Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Les expériences sur la ligne de faisceau de nano-imagerie ID16A ont été réalisées dans le cadre des propositions ESRF LS2430, LS2303 et LS2765.

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Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts.

La microscopie cryo-électron (cryo-EM) a remporté le prix Nobel de chimie 2017 et, à ce titre, le développement de J. Dubochet sur la vitrification du matériel biologique pour la détermination de la structure à haute résolution des biomolécules dans la solution25. Comme indiqué par Dubochet dans sa conférence Nobel "Savoir comment vitrifier une goutte d'eau est une chose, la préparation d'un échantillon biologique pour l'observation biologique en est une autre"25. Les étapes de cryopréparation sont maintenant considérées comme la technique standard pour atténuer les dommages causés par la dose de rayonnement et étudier les cellules proches de leur état d'origine. La préparation reste cependant fastidieuse. C'est parce que la microscopie électronique, en raison de sa résolution spatiale inégalée, est sensible à tout artefact ultrastructural qui se produit pendant la préparation de l'échantillon. Les cryonanoprobes synchrotron s'approchent maintenant de difficultés similaires pour atteindre des résolutions spatiales aussi basses que 13 nm dans la plage de rayons X à haute énergie26. La microscopie à rayons X durs peut analyser des cellules entières tandis que la microscopie électronique souffre de la faible profondeur de pénétration des électrons permettant d'observer uniquement des tranches de cellules très fines.
Les monocouches de cellules sont assez minces pour qu'en plongeant dans l'éthane liquide, les taux de refroidissement requis pour la vitrification de l'eau soient atteints. En théorie, des taux de refroidissement aussi élevés que 108 K/s sont possibles en utilisant le gel à haute pression27 qui permet la vitrification des spécimens trop épais pour le gel de plongée. Un taux de refroidissement de 105 K/s, nécessaire pour permettre la vitrification complète de l'échantillon à la pression ambiante28, est atteint de façon reproductible à l'aide de la machine automatique de congélation de plongée et des paramètres présentés ici. Cela permet à un chercheur de vitrifier de minces spécimens biologiques (lt;10 m) tels qu'une monocouche de cellules12,13,14,15,29,30 par le plongeon-congélation dans l'éthane liquide.
Un défi important avec ce protocole est également de préserver autant que possible l'intégrité chimique du contenu intracellulaire pour fournir des distributions élémentaires fiables dans la cellule en 2D ou 3D. Comme publié ailleurs2,16,17,31, dans le cas de l'imagerie élémentaire au niveau subcellulaire, l'analyse des cellules hydratées congelées devrait être considérée. Dans le cas contraire, la combinaison de la congélation et du séchage des cellules peut être utilisée pour l'analyse de la température ambiante. Pour ce dernier, la glace amorphe est enlevée par le processus de sublimation, tandis que les molécules d'eau liées sont enlevées par le processus de desorption. Ce processus peut être loin d'être idéal par rapport aux échantillons hydratés congelés en raison de l'altération possible des membranes cellulaires et de la morphologie de certaines structures subcellulaires32. En outre, pour les études de spéciation, l'extraction de l'eau peut conduire à des artefacts de spéciation métallique. Pourtant, il a été couronné de succès et la meilleure alternative aux échantillons hydratés congelés pour l'imagerie élémentaire à des niveaux de moins de 100 nm2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Comme il a été rapporté37, la qualité des préparations cellulaires cryoconservées peut être évaluée par le rapport potassium-sodium K/Na. Malheureusement, il ne peut pas encore être déterminé avec la nanosonde à rayons X dur utilisé ici, en raison de la faible coupure d'énergie du détecteur de dérive de silicium utilisé pour détecter les photons de fluorescence des rayons X des éléments (E 1,3 keV magnésium). En effet, un ratio K/Na élevé (-10) qui peut être mesuré à l'aide de TOF-SIMS, EPMA, ou microprobe nucléaire PIXE16,37 est révélateur de l'intégrité chimique préservée de la cellule par rapport à la K / Na prévu de 25 dans une cellule vivante37. Cela peut être soutenu par un ratio Cl/K faible concomitante38. Pourtant, la vitrification imparfaite, en particulier si la vitesse de refroidissement de l'échantillon est trop faible, peut conduire à la formation de grands cristaux de glace qui peuvent endommager les membranes cellulaires et les organites, modifiant ainsi la distribution des éléments chimiques. Bien qu'il n'y ait pas de procédure courante pour surveiller ces dommages potentiels et l'impact sur la distribution intracellulaire, les rapports élémentaires ci-dessus et la possibilité d'imager la cellule à haute résolution en utilisant le contraste de phase de rayons X ou la microscopie cryo-douce de rayon X peuvent être les meilleures approches pour soutenir la bonne conservation des compartiments intracellulaires avec la conservation concomitante de l'intégrité élémentaire. La combinaison de ces techniques et l'utilisation de microscopes optiques à fluorescence cryocorrelative nouvellement développés aideront à évaluer dans quelle mesure ces dommages se produisent et affectent la distribution élémentaire intracellulaire.
Dans l'ensemble, un protocole détaillé et complet pour préparer des échantillons cellulaires pour la nano-analyse de fluorescence des rayons X synchrotron est présenté. C'est un bon point de départ pour la communauté de la recherche, aidant à résoudre la question difficile de la façon de préparer des échantillons cellulaires appropriés pour l'imagerie élémentaire 2D et 3D à (cryo) nanosondes à rayons X durs. Ces approches peuvent être fusionnées avec des capacités de fluorescence optique et de microscopie électronique pour l'imagerie chimique et structurale corrélative en profondeur des cellules.

Les nanosons de fluorescence des rayons X synchrotron (SR-XRF) nouvellement conçus permettent de visualiser la distribution subcellulaire des éléments d'une manière entièrement quantitative. À titre d'exemple, cette capacité analytique permet d'examiner l'utilisation de nanoparticules1 ou de molécules organométalliques telles que les complexes à base d'osmium2,fournissant un aperçu de l'utilisation intracellulaire de molécules à base de métaux ayant de puissantes propriétés anticancéreuses. En tant que technique multi-éléments, SR-XRF3 avec une nanoprobe fournit un moyen de quantifier et de localiser simultanément les éléments intracellulaires les plus importants biologiquement, y compris le phosphore, le soufre, le potassium, le calcium, le fer, le cuivre et le zinc. En effet, l'utilisation de rayons X durs fournit une grande profondeur de pénétration pour l'image de cellules entières hydratées congelées d'une manière sans étiquette. En outre, offrant l'accès à la k-edge de la plupart des éléments d'intérêt, la fluorescence aux rayons X est excité le plus efficacement. L'utilisation d'approches cryogéniques permet de réduire les dommages causés par les radiations et d'optimiser la préservation de la structure cellulaire et la distribution élémentaire.
La plupart des techniques d'analyse spatialement résolues disponibles pour étudier les métaux dans les cellules sont des techniques de surface nécessitant des sections très minces et plates de cellules à produire. Il s'agit principalement de la microscopie électronique de transmission de balayage avec l'analyse de rayons X dispersive séviscreuse d'énergie (STEM-EDX), la microscopie électronique de transmission à transmission d'énergie (EF-TEM) et la spectrométrie de masse d'ions secondaires à l'échelle nanométrique (nanoSIMS). Cette dernière ne peut pas être effectuée sur des sections de cellules congelées et hydratées, tandis que la cryo-analyse peut être effectuée avec une microscopie électronique avec une résolution spatiale inégalée mais une faible sensibilité élémentaire. L'émission de rayons X induite par les particules (PIXE) a permis l'étude des distributions élémentaires dans des cellules entières. Il a l'avantage d'être entièrement quantitatif avec une sensibilité élémentaire juste à l'échelle du micron et même à la résolution submicron4, mais souffre de dommages causés par les radiations et le manque de capacités cryogéniques pour étudier les cellules hydratées congelées. Toutes ces techniques analytiques se complètent dans l'imagerie élémentaire des cellules, mais pour toutes les techniques, la procédure de préparation de l'échantillon est une étape cruciale. Il faut garder simple de limiter la contamination possible ainsi que la redistribution élémentaire et / ou des fuites pour obtenir des résultats significatifs. Comme démontré dans la microscopie électronique, un flux de travail cryogénique, y compris la cryo-immobilisation de la cellule et le cryotransfert à un stade de cryoscanning, permet une conservation élémentaire optimale à des niveaux subcellulaires aussi près que possible de l'état natif5,6,7,8,9,10. Cette compréhension a été mise en œuvre avec succès dans le développement de la microscopie à rayons X cryo-douce synchrotron (p. ex., microscopes complets sur le terrain et microscopes à balayage) pour produire une imagerie ultrastructurale de cellules entières hydratées congelées en 2D ou en 3D. Divers flux de travail cryogéniques ont été développés11 pour les microscopes à rayons X souples à Beamline 2.1 (XM-2) de l'Advanced Light Source au Lawrence Berkeley National Laboratory12, beamline U41-XM à l'anneau de stockage d'électrons BESSY II (Allemagne)13, faisceau MISTRAL de la source lumineuse ALBA (Espagne)14, et à Beamline B24 de la source de lumière Diamond15, entre autres. Un flux de travail similaire s'est récemment avéré être la méthode de préparation et de conservation la plus fiable pour l'analyse élémentaire intracellulaire à l'aide de microsondes à rayons X16,17.
Bien que les techniques de nanoprobe à rayons X commencent à être largement utilisées pour l'analyse élémentaire cellulaire, en particulier avec l'avènement des capacités sR-XRF cryogéniques, aucun protocole pas à pas n'a été diffusé jusqu'à présent à la communauté de la recherche. Ici, une procédure détaillée est fournie pour préparer les cellules adhérentes cryofixes cultivées comme monocouches sur des membranes de nitride de silicium à analyser dans des conditions cryogéniques. Une étape de séchage au gel à appliquer après le protocole au cas où l'analyse des rayons X doit être effectuée à température ambiante est également fournie. Tandis que le protocole proposé a été avec succès employé avec les cellules humaines de cancer du sein MD-MB-2312 et le gel-séchage a été démontré entre autres sur des neurones de souris18,20,21,il peut être facilement étendu à divers types de cellules humaines ou animales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

On sait très peu de choses sur la distribution des ions métalliques au niveau subcellulaire. Cependant, ces éléments chimiques ont des fonctions réglementaires essentielles et leur homéostasie perturbée est impliquée dans diverses maladies. Les nanosons de fluorescence synchrotron à rayons X à la fine pointe de la technologie fournissent la sensibilité et la résolution spatiale requises pour élucider la distribution et la concentration bidimensionnelles (2D) et tridimensionnelles (3D) des métaux à l'intérieur de cellules entières à la niveau d'organelle. Cela ouvre de nouveaux domaines scientifiques passionnants de recherche sur le rôle des métaux dans la physiopathologie de la cellule. La préparation cellulaire est une procédure clé et souvent complexe, en particulier pour l'analyse de base. Bien que les techniques de fluorescence aux rayons X soient maintenant répandues et que diverses méthodes de préparation aient été utilisées, très peu d'études ont étudié la préservation de la teneur élémentaire des cellules, au mieux, et aucun protocole détaillé sur le plan pas à pas pour la cryopréparation de des cellules adhérentes pour les nanosondes de fluorescence des rayons X ont été libérées jusqu'à présent. Il s'agit d'une description d'un protocole qui fournit la préparation cellulaire progressive pour la cryofixation rapide pour permettre la nano-analyse de fluorescence de rayons X synchrotron des cellules dans un état hydraté gelé quand un environnement cryogénique et le transfert est disponible. Dans le cas où la nano-analyse doit être effectuée à température ambiante, une procédure supplémentaire pour le lyophilisation de la préparation cellulaire adhérente cryofixe est fournie. Les protocoles proposés ont été utilisés avec succès dans des travaux précédents, plus récemment dans l'étude de la distribution intracellulaire 2D et 3D d'un composé organométallique dans les cellules cancéreuses du sein.

Une vue vidéo typique de microscope de MDA-MB-231 hydratée congelée qui ont été sous-cultivées sur un support de membrane si3N4 enduit de poly-L-lysine est montrée dans la figure 7A. La vue optique de l'échantillon dans la chambre à vide a été obtenue en mode de réflexion à l'aide du microscope vidéo en ligne dédié de la ligne de faisceau ID16A de l'ESRF22. Bien que la microscopie électronique ou douce aux rayons X exige que la couche de glace qui intègre la cellule soit aussi mince que possible (généralement 0,5 m), les rayons X durs (keV) ont l'avantage d'une profondeur de pénétration beaucoup plus élevée et d'un dépôt de dose plus faible. L'épaisseur de la glace peut donc être plus grande, généralement 10 m, y compris la cellule, de sorte que la glace qui intègre la cellule est de quelques mètres d'épaisseur. Ceci peut être estimé par l'intensité mesurée de rayon X dans la transmission comparée à l'intensité sans l'échantillon, en tenant compte de l'absorption de la membrane Si3N4 épaisse de 500 nm. Cette épaisseur de glace peut être atteinte par le ballonnement manuel tel que décrit dans le protocole actuel. Dans la région des anneaux Newton, l'épaisseur de la glace peut être encore plus mince (non mesurée).
La cartographie élémentaire de la fluorescence des rayons X de la cellule hydratée congelée est indiquée à la figure 7B avec les distributions représentatives d'éléments physiologiques tels que le potassium (K), le soufre (S) et le zinc (Zn). Ces cartes représentent la masse aréale élémentaire (c.-à-d. la masse projetée élémentaire). Bien qu'elles ne soient pas effectuées en l'espèce, ces cartes peuvent être normalisées grâce à l'imagerie de contraste de phase basée sur la propagation des rayons X qui fournit l'estimation de la masse projetée de l'échantillon23. Comme l'ont rapporté de nombreuses études, l'ion K hautement diffusible dans les cellules conservées dans leur état quasi-indigène a été supposé être homogènement distribué dans toute la cellule23,24,16. Comme le montre les images élémentaires de fluorescence 2D de la fluorescence des rayons X de la figure 7B, l'élément S étroitement lié a été réparti uniformément dans la cellule, de la même façon que K, et représente une bonne estimation du profil de masse cellulaire. La distribution de Zn avait un signal plus élevé dans le noyau que dans le cytosol et a clairement décrit le noyau. On peut noter que de petites régions enrichies de Zn peuvent être détectées à la résolution spatiale (50 nm) dans la région nucléaire.
Les nanosondes de rayons X existantes ou celles à construire ne s'adaptent pas nécessairement aux capacités cryogéniques. Dans ce cas, la meilleure alternative pour obtenir des images de fluorescence de rayon X des cellules aux résolutions spatiales de sous-100 nm est d'exécuter une procédure de gel-séchage décrite dans ce protocole après le plongeon-congélation de la cellule. La figure 8A montre une vue typique de microscopie de champ lumineux des neurones hippocampaux primaires de souris lyophilisés résultants directement cultivés sur la membrane Si3N4. Dans ce cas, s'ils sont stockés dans une chambre propre et desséchée, les échantillons peuvent être préparés une ou deux semaines à l'avance et être observés avec un microscope optique droit ordinaire pour l'enregistrement des régions d'intérêt. Il faut prendre soin d'éviter l'exposition à l'humidité ambiante, car elle peut être captée par l'échantillon lyophilisé et entraîner des dommages sous le nanofaisceau de rayons X. Cette procédure a été appliquée avec succès à des cellules très sensibles (c.-à-d., cellules neuronales) et des résultats encore meilleurs ont été obtenus avec d'autres types plus robustes de cellules, telles que les cellules cancéreuses. En ce qui concerne les cellules gelées à plongée, les images de fluorescence aux rayons X de K, S et Zn sur l'ensemble des cellules lyophilisées sont semblables à celles décrites ci-dessus. Ils sont représentatifs des distributions élémentaires que l'on trouve dans divers types de cellules lyophilisées à une résolution spatiale de 50 à 100 nm. Bien que le lyophilisation des cellules entières soit une alternative pour préserver l'intégrité élémentaire, il est au détriment d'une parfaite préservation de la morphologie cellulaire16, en particulier les membranes cellulaires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> Figure 1 : Support typique de l'échantillon pour la nano-analyse de la fluorescence aux rayons X. Un support de membrane De3N4 dans sa capsule protectrice. Ce type de substrat peut être utilisé à la fois pour l'analyse de la température ambiante (préparation cellulaire de gel-plunge suivie d'un processus de congélation à basse température et sous vide) ou pour l'analyse cryogénique de la fluorescence des rayons X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> Figure 2 : Vue schématique des fenêtres de nitride de silicium après l'ensemencement cellulaire. Les cellules sont cultivées directement sur la surface plane recouverte de polylysine du support membranaire Si3N4. Parfois, les bulles d'air peuvent être emprisonnées dans la cavité arrière du support membranaire Si3N4 et doivent être enlevées comme décrit dans le protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> Figure 3 : Cryo-box imprimé en 3D pour le stockage à long terme des supports à membrane Si3N4 congelés dans l'azote liquide Dewar. (A) Cryo-box démonté avec le récipient et les bouchons (partie inférieure) et (B) la cryo-boîte assemblée avec des bouchons verrouillés. Les bouchons peuvent être manipulés avec les pinces, l'ouverture ou le verrouillage par rotation. Un plan détaillé pour l'impression 3D est disponible sur demande auprès de l'ESRF ID16A. La conception a été faite pour accueillir les grilles tem de nitride de silicium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> Figure 4 : Blotting des cellules cultivées sur Si3N4. Avant de plonger-congélation de la monocouche cellulaire cultivée sur une membrane Si3N4 doit être rincé dans la solution d'acétate d'ammonium (A) et soigneusement effacé manuellement à l'aide de papier filtre (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> Figure 5 : Machine EM-GP à semi-cverre de plongée automatique. (A) Le congélateur à plongée automatique. (B) Chambre environnementale avec les pinces enfermée. (C) La tasse d'éthane recouverte du liquéfieur Leica relié à une bouteille d'éthane. (D) L'enceinte de congélation de plongée montrant la tasse noire pleine d'éthane liquéfié et la cryo-boîte pour le stockage ultérieur dans LN2 des membranes Vitrified Si3N4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> Figure 6 : Assemblage de cryotransfert d'échantillon pour la procédure de séchage par congélation. (A) Le premier récipient en laiton pour les membranes Si3N4 est monté sur le support de transfert d'échantillon fourni par le fournisseur de sécheuse à congélation. (B) et (C) montrent que le deuxième disque plat en laiton est utilisé comme couverture et agit comme un enclos à froid à insérer dans l'enceinte sous vide de la sécheuse à froid. (D) L'assemblage complet avec la tige de transfert à ressort. (E) Le porte-échantillon portant la préparation cellulaire vitrifiée cultivée sur la membrane Si3N4 doit être inséré davantage dans le séchoir à congélation Refroidi LN2. Toutes les étapes pour monter l'assemblage sont effectuées en LN2 dans une boîte en polystyrène. Pour plus de clarté, toutes les images ont été produites en l'absence de LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> Figure 7 : Images de fluorescence cryo-x d'une cellule hydratée congelée à l'aide d'une nanosonde à rayons X dur. (A) Vue en ligne typique en mode réflexion à l'aide du microscope vidéo optique dédié de la ligne de faisceau ESRF ID16A. Après le ballonnement manuel, une épaisseur totale de glace d'environ 5 à 10 m a été atteinte, ce qui permet une vue claire des cellules hydratées congelées. Une région avec des anneaux Newton indicatif de glace même beaucoup plus mince est perceptible. (B) Distributions cellulaires cellulaires de fluorescence cryo-x représentativedes des éléments physiologiques potassium (K), soufre (S) et zinc (Zn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> Figure 8 : Images de fluorescence aux rayons X d'une cellule neuronale lyophilisées à l'aide d'une nanosonde à rayons X dure. (A) Vue typique de microscopie de champ lumineux de cellules neuronales corticaux lyophilisées résultantes directement cultivées sur la membrane Si3N4. Barre à l'échelle de 200 m (B) Images représentatives de fluorescence des rayons X de la température ambiante d'un seul neurone hippocampique lyophilisé montrant la distribution d'éléments physiologiques potassium (K), soufre (S) et zinc (Zn). Barre d'échelle de 2 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Présenté ici est un protocole pour la culture cellulaire sur les membranes de nitride de silicium et de plongée-congélation avant l'imagerie de fluorescence de rayon X avec une nanosonde cryogénique synchrotron de rayon X. Lorsque seule une nano-analyse à température ambiante est fournie, les échantillons congelés peuvent être lyophilisés. Il s'agit d'étapes critiques pour obtenir des informations sur la composition élémentaire intracellulaire.

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Les nano-sondes de fluorescence synchrotron nouvellement conçues permettent la visualisation de la distribution élémentaire d’un échantillon. L’utilisation d’approches cryogéniques est obligatoire pour ralentir les dommages causés par les radiations aux rayons X. Par conséquent, une cryofixation rapide est essentielle pour obtenir des cellules hydratées congelées afin d’optimiser la préservation de la structure cellulaire et son intégrité chimique.La spécificité des préparations cellulaires pour les études synchrotron conduit à l’optimisation de ce protocole pour l’acquisition de monocouches cellulaires hydratées congelées. La démonstration visuelle est importante pour comprendre comment manipuler les échantillons de monocouche cellulaire pour atteindre des cellules cryofixed reproductiblement intégrées dans une mince couche de glace. Pour préparer un support de membrane de nitride de silicium, ouvrez la capsule contenant le soutien de membrane et pressez doucement la capsule pour desserrer légèrement le support.Utilisez de fines pinces à épiler pour saisir un coin du cadre en silicium en prenant soin de ne pas toucher la membrane de nitride de silicium au centre du cadre et placez le cadre dans une boîte de Petri découverte dans une armoire à écoulement laminaire. Ensuite, les UV stérilisent la membrane pendant 25 à 30 minutes. À la fin de la stérilisation, ajouter 10 microlitres de facteur d’attachement tels que la poly-L-lysine.Incuber pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone avec humidité. Remplissez ensuite les puits d’une plaque stérile de 48 puits de 200 à 250 microlitres de 0,22 micromètre filtré d’eau ultra pure et ultra trace par puits. Utilisez des pinces fines pour plonger soigneusement la membrane verticalement avec trois rinçages successifs de 10 secondes dans un puits d’eau.Après le rinçage, placez la membrane verticalement dans un puits vide d’une plaque stérile de 96 puits sous le capot d’écoulement laminaire et laissez-la toute la nuit jusqu’à ce qu’elle soit sèche. Pour l’ensemencement des cellules d’intérêt, placez la membrane enduite avec le côté plat face vers le haut dans un puits d’une plaque stérile de quatre puits. Ajouter cinq fois 10 aux quatre cellules dans 10 microlitres d’un milieu de culture approprié à la surface de la membrane de nitride de silicium sans toucher la membrane.La goutte doit couvrir toute la membrane. Puis la culture des cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec l’humidité. Lorsque les cellules ont commencé à s’attacher au substrat, ajoutez lentement un millilitre de milieu de culture complet sur la paroi de chaque puits couvrant chaque membrane.Puis la culture des cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec l’humidité. Pour la cryoimmobilisation de la préparation cellulaire, allumez d’abord un congélateur à plongeon automatique et remplissez le nombre approprié de puits dans une plaque en plastique de 12 puits avec un tampon d’acétate d’ammonium de 37 degrés Celsius. Immédiatement avant de rincer et de plonger le gel de la membrane, retirez l’échantillon de l’incubateur et utilisez l’anneau de pince noire d’une paire de pinces à libération rapide pour déverrouiller les pinces.Utilisez les pinces déverrouillées pour saisir le support de la membrane et plonger la membrane verticalement dans la solution tampon d’acétate d’ammonium pendant environ cinq secondes. Pour enlever tout excès de tampon, appuyez sur le fond de la membrane sur le papier filtre et épongez chaque côté du cadre sur le papier filtre sans permettre à la membrane de toucher le papier. Lorsque l’excédent de tampon a été enlevé, ouvrez la porte de la chambre environnementale, glissez rapidement les pinces dans le verrouillage des forceps et fermez la porte de la chambre.Appuyez sur blot Un plongeon. Les pinces qui retiennent la membrane du nitride de silicium seront rapidement plongées dans le cryogène. Après avoir plongé le gel, retirer le couvercle du récipient de transfert avec des forceps pré-refroidis et presser le transfert.La membrane de nitride de silicium sera déplacée légèrement au-dessus du cryogène. En un seul mouvement rapide, faites glisser et inclinez légèrement les pinces hors du verrouillage des pinces pour amener les pinces directement dans une fente vide de la cryobox dans le récipient de transfert rempli de liquide azoté. Relâchez ensuite l’anneau de pince noire pour libérer la membrane.Pour le séchage au gel des cellules gelées, utilisez l’interrupteur rocker situé sur le panneau arrière de l’instrument de séchage au gel pour alimenter l’instrument. L’affichage affichera l’entrée de presse lorsqu’il est prêt à charger l’échantillon. Montez le support en laiton de membrane de nitride de silicium sur le dessus du support de transfert d’échantillon fourni par le fournisseur dans le récipient de stockage de polystyrène gardant le niveau d’azote liquide à environ un à deux millimètres au-dessous du bord supérieur de la première pièce en laiton.Placez la membrane avec le côté échantillon cellulaire face vers le haut dans la cavité numérotée du support en laiton et pré-refroidir la tige de transfert dans une boîte en mousse de polystyrène remplie d’azote liquide. Utilisez la tige pour verrouiller l’assemblage complet, pressez pour briser le vide pour libérer le couvercle de la chambre de sécheuse, transférez immédiatement l’échantillon dans la chambre de sécheuse et fermez le couvercle de la chambre de sécheuse. Ensuite, appuyez immédiatement sur commencer à continuer avec le cycle de séchage de gel.À la fin du cycle de séchage lyophilisé, appuyez sur l’arrêt pour évacuer la chambre et retirer l’assemblage complet pour accéder aux échantillons lyophilisés. Ici, une vue typique de microscope vidéo optique des cellules congelées hydratées de ligne de cancer du sein sous-cultivés sur un soutien de membrane en silicium enduit de poly-L-lysine comme démontré est montré. La cartographie élémentaire de fluorescence aux rayons X des cellules hydratées congelées révèle la distribution d’éléments physiologiques tels que le potassium, le soufre et le zinc.Dans cet exemple représentatif, l’élément sulfuré étroitement lié a été réparti uniformément dans la cellule dans un modèle semblable à celui observé pour le potassium et représente une bonne estimation du profil cellulaire de masse. La distribution de zinc, cependant, a montré le signal plus élevé dans le noyau que dans le cytosol avec une séparation clairement définie du signal entre le cytosol et le noyau. Dans cette vue typique de microscopie de Brightfield des neurones hippocampal primaires lyophilisés de souris directement cultivés sur une membrane de nitride de silicium comme démontré, les cellules montrent une morphologie neurale typique qui n’est pas affectée par leur culture ou méthode de conservation.L’imagerie par fluorescence aux rayons X des cellules gelées de plongeon révèle également des distributions élémentaires typiques telles qu’elles sont exposées par ces cellules lyophilisée représentatives à une résolution spatiale de 50 à 100 nanomètres. Tracer la fenêtre de nitride de silicium est essentiel pour obtenir la couche de glace la plus mince possible des cellules après le gel de plongeon. La préservation de l’intégrité chimique des cellules au niveau subcellulaire permet d’explorer le métallome des cellules à l’aide de nano-sondes synchrotron ainsi qu’avec d’autres techniques microanalytiques.Comme toutes les analyses nano-sondes synchrotron ne peuvent pas être effectuées à température cryogénique, les cellules hydratées congelées peuvent être lyophilisés davantage pour faciliter leur analyse à température ambiante. N’oubliez pas d’utiliser l’équipement de protection individuelle approprié lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide et d’utiliser toujours du gaz éthane dans un capot de fumée loin des flammes.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

En ligne Taille-exclusion et d&#39;échange d&#39;ions chromatographie sur SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Recherche

Biochimie

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

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Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caractérisation des glycoprotéines dont le pli d’immunoglobuline par cristallographie aux rayons x et Techniques biophysiques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Études structurale des macromolécules en Solution à l’aide de petite diffusion des rayons x Angle

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Un porte-échantillon tout-en-un pour la cristallographie macromoléculaire de rayon X avec la diffusion minimale de fond

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Cristallographie aux rayons X pour étudier la transition oligomérique de l’État de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Collecte de données série à cible fixe à la source lumineuse Diamond

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...