naar beneden naar ruimtelijke resoluties zo laag als 13 nm in de hoge energie X-Ray bereik26. Harde X-Ray microscopie kan hele cellen analyseren terwijl elektronenmicroscopie lijdt aan de slechte penetratie diepte van elektronen waardoor alleen zeer dunne celsegmenten kunnen worden waargenomen.
Monolagen van cellen zijn dun genoeg, zodat door het invriezen van vloeibaar ethaan, de vereiste koelsnelheden voor water verglagering worden bereikt. In theorie zijn koelsnelheden zo hoog als 108 K/s mogelijk met behulp van hogedruk bevriezing27 , waardoor vitrificatie van specimens te dik voor het plungevriezen. Een koelsnelheid van 105 K/s, vereist om volledige verglavering van het monster bij omgevingsdruk28mogelijk te maken, wordt met behulp van de automatische plungevries machine en de hier gepresenteerde parameters reproducbaar bereikt. Dit stelt een onderzoeker in staat om dunne biologische specimens (< 10 μm), zoals een monolaag van cellen12,13,14,15,29,30 , te verglazen door in vloeibaar ethaan te invriezen.
Een belangrijke uitdaging met dit protocol is ook de chemische integriteit van het intracellulaire gehalte zo veel mogelijk te behouden om betrouwbare elementaire distributies binnen de cel in 2D of 3D te leveren. Zoals elders gepubliceerd2,16,17,31, in het geval van elementair beeldvorming op subcellulair niveau, moet de analyse van bevroren gehydrateerde cellen worden overwogen. Anders kan de combinatie van Dompel-Vries-en vriesdrogen van cellen worden gebruikt voor kamertemperatuur analyse. Voor deze laatste wordt het amorfe ijs verwijderd door het proces van sublimatie, terwijl de gebonden watermoleculen worden verwijderd door het proces van desorptie. Dit proces kan verre van ideaal zijn in vergelijking met bevroren gehydrateerde monsters als gevolg van de mogelijke verandering van de cellulaire membranen en de morfologie van sommige subcellulaire structuren32. Ook, voor soortvorming studies, de waterwinning kan leiden tot metalen soortvorming artefacten. Toch is het succesvol geweest en het beste alternatief voor diepgevroren gehydrateerde monsters voor elementaire beeldvorming op sub-100 nm niveaus2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Zoals gemeld37, de kwaliteit van cryopreserved cellulaire preparaten kan worden geëvalueerd door middel van de kalium-naar-natrium K/na ratio. Helaas, het kan nog niet worden bepaald met de harde X-Ray nanoprobe hier gebruikt, als gevolg van de lage energie-cut-off van de silicium drift detector gebruikt voor het detecteren van de röntgenfluorescentie fotonen van de elementen (E ≥ 1,3 keV magnesium). Inderdaad, een hoge K/na ratio (> 10) die kan worden gemeten met behulp van tof-Sims, EPMA, of Nuclear microprobe PIXE16,37 is een indicatie van de bewaarde chemische integriteit van de cel in vergelijking met de verwachte k/na van 25 in een levende cel37. Dit kan worden ondersteund door een gelijktijdige lage cl/K ratio38. Toch kan onvolmaakte verglaking, vooral als de snelheid van monster koeling te laag is, leiden tot de vorming van grote ijskristallen die celmembranen en organellen kunnen beschadigen, waardoor de verdeling van chemische elementen verandert. Hoewel er geen routineprocedure is om deze potentiële schade en impact op de intracellulaire verdeling te bewaken, kunnen de bovenstaande elementen verhoudingen en de mogelijkheid om de cel met een hoge resolutie te beeld met behulp van X-Ray fase contrast of Cryo-Soft X-Ray microscopie de beste benaderingen zijn om goed behoud van intracellulaire compartimenten te ondersteunen met gelijktijdig behoud van de elementaire integriteit. De combinatie van deze technieken en het gebruik van nieuw ontwikkelde cryocorrelatieve fluorescentie optische microscopen zullen helpen beoordelen in hoeverre deze schade optreedt en beïnvloedt de intracellulaire elementale verdeling.
Over het algemeen wordt een gedetailleerd en uitgebreid protocol voor het voorbereiden van cellulaire monsters voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse gepresenteerd. Het is een goed uitgangspunt voor de onderzoeksgemeenschap en helpt bij het oplossen van het lastige probleem van het voorbereiden van de juiste cellulaire samples voor 2D en 3D Elemental Imaging op (Cryo) harde X-Ray nanoprobes. Deze benaderingen kunnen worden samengevoegd met optische fluorescentie en elektronenmicroscopie mogelijkheden voor diepgaande correlatieve chemische en structurele beeldvorming van cellen.

Nieuw ontworpen Synchrotron X-Ray fluorescentie (SR-XRF) nanoprobes toestaan visualisatie van de subcellulaire verdeling van elementen in een volledig kwantitatieve manier. Als voorbeeld, deze analytische mogelijkheid maakt onderzoek naar de opname van nanodeeltjes1 of organometopolische moleculen zoals osmium-gebaseerde complexen2, het verstrekken van inzicht in de intracellulaire opname van metaal gebaseerde moleculen met krachtige antikanker eigenschappen. Als een techniek met meerdere elementen biedt SR-XRF3 met een nanoprobe een manier om intracellulair meest biologisch belangrijke elementen, waaronder fosfor, zwavel, kalium, calcium, ijzer, koper en zink, gelijktijdig te kwantificeren en lokaliseren. Inderdaad, het gebruik van harde röntgenstralen zorgt voor een grote penetratie diepte om hele diepgevroren gehydrateerde cellen in een etiket vrije mode te kunnen afbeelen. Bovendien, het verstrekken van toegang tot de K-rand van de meeste elementen van belang, de X-Ray fluorescentie is zeer efficiënt opgewonden. Het gebruik van cryogene benaderingen maakt vermindering van stralings schade en optimalisatie van het behoud van de celstructuur en elementaire distributie mogelijk.
De meeste beschikbare ruimtelijk opgeloste analytische technieken om metalen in cellen te bestuderen zijn oppervlaktetechnieken waarvoor zeer dunne en vlakke delen van cellen moeten worden geproduceerd. Dit omvat voornamelijk Scanning transmissie elektronenmicroscopie met energiedispersieve Röntgen analyse (STEM-EDX), energie-gefilterde transmissie elektronenmicroscopie (EF-TEM) en nanoschaal secundaire Ion massaspectrometrie (nano Sims). De laatste kan niet worden uitgevoerd op bevroren, gehydrateerde celgedeelten terwijl Cryo-analyse kan worden gedaan met elektronenmicroscopie met onovertroffen ruimtelijke resolutie, maar met een slechte elementair gevoeligheid. Door deeltjes geïnduceerde röntgenstraling (PIXE) heeft de studie van elementaire distributies in hele cellen toegestaan. Het heeft het voordeel dat het volledig kwantitatief is met een eerlijke elementaire gevoeligheid op de micron schaal en zelfs op submicron resolutie4, maar lijdt aan stralings schade en gebrek aan cryogene capaciteiten om diepgevroren cellen te bestuderen. Al deze analytische technieken vullen elkaar aan in de elementaire beeldvorming van cellen, maar voor alle technieken is de monster voorbereidingsprocedure een cruciale stap. Het moet eenvoudig worden gehouden om mogelijke verontreiniging te beperken, evenals elementaire herverdeling en/of lekkage om zinvolle resultaten te verkrijgen. Zoals aangetoond in elektronenmicroscopie, een cryogene workflow, met inbegrip van Cryo-immobilisatie van de cel en cryotransfer naar een cryoscanning fase, maakt een optimaal elementair behoud op subcellulaire niveaus zo dicht mogelijk bij de inheemse staat5,6,7,8,9,10. Dit begrip is met succes geïmplementeerd in de ontwikkeling van Synchrotron Cryo-Soft X-Ray microscopie (bijv. volledige veld microscopen en scanning microscopen) om Ultrastructurele beeldvorming van volledige diepgevroren cellen in 2D of 3D te produceren. Verschillende cryogene workflows werden ontwikkeld11 voor Soft X-Ray microscopen op beamline 2,1 (XM-2) van de geavanceerde lichtbron bij Lawrence Berkeley National Laboratory12, BEAMLINE U41-XM bij de Electron Storage ring Bessy II (Duitsland)13, beamline Mistral van de Alba Light Source (Spanje)14, en bij beamline B24 van de Diamond Light Source15, onder andere. Een vergelijkbare workflow werd onlangs aangetoond als de meest betrouwbare voorbereidings-en conserveringsmethode voor intracellulaire elementale analyse met behulp van X-Ray microprobes16,17.
Hoewel X-Ray nanoprobe-technieken op grote schaal worden gebruikt voor cellulaire elementair onderzoek, met name met de komst van cryogene SR-XRF-capaciteiten, is er tot dusver geen stapsgewijs Protocol verspreid naar de onderzoeksgemeenschap. Hier wordt een gedetailleerde procedure gegeven om cryovaste hecht cellen te bereiden als monolagen op siliciumnitride membranen die onder Cryogene omstandigheden moeten worden geanalyseerd. Een Vries droog stap die moet worden toegepast na het protocol voor het geval de Röntgen analyse bij kamertemperatuur moet worden uitgevoerd, is ook aanwezig. Hoewel het voorgestelde protocol met succes is gebruikt met humane borstkankercellen MD-MB-2312 en het vriesdrogen onder andere op muis neuronen18,20,21is aangetoond, kan het gemakkelijk worden uitgebreid tot verschillende soorten menselijke of dierlijke cellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

Er is weinig bekend over de verdeling van metaalionen op subcellulair niveau. Echter, die chemische elementen hebben essentiële regelgevende functies en hun verstoorde homeostase is betrokken bij verschillende ziekten. State-of-the-art Synchrotron X-Ray fluorescentie nanoprobes bieden de vereiste gevoeligheid en ruimtelijke resolutie om de tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) verdeling en de concentratie van metalen in hele cellen op de organel niveau. Dit opent nieuwe spannende wetenschappelijke onderzoeksgebieden over de rol van metalen in de fysioathologie van de cel. De cellulaire voorbereiding is een belangrijke en vaak ingewikkelde procedure, met name voor basisanalyse. Hoewel röntgenfluorescentie technieken nu wijdverbreid zijn en verschillende bereidingsmethoden zijn gebruikt, hebben zeer weinig studies het behoud van het elementaire gehalte van cellen op zijn best onderzocht en geen stapsgewijs gedetailleerd protocol voor de cryopreparatie van Er zijn tot nu toe aanhechting cellen voor röntgenfluorescentie nanoprobes vrijgegeven. Dit is een beschrijving van een protocol dat de stapsgewijze cellulaire voorbereiding voor snelle Cryofixatie biedt om Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse van cellen in een bevroren gehydrateerde toestand mogelijk te maken wanneer een cryogene omgeving en overdracht beschikbaar is. Indien nano-analyse bij kamertemperatuur moet worden uitgevoerd, wordt een aanvullende procedure voor het bevriezen van het vriesdrogen van de cryovaste aanhanger van het cellulaire preparaat verstrekt. De voorgestelde protocollen zijn met succes gebruikt in eerdere werken, meest recentelijk bij het bestuderen van de 2D-en 3D-intracellulaire distributie van een organomtaalverbinding in borstkankercellen.

Een typische optische video Microscoop weergave van bevroren gehydrateerde MDA-MB-231 cellen die op een poly-L-lysine gecoate si3N4 membraan ondersteuning werden gesubcultureerd, wordt weergegeven in Figuur 7a. De optische weergave van het monster in de vacuümkamer werd verkregen in reflectie modus met behulp van de speciale online video Microscoop van de ID16A beamline van de ESRF22. Terwijl elektron of zachte X-Ray microscopie vereist dat de ijslaag de cel insluit om zo dun mogelijk te zijn (meestal < 0,5 μm), hebben harde röntgenstralen (> 10 keV) het voordeel van een veel hogere penetratie diepte en lagere dosis depositie. De ijsdikte kan daarom groter zijn, meestal < 10 μm inclusief de cel, zodat de ijsinsluiting van de cel een paar μm dik is. Dit kan worden geschat door de gemeten Röntgen intensiteit in transmissie in vergelijking met de intensiteit zonder het monster, rekening houdend met de absorptie van het 500 nm dikke si3N4 membraan. Deze ijsdikte kan worden bereikt door handmatige blotting zoals beschreven in het huidige protocol. In de Newton Rings-regio kan de ijsdikte nog dunner zijn (niet gemeten).
De röntgenfluorescentie Elemental mapping van de bevroren gehydrateerde cel wordt weergegeven in Figuur 7B met de representatieve verdelingen van fysiologische elementen zoals kalium (K), zwavel (S) en zink (Zn). Deze kaarten vertegenwoordigen de elementaire areale massa (d.w.z. elementair geprojecteerde massa). Hoewel dit niet gebeurt in het onderhavige geval, kunnen dergelijke kaarten worden genormaliseerd via X-Ray propagatie-gebaseerde fase contrast beeldvorming die de schatting van het voorbeeld van de geprojecteerde massa23biedt. Zoals gerapporteerd door vele onderzoeken, werd verondersteld dat het sterk diffundeerbaar K-ion in cellen in de in de nabije omgeving bewaarde toestand homogeen verdeeld was over de gehele cel23,24,16. Zoals weergegeven in de 2D röntgenfluorescentie Elemental beelden in Figuur 7B, de strak gebonden element S was gelijkmatig verdeeld in de cel, vergelijkbaar met K, en vertegenwoordigt een goede schatting van het cellulaire massa profiel. De Zn-verdeling had een hoger signaal in de Nucleus dan in de cytosol en duidelijk de Nucleus geschetst. Er kan worden opgemerkt dat kleine Zn-verrijkte gebieden kunnen worden gedetecteerd bij de ruimtelijke resolutie (50 nm) in het nucleaire gebied.
De bestaande X-Ray nanoprobes of degenen die moeten worden gebouwd, zijn niet noodzakelijkerwijs geschikt voor cryogene capaciteiten. In dit geval is het beste alternatief voor het verkrijgen van röntgenfluorescentie beelden van cellen bij sub-100 nm ruimtelijke resoluties het uitvoeren van een vriesdrogen procedure beschreven in dit protocol na het invriezen van de cel. Figuur 8a toont een typisch helderveld microscopie weergave van resulterende gevriesdroogde primaire muis hippocampal neuronen direct gekweekt op de si3N4 membraan. In dit geval, indien opgeslagen in een schone, drooggeveerde kamer, kunnen de monsters 1 − 2 weken van tevoren worden bereid en worden geobserveerd met een gewone, rechtopstaande optische Microscoop voor de registratie van interessante gebieden. Zorg moet worden genomen om blootstelling aan de omgevingsvochtigheid te voorkomen, omdat het kan worden opgevangen door het gevriesdroogde monster en leiden tot schade onder de Röntgen nano straal. Deze procedure werd met succes toegepast op zeer gevoelige cellen (d.w.z. neuronale cellen) en zelfs betere resultaten werden verkregen met andere robuustere soorten cellen, zoals kankercellen. Wat de diepgevroren cellen betreft, zijn de röntgenfluorescentie beelden van K, S en Zn op het gehele gevriesdroogde celdisplay vergelijkbaar met die welke hierboven zijn beschreven. Ze zijn representatief voor de Elemental distributies te vinden in verschillende soorten gevriesdroogde cellen bij 50 − 100 nm ruimtelijke resolutie. Terwijl het bevriezen van hele cellen een alternatief is om elementaire integriteit te behouden, is het ten koste van een perfect behoud van de celmorfologie16, met name celmembranen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> Figuur 1: typische sample ondersteuning voor röntgenfluorescentie nano-analyse. Een si3N4 membraan ondersteuning in de beschermende capsule. Dit type substraat kan zowel worden gebruikt voor kamertemperatuur analyse (dompel-Vries cellulaire bereiding gevolgd door lage temperatuur en laag vacuüm vriesdroogproces) of voor cryogene röntgenfluorescentie-analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> Figuur 2: schematische weergave van de ramen siliciumnitride na het zaaien van de cel. De cellen worden rechtstreeks op de poly-L-lysine gecoate vlakke oppervlak van de si3N4 membraan ondersteuning gekweekt. Soms kunnen luchtbellen worden gevangen in de achterzijholte van de si3N4 membraan ondersteuning en moeten worden verwijderd zoals beschreven in het protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> Figuur 3: in-house ontwikkelde 3D gedrukte Cryo-box voor lange termijn opslag van Dompel bevroren si3N4 membraan ondersteunt in vloeibare stikstof Dewar. (A) Cryo-Box gedemonteerd met de houder en de doppen (onderste deel) en (B) de gemonteerde Cryo-box met vergrendelde doppen. De doppen kunnen worden gemanipuleerd met de pincet, openen of vergrendelen door rotatie. Een gedetailleerd plan voor 3D-printen is beschikbaar op aanvraag van ESRF ID16A. Het ontwerp is gemaakt voor siliciumnitride TEM roosters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> Figuur 4: blotting van cellen gekweekt op si3N4. Voorafgaand aan het invriezen van de cel monolaag gekweekt op een si3N4 membraan moet worden gespoeld in ammoniumacetaat oplossing (a) en zorgvuldig handmatig geblokt met behulp van filtreerpapier (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> Figuur 5: automatisch invriezing em-GP machine. A) de automatische Dompel vriezer. B) de milieu kamer met de pincet opgesloten.C) de ethaan-beker bedekt met de Leica lifier die is aangesloten op een ethaan fles. D) de Dompel kast met de zwarte beker vol vloeibaar ethaan en de Cryo-box voor verdere opslag in LN2 van de verglaasd si3N4 membranen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> Figuur 6: monster cryotransfer assemblage voor vriesdroog procedure. A) de eerste messing ontvanger voor si3N4 membranen wordt bovenop de houder van de monster overdracht gemonteerd die door de leverancier van de vriesdroger wordt geleverd. B) enC) tonen aan dat de tweede platte messing schijf als afdekking wordt gebruikt en fungeert als een koelval behuizing die in de vacuüm behuizing van de vriesdroger moet worden geplaatst. D) de volledige montage met de veer stang met veerbelaste overbrenging. E) de monsterhouder die de verglaasd cellulaire bereiding op het si3N4 -membraan draagt, moet verder worden ingebracht in de LN2-gekoelde vriesdroger. Alle stappen voor het monteren van de assemblage worden gedaan in LN2 in een piepschuim doos. Voor de duidelijkheid, alle beelden werden geproduceerd in de afwezigheid van LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> Afbeelding 7: Cryo-X-Ray fluorescentie beelden van een bevroren gehydrateerde cel met behulp van harde X-Ray nanoprobe. (A) typische online weergave in reflectie modus met behulp van de speciale optische video-Microscoop van de ESRF ID16A beamline. Na handmatige blotting werd een totale ijsdikte van ongeveer 5 − 10 μm bereikt die een duidelijk beeld van de bevroren gehydrateerde cellen mogelijk maakt. Een regio met Newton ringen die indicatief zijn voor nog veel dunner ijs is merkbaar. B) representatieve Cryo-X-Ray fluorescentie cellulaire distributies van fysiologische elementen kalium (K), zwavel (S) en zink (Zn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> Figuur 8: röntgenfluorescentie beelden van een gevriesdroogde neuronale cel met behulp van harde X-Ray nanoprobe. A) typisch helderveld microscopie van resulterende gevriesdroogde primaire corticale neuronale cellen direct gekweekt op de si3N4 membraan. Schaalbalk = 200 μm (B) representatieve kamertemperatuur X-Ray fluorescentie beelden van een enkelvoudig gevriesdroogd hippocampal neuron dat de distributies van fysiologische elementen kalium (K), zwavel (S) en zink (Zn) weergeeft. Schaalbalk = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Hier is een protocol voor celkweek op siliciumnitride membranen en Plunge-bevriezing voorafgaand aan röntgenfluorescentie Imaging met een Synchrotron cryogene X-Ray nanoprobe. Wanneer alleen kamertemperatuur nano-analyse wordt verstrekt, kunnen de bevroren monsters verder gevriesdroogd worden. Dit zijn cruciale stappen om informatie te verkrijgen over de intracellulaire Elemental Composition.

Celkweek op siliciumnitride membranen en Cryopreparation voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Nieuw ontworpen synchrotron x-ray fluorescentie nano-probes maken visualisatie van de elementaire verdeling van een monster mogelijk. Het gebruik van cryogene benaderingen is verplicht om x-ray stralingsschade te vertragen. Daarom is een snelle cryofixatie essentieel voor het verkrijgen van bevroren gehydrateerde cellen om het behoud van de celstructuur en de chemische integriteit ervan te optimaliseren.De specificiteit van de cellulaire preparaten voor synchrotronstudies leiden tot de optimalisatie van dit protocol voor het verwerven van bevroren gehydrateerde celmonolagen. Visuele demonstratie is belangrijk om te begrijpen hoe de celmonolaagmonsters te manipuleren om reproduceerbare cryofixed cellen te bereiken die zijn ingebed in een dunne laag ijs. Open de capsule met de membraansteun voor het bereiden van een siliciumnitridemembraan en knijp de capsule voorzichtig in om de steun licht los te maken.Gebruik dunne pincet om een hoek van het silicium frame te grijpen en zorg ervoor dat het siliciumnitridemembraan niet in het midden van het frame raakt en het frame in een onbedekt petrischaal in een laminaire stroomkast plaatst. Vervolgens steriliseert UV het membraan gedurende 25 tot 30 minuten. Voeg aan het einde van de sterilisatie 10 microliter bevestigingsfactor toe, zoals poly-L-lysine.Incubeer gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius en bij 5% kooldioxide met vochtigheid. Vul vervolgens de putten van een steriele 48-put plaat met 200 tot 250 microliter van 0,22 micrometer gefilterd ultra zuiver en ultra trace water per put. Gebruik fijne pincet om het membraan voorzichtig verticaal onder te dompelen met drie opeenvolgende spoelingen van 10 seconden in één waterput.Plaats het membraan na het spoelen verticaal in een lege put van een steriele 96-putplaat onder de laminaire stroomkap en laat het 's nachts tot het droog is. Voor het zaaien van de cellen van belang, plaats het gecoate membraan met de vlakke kant naar boven in een put van een steriele vier-put plaat. Voeg vijf keer 10 toe aan de vier cellen in 10 microliter van een geschikt kweekmedium aan het oppervlak van het siliciumnitridemembraan zonder het membraan aan te raken.De druppel moet het hele membraan bedekken. Dan cultuur de cellen op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide met vochtigheid. Wanneer de cellen zijn begonnen te hechten aan het substraat, voeg langzaam een milliliter van de volledige cultuur medium naar beneden de muur van elke put die elk membraan.Dan cultuur de cellen op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide met vochtigheid. Voor cryoimmobilisatie van de cellulaire voorbereiding, zet eerst een automatische duik vriezer en vul het juiste aantal putten in een 12-well plastic plaat met 37 graden Celsius ammonium acetaat buffer. Onmiddellijk voor het spoelen en onderdompelen van het membraan, verwijder het monster uit de incubator en gebruik de zwarte klemring van een paar quick release pincet om de pincet te ontgrendelen.Gebruik de ontgrendelde pincet om de membraansteun te grijpen en het membraan gedurende ongeveer vijf seconden verticaal onder te dompelen in de ammoniumacetaatbufferoplossing. Als u overtollige buffer wilt verwijderen, drukt u de onderkant van de membraansteun op filterpapier en dep u elke zijde van het frame op het filterpapier zonder dat het membraan het papier kan raken. Wanneer de overtollige buffer is verwijderd, open de deur van de milieukamer, schuif snel de pincet in de tangen in elkaar en sluit de deur van de kamer.Druk op dep een duik. De pincet die het siliciumnitridemembraan vasthoudt, wordt snel in de cryogen gedompeld. Na het invriezen van de duik, verwijder het deksel van de transfercontainer met voorgekoelde tangen en druk op de overdracht.Het siliciumnitridemembraan wordt iets boven de cryogen bewogen. Schuif in een snelle beweging en kantel de pincet iets uit de tangen om de pincet direct in een lege sleuf van de cryobox in de met stikstofvloeistof gevulde overdrachtscontainer te brengen. Laat vervolgens de zwarte klemring los om het membraan te bevrijden.Voor het bevriezen van het drogen van de plunge-bevroren cellen, gebruik maken van de tuimelschakelaar gelegen op het achterpaneel van de vriesdrooginstrument aan de macht op het instrument. Op het display wordt druk op enter weergegeven wanneer het monster klaar is om te laden. Monteer de siliciumnitride membraan messing houder op de top van de monster overdracht houder die door de leverancier in de polystyreen opslag container houden van het niveau van vloeibare stikstof tot ongeveer een tot twee millimeter onder de bovenste rand van het eerste messing stuk.Plaats het membraan met de celmonsterzijde naar boven in de genummerde spouw van de koperen houder en koel de overdrachtsstang voor in een met vloeibare stikstof gevulde polystyreenschuimdoos. Gebruik de stang om de volledige montage te vergrendelen, druk op enter om het vacuüm te breken om het deksel van de vriesdrogerkamer los te laten, breng het monster onmiddellijk over in de vriesdrogerkamer en sluit het deksel van de vriesdrogerkamer. Druk dan meteen op start om verder te gaan met de vriesdroogcyclus.Aan het einde van de vriesdroogcyclus drukt u op stop om de kamer te ventileren en verwijder de volledige montage om toegang te krijgen tot de gevriesdroogde monsters. Hier wordt een typische optische videomicroscoopmenoscoopmening van bevroren gehydrateerde cellen van de borstkankercellijn die op een poly-L-lysine gecoate siliciumnitridemembraansteun worden gesubcultuurd getoond. Röntgenfluorescentie elemental mapping van de bevroren gehydrateerde cellen onthult de verdeling van fysiologische elementen zoals kalium, zwavel en zink.In dit representatieve voorbeeld werd het strak gebonden zwavelelement gelijkmatig verdeeld binnen de cel in een vergelijkbaar patroon als dat voor kalium en vertegenwoordigt het een goede schatting van het cellulaire massaprofiel. De zinkverdeling vertoonde echter een hoger signaal in de kern dan in de cytosol met een duidelijk gedefinieerde scheiding van het signaal tussen de cytosol en de kern. In deze typische Brightfield microscopie weergave van gevriesdroogde primaire muis hippocampal neuronen direct gekweekt op een silicium nitride membraan zoals aangetoond, de cellen vertonen een typische neurale morfologie die niet wordt beïnvloed door hun cultuur of conserveringsmethode.Röntgenfluorescentiebeeldvorming van diepgevroren cellen onthult ook typische elementaire verdelingen zoals tentoongesteld door deze representatieve gevriesdroogde cellen op een ruimtelijke resolutie van 50 tot 100 nanometer. Plotten van de silicium nitride venster is van cruciaal belang voor het verkrijgen van de dunst mogelijke ijslaag van cellen na duik bevriezing. Het behoud van de chemische integriteit van de cellen op subcellulair niveau maakt het mogelijk de metallome van de cellen te verkennen met synchrotron nano-probes en met andere microanalytische technieken.Aangezien niet alle synchrotron nanosondeanalyse kan worden uitgevoerd bij cryogene temperatuur, kunnen de bevroren gehydrateerde cellen verder worden gevriesdroogd om hun analyse bij kamertemperatuur te vergemakkelijken. Vergeet niet om de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken bij het werken met vloeibare stikstof en om altijd ethaangas te gebruiken in een rookkap uit de buurt van vlammen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Online Grootte-uitsluiting en ionenuitwisselingschromatografie op een SAX Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Vaste doel seriële gegevensverzameling bij Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...