Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Die Experimente an der Nano-Imaging-Beamline ID16A wurden im Rahmen der ESRF-Vorschläge LS2430, LS2303 und LS2765 durchgeführt.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) erhielt 2017 den Nobelpreis für Chemie und damit die von J. Dubochet durchgeführte Entwicklung zur Verglasung von biologischem Material zur hochauflösenden Strukturbestimmung von Biomolekülen in Lösung25. Wie Dubochet in seinem Nobelvortrag "Wissen, wie man ein Tröpfchen Wasser vitrifyn, ist eine Sache, die Vorbereitung einer biologischen Probe für die biologische Beobachtung ist eine andere"25. Kryovorbereitungsschritte gelten heute als Standardtechnik zur Minderung von Strahlendosisschäden und zur Untersuchung von Zellen in der Nähe ihres Mutterlandes. Die Vorbereitung bleibt jedoch mühsam. Dies liegt daran, dass die Elektronenmikroskopie aufgrund ihrer unübertroffenen räumlichen Auflösung empfindlich auf ultrastrukturelle Artefakte reagiert, die während der Probenvorbereitung auftreten. Die Synchrotron-Kryonanosonden nähern sich nun ähnlichen Schwierigkeiten, die auf räumliche Auflösungen von bis zu 13 nm im Hochenergie-Röntgenbereich26sinken. Die harte Röntgenmikroskopie kann ganze Zellen analysieren, während die Elektronenmikroskopie unter der schlechten Eindringtiefe von Elektronen leidet, die es ermöglicht, nur sehr dünne Zellscheiben zu beobachten.
Monolayer von Zellen sind dünn genug, so dass durch Eintauchen in flüssiges Ethan die erforderlichen Kühlraten für die Wasserverglasung erreicht werden. Theoretisch sind Kühlraten von bis zu 108 K/s mit Hochdruckgefrieren27 möglich, was die Verglasung von Proben ermöglicht, die zu dick für das Eintauchen sind. Eine Kühlleistung von 105 K/s, die erforderlich ist, um eine vollständige Verglasung der Probe bei Umgebungsdruck28zu ermöglichen, wird mit der hier vorgestellten automatischen Eintauchmaschine und den hier dargestellten Parametern reproduzierbar erreicht. Dies ermöglicht es einem Forscher, dünne biologische Proben (<10 m) wie eine Monoschicht der Zellen12,13,14,15,29,30 durch Eintauchen in flüssiges Ethan zu vitrifyn.
Eine wichtige Herausforderung bei diesem Protokoll besteht darin, auch die chemische Integrität des intrazellulären Inhalts so weit wie möglich zu erhalten, um zuverlässige Elementarverteilungen innerhalb der Zelle in 2D oder 3D zu gewährleisten. Wie an anderer Stelle veröffentlicht2,16,17,31, im Falle der elementaren Bildgebung auf subzellulärer Ebene sollte die Analyse von gefrorenen hydratisierten Zellen in Betracht gezogen werden. Ansonsten kann die Kombination aus Tauchfrost und Gefriertrocknung von Zellen für die Raumtemperaturanalyse verwendet werden. Für letztere wird das amorphe Eis durch den Prozess der Sublimation entfernt, während die gebundenen Wassermoleküle durch den Prozess der Desorption entfernt werden. Dieser Prozess kann im Vergleich zu gefrorenen hydratisierten Proben aufgrund der möglichen Veränderung der Zellmembranen und der Morphologie einiger subzellulärer Strukturen bei weitem nicht ideal sein32. Auch für Speziationsstudien kann die Wasserextraktion zu Metall-Speziationsartefakten führen. Dennoch war es erfolgreich und die beste Alternative zu gefrorenen hydratisierten Proben für elementare Bildgebung auf sub-100 nm Ebenen2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Wie berichtet37, kann die Qualität der kryokonservierten zellulären Präparate durch das Kalium-Natrium-K/Na-Verhältnis bewertet werden. Leider kann sie mit der hier verwendeten harten Röntgen-Nanosonde aufgrund der geringen Energieabschaltung des Silizium-Driftdetektors, mit dem die Röntgenfluoreszenzphotonen der Elemente (E- 1,3 keV Magnesium) erkannt werden, noch nicht ermittelt werden. Tatsächlich ist ein hohes K/Na-Verhältnis (>10), das mit TOF-SIMS, EPMA oder Kernmikrosonde PIXE16gemessen werden kann,37 ein Hinweis auf die erhaltene chemische Integrität der Zelle im Vergleich zu der erwarteten K/Na von 25 in einer lebenden Zelle37. Dies kann durch ein gleichzeitig niedriges Cl/K-Verhältnis38unterstützt werden. Dennoch kann eine unvollkommene Verglasung, insbesondere wenn die Geschwindigkeit der Probenkühlung zu niedrig ist, zur Bildung großer Eiskristalle führen, die Zellmembranen und Organellen schädigen können, was die Verteilung chemischer Elemente verändern kann. Obwohl es kein routinemäßiges Verfahren zur Überwachung dieser potenziellen Schäden und Auswirkungen auf die intrazelluläre Verteilung gibt, können die oben genannten Elementarverhältnisse und die Möglichkeit, die Zelle mit hoher Auflösung mit Röntgenphasenkontrast oder kryoweicher Röntgenmikroskopie abzubilden, die besten Ansätze sein, um eine gute Erhaltung der intrazellulären Kompartimente mit gleichzeitiger Erhaltung der elementaren Integrität zu unterstützen. Die Kombination dieser Techniken und der Einsatz neu entwickelter kryokorrelativer Fluoreszenz-Optischen Mikroskope werden dabei helfen zu beurteilen, inwieweit diese Schädigung auftritt und sich auf die intrazelluläre Elementarverteilung auswirkt.
Insgesamt wird ein detailliertes und umfassendes Protokoll zur Vorbereitung zellulärer Proben für die Synchrotron-Röntgenfluoreszenz-Nanoanalyse vorgestellt. Es ist ein guter Ausgangspunkt für die Forschungsgemeinschaft und hilft, die schwierige Frage zu lösen, wie geeignete zelluläre Proben für 2D- und 3D-Elementaraufnahmen bei (Kryo) harten Röntgen-Nanosonden vorbereitet werden können. Diese Ansätze können mit optischen Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie-Fähigkeiten für eine tiefgehende korrelative chemische und strukturelle Bildgebung von Zellen zusammengeführt werden.

Neu entwickelte Synchrotron-Röntgenfluoreszenz-Nanosonden (SR-XRF) ermöglichen eine vollständig quantitative Visualisierung der subzellulären Verteilung von Elementen. Diese analytische Fähigkeit ermöglicht beispielsweise die Untersuchung der Aufnahme von Nanopartikeln1 oder organometallischen Molekülen wie Osmium-basierten Komplexen2, die Einen Einblick in die intrazelluläre Aufnahme von metallbasierten Molekülen mit potenten Krebseigenschaften geben. Als Multielement-Technik bietet SR-XRF3 mit Nanosonde eine Möglichkeit, intrazellulär die biologisch wichtigsten Elemente wie Phosphor, Schwefel, Kalium, Kalzium, Eisen, Kupfer und Zink zu quantifizieren und zu lokalisieren. Tatsächlich bietet die Verwendung von harten Röntgenstrahlen eine große Eindringtiefe, um ganze tiefgefrorene Zellen etikettenfrei abzubilden. Darüber hinaus wird die Röntgenfluoreszenz, die den Zugriff auf die K-Kante der meisten Elemente von Interesse bietet, am effizientesten angeregt. Der Einsatz kryogener Ansätze ermöglicht die Reduzierung von Strahlungsschäden und die Optimierung der Erhaltung der Zellstruktur und der Elementarverteilung.
Die meisten verfügbaren räumlich aufgelösten Analysetechniken zum Untersuchen von Metallen in Zellen sind Oberflächentechniken, die sehr dünne und flache Zellabschnitte erfordern. Dazu gehören vor allem die Rastertransmissionselektronenmikroskopie mit energiedispersiver Röntgenanalyse (STEM-EDX), die energiegefilterte Transmissionselektronenmikroskopie (EF-TEM) und die nanoskalige Sekundärionenmassenspektrometrie (nanoSIMS). Letzteres kann nicht an gefrorenen, hydratisierten Zellabschnitten durchgeführt werden, während die Kryoanalyse mit Elektronenmikroskopie mit unübertroffener räumlicher Auflösung, aber schlechter Elementarempfindlichkeit durchgeführt werden kann. Die partikelinduzierte Röntgenemission (PIXE) ermöglichte die Untersuchung von Elementarverteilungen in ganzen Zellen. Es hat den Vorteil, dass es vollständig quantitativ mit einer fairen Elementarempfindlichkeit auf der Mikronskala und sogar bei Submikron-Auflösung4ist, aber leidet unter Strahlenschäden und mangelnden kryogenen Fähigkeiten, gefrorene hydratisierte Zellen zu untersuchen. Alle diese Analysetechniken ergänzen sich in der elementaren Abbildung von Zellen, aber für alle Techniken ist das Probenvorbereitungsverfahren ein entscheidender Schritt. Es sollte einfach gehalten werden, mögliche Kontaminationen sowie elementare Umverteilung und/oder Leckage zu begrenzen, um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen. Wie in der Elektronenmikroskopie gezeigt, ermöglicht ein kryogener Arbeitsablauf, einschließlich Kryo-Immobilisierung der Zelle und Kryotransfer in ein Kryoscan-Stadium, eine optimale elementare Konservierung auf subzellulärer Ebene so nah wie möglich am nativen Zustand5,6,7,8,9,10. Dieses Verständnis wurde erfolgreich in die Entwicklung der Synchrotron-Kryo-Soft-Röntgenmikroskopie (z.B. Vollfeldmikroskope und Rastermikroskope) umgesetzt, um ultrastrukturelle Bildgebung ganzer gefrorenhydratisierter Zellen in 2D oder 3D zu erzeugen. Verschiedene kryogene Arbeitsabläufe wurden11 für weiche Röntgenmikroskope bei Beamline 2.1 (XM-2) der Advanced Light Source am Lawrence Berkeley National Laboratory12entwickelt, Beamline U41-XM am Elektronenspeicherring BESSY II (Deutschland)13, Beamline MISTRAL der ALBA Lichtquelle (Spanien)14, und bei Beamline B24 der Diamantlichtquelle15, unter anderem. Ein ähnlicher Workflow erwies sich kürzlich als die zuverlässigste Methode zur Herstellung und Konservierung der intrazellulären Elementaranalyse mit Röntgenmikrosonden16,17.
Obwohl Röntgen-Nanosonden-Techniken beginnen, weit verbreitet für zelluläre Elementaranalyse verwendet werden, vor allem mit dem Aufkommen von kryogenen SR-XRF-Fähigkeiten, wurde bisher kein stufenweisen Protokoll an die Forschungsgemeinschaft verbreitet. Hier beieinem detaillierten Verfahren wird ein detailliertes Verfahren zur Herstellung kryofixierter haftierter, als Monolayer auf Siliziumnitridmembranen kultivierten, die unter kryogenen Bedingungen analysiert werden sollen. Ein Gefriertrocknungsschritt, der nach dem Protokoll angewendet werden muss, falls die Röntgenanalyse bei Raumtemperatur durchgeführt werden muss, ist ebenfalls vorgesehen. Während das vorgeschlagene Protokoll erfolgreich mit menschlichen Brustkrebszellen MD-MB-2312 verwendet wurde und die Gefriertrocknung unter anderem an Den Mausneuronen18,20,21gezeigt wurde, kann es leicht auf verschiedene Arten von menschlichen oder tierischen Zellen ausgedehnt werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

Über die Verteilung von Metallionen auf subzellulärer Ebene ist nur sehr wenig bekannt. Diese chemischen Elemente haben jedoch wesentliche regulatorische Funktionen und ihre gestörte Homöostase ist an verschiedenen Krankheiten beteiligt. Modernste Synchrotron-Röntgenfluoreszenz-Nanosonden bieten die erforderliche Empfindlichkeit und räumliche Auflösung, um die zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) Verteilung und Konzentration von Metallen in ganzen Zellen an der Organelle-Ebene. Dies eröffnet neue spannende wissenschaftliche Forschungsfelder zur Rolle von Metallen in der Physiopathologie der Zelle. Die zelluläre Vorbereitung ist ein schlüsseleines und oft komplexes Verfahren, insbesondere für die Basisanalyse. Obwohl Röntgenfluoreszenztechniken inzwischen weit verbreitet sind und verschiedene Präparationsmethoden verwendet wurden, haben nur sehr wenige Studien die Erhaltung des Elementargehalts von Zellen bestenfalls untersucht, und kein schrittweises detailliertes Protokoll für die Kryovorbereitung von anhaftende Zellen für Röntgenfluoreszenz-Nanosonden wurden bisher freigesetzt. Dies ist eine Beschreibung eines Protokolls, das die schrittweise zelluläre Vorbereitung für eine schnelle Kryofixierung bereitstellt, um die Synchrotron-Röntgenfluoreszenz-Nanoanalyse von Zellen in einem gefrorenen hydratisierten Zustand zu ermöglichen, wenn eine kryogene Umgebung und Übertragung verfügbar ist. Für den Fall, dass eine Nanoanalyse bei Raumtemperatur durchgeführt werden muss, wird ein zusätzliches Verfahren zur Gefriertrocknung der kryofixierten zellulären Präparation vorgesehen. Die vorgeschlagenen Protokolle wurden in früheren Arbeiten erfolgreich eingesetzt, zuletzt bei der Untersuchung der 2D- und 3D-intrazellulären Verteilung einer organometallischen Verbindung in Brustkrebszellen.

Eine typische optische Videomikroskopansicht von gefrorenen hydratisierten MDA-MB-231-Zellen, die auf eine poly-L-Lysin beschichtete Si3N4 Membranunterstützung subkultiviert wurden, ist in Abbildung 7Adargestellt. Die optische Ansicht der Probe in der Vakuumkammer wurde im Reflexionsmodus mit dem speziellen Online-Videomikroskop der ID16A-Beamline des ESRF22erhalten. Während die Elektronen- oder Weichröntgenmikroskopie erfordert, dass die Eisschicht, die die Zelle einbettet, so dünn wie möglich ist (typischerweise <0,5 m), haben harte Röntgenstrahlen (>10 keV) den Vorteil einer viel höheren Eindringtiefe und einer niedrigeren Dosisabscheidung. Die Eisdicke kann daher größer sein, typischerweise <10 m einschließlich der Zelle, so dass das Eis, das die Zelle einbettet, ein paar m dicke ist. Dies kann durch die gemessene Röntgenintensität bei der Übertragung im Vergleich zur Intensität ohne die Probe unter Berücksichtigung der Absorption der 500 nm dicken Si3N4 Membran geschätzt werden. Diese Eisdicke kann durch manuelles Blotting erreicht werden, wie im vorliegenden Protokoll beschrieben. Im Bereich der Newton-Ringe kann die Eisdicke noch dünner (nicht gemessen) werden.
Die Röntgenfluoreszenz-Elementarkartierung der gefrorenen hydratisierten Zelle ist in Abbildung 7B mit den repräsentativen Verteilungen physiologischer Elemente wie Kalium (K), Schwefel (S) und Zink (Zn) dargestellt. Diese Karten stellen die elementare areale Masse (d. h. die elementare projizierte Masse) dar. Obwohl dies im vorliegenden Fall nicht der Fall ist, können solche Karten durch röntgenbasierte Propagierungs-basierte Phasenkontrast-Bildgebung normalisiert werden, die die Schätzung der projizierten Masse der Probe23liefert. Wie in vielen Studien berichtet, wurde angenommen, dass das stark diffusible K-Ionen in Zellen, die in ihrem nah nativen Zustand konserviert wurden, homogen über die gesamte Zelle23,24,16verteilt war. Wie in den 2D-Röntgenfluoreszenz-Elementarbildern in Abbildung 7Bdargestellt, war das eng gebundene Element S ähnlich wie K gleichmäßig innerhalb der Zelle verteilt und stellt eine gute Schätzung des zellulären Massenprofils dar. Die Zn-Verteilung hatte ein höheres Signal im Kern als im Zytosol und umriss den Kern klar. Es ist anzumerken, dass kleine Zn-angereicherte Regionen bei der räumlichen Auflösung (50 nm) im Nuklearbereich nachgewiesen werden können.
Die vorhandenen Röntgen-Nanosonden oder die zu bauenden sind nicht unbedingt kryogenen Fähigkeiten rechnung. In diesem Fall ist die beste Alternative, Um Röntgenfluoreszenzbilder von Zellen mit sub-100 nm räumlichen Auflösungen zu erhalten, ein in diesem Protokoll beschriebenes Gefriertrocknungsverfahren nach dem Einfrieren der Zelle durchzuführen. Abbildung 8A zeigt eine typische Hellfeldmikroskopieansicht der resultierenden gefriergetrockneten primären Maus-Hippocampus-Neuronen, die direkt auf der Si3N4 Membran kultiviert werden. In diesem Fall können die Proben, wenn sie in einer sauberen Trockenkammer gelagert werden, 1-2 Wochen im Voraus vorbereitet und mit einem gewöhnlichen aufrechten optischen Mikroskop zur Registrierung von Interessengebieten beobachtet werden. Es sollte darauf geachtet werden, die Exposition gegenüber Der Umgebungsfeuchtigkeit zu verhindern, da sie von der gefriergetrockneten Probe erfasst werden kann und zu Schäden unter dem Röntgen-Nanostrahl führen kann. Dieses Verfahren wurde erfolgreich auf sehr empfindliche Zellen (d. h. neuronale Zellen) angewendet und noch bessere Ergebnisse wurden mit anderen robusteren Zelltypen, wie Krebszellen, erzielt. Was die tauchgefrorenen Zellen betrifft, so ähneln die Röntgenfluoreszenzbilder von K, S und Zn auf dem gesamten gefriergetrockneten Zelldisplay den oben beschriebenen. Sie sind repräsentativ für die Elementarverteilungen, die in verschiedenen Arten von gefriergetrockneten Zellen mit einer räumlichen Auflösung von 50 bis 100 nm zu finden sind. Während das Einfrieren von ganzen Zellen eine Alternative zur Erhaltung der elementaren Integrität ist, geht es auf Kosten einer perfekten Konservierung der Zellmorphologie16,insbesondere der Zellmembranen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> Abbildung 1: Typische Probenunterstützung für röntgenfluoreszenz-Nanoanalysen. Eine Si3N4 Membranstütze in ihrer Schutzkapsel. Diese Art von Substrat kann sowohl für die Raumtemperaturanalyse (Plunge-Freeze-Zellpräparation gefolgt von niedrigtemperatur- und vakuumarmem Gefriertrocknungsprozess) als auch für die kryogene Röntgenfluoreszenzanalyse verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Ansicht der Siliziumnitridfenster nach dem Aussäen der Zelle. Die Zellen werden direkt auf die poly-L-Lysin beschichtete flache Oberfläche der Si3N4 Membranträger kultiviert. Manchmal können Luftblasen in der hinteren Kavität der Si3N4 Membranstütze gefangen werden und müssen wie im Protokoll beschrieben entfernt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> Abbildung 3: Eigenentwickelte 3D-gedruckte Kryobox zur Langzeitlagerung von tauchgefrorenen Si3N4 Membranstützen in flüssigem Stickstoff Dewar. (A) Kryo-Box mit dem Behälter und den Kappen (unterer Teil) und (B) der montierten Kryo-Box mit verschlossenen Kappen zerlegt. Die Kappen können mit der Pinzette manipuliert werden, öffnen oder verriegeln durch Drehung. Ein detaillierter Plan für den 3D-Druck ist auf Anfrage bei ESRF ID16A erhältlich. Das Design wurde für Siliziumnitrid-TEM-Gitter hergestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> Abbildung 4: Blotting von Zellen, die auf Si3N 4 kultiviertwerden. Vor dem Einfrieren muss die auf eine Si3N4-Membran kultivierte Zellmonoschicht in Ammoniumacetatlösung (A) abspült und sorgfältig manuell mit Filterpapier (B)geblutet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> Abbildung 5: Automatisches Einfrieren em-GP Maschine. (A) Der automatische Tauchgefrierschrank. (B) Umweltkammer mit eingeschlossener Pinzette. (C) Der Ethanbecher, der mit dem Leica-Verflüssiger bedeckt ist, der mit einer Ethanflasche verbunden ist. (D) Das Gefriergehäuse mit dem schwarzen Becher voller verflüssigtem Ethan und der Kryo-Box zur weiteren Lagerung in LN2 der verglasten Si3N4 Membranen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> Abbildung 6: Probenkryotransfer-Baugruppe für Gefriertrocknungsverfahren. (A) Der erste Messingempfänger für Si3N4 Membranen ist auf dem vom Gefriertrocknerlieferanten bereitgestellten Probentransferhalter montiert. (B) und (C) zeigen, dass die zweite flache Messingscheibe als Abdeckung verwendet wird und als Kaltfanggehäuse dient, das in das Vakuumgehäuse des Gefriertrockners eingesetzt werden soll. (D) Die Vollmontage mit dem federbelasteten Transferstab. (E) Der Probenhalter, der die verglaste Zellzubereitung auf der Membran Si3N4 trägt, muss weiter in den LN2-gekühltenGefriertrockner eingesetzt werden. Alle Schritte zur Montage der Montage erfolgen in LN2 in einer Styroporbox. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurden alle Bilder in Abwesenheit von LN2erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> Abbildung 7: Kryo-Röntgenfluoreszenz-Bilder einer gefrorenen hydratisierten Zelle mit harter Röntgen-Nanosonde. (A) Typische Online-Ansicht im Reflexionsmodus mit dem dedizierten optischen Videomikroskop der ESRF ID16A Beamline. Nach der manuellen Blotting wurde eine Gesamteisdicke von ca. 5 x 10 m erreicht, die eine klare Sicht auf die gefrorenen hydratisierten Zellen ermöglicht. Eine Region mit Newton-Ringen, die auf noch viel dünneres Eis hindeuten, ist spürbar. (B) Repräsentative Kryo-Röntgen-Fluoreszenz zelluläre Verteilungen der physiologischen Elemente Kalium (K), Schwefel (S) und Zink (Zn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> Abbildung 8: Röntgenfluoreszenzbilder einer gefriergetrockneten neuronalen Zelle mit harter Röntgen-Nanosonde. (A) Typische Hellfeldmikroskopieansicht der resultierenden gefriergetrockneten primären kortikalen Zellen, die direkt auf die Si3N4 Membran kultiviert werden. Skala bar = 200 m (B) Repräsentative Raumtemperatur-Röntgenfluoreszenzbilder eines einzelnen gefriergetrockneten Hippocampus-Neurons, das die Verteilungen der physiologischen Elemente Kalium (K), Schwefel (S) und Zink (Zn) zeigt. Maßstabsleiste = 2 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Hier wird ein Protokoll zur Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und zum Einfrieren vor der Röntgenfluoreszenz-Bildgebung mit einer synchromtronen kryogenen Röntgensonde vorgestellt. Wenn nur raumtemperaturnano-analyse zur Verfügung gestellt wird, können die gefrorenen Proben weiter gefriergetrocknet werden. Dies sind wichtige Schritte, um Informationen über die intrazelluläre elementare Zusammensetzung zu erhalten.

Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und Kryovorbereitung für Synchrotron-Röntgenfluoreszenz Nano-Analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Neu entwickelte Synchrotron-Röntgenfluoreszenz-Nanosonden ermöglichen die Visualisierung der elementaren Verteilung einer Probe. Die Verwendung kryogener Ansätze ist obligatorisch, um Die Schäden an Röntgenstrahlung zu verlangsamen. Daher ist eine schnelle Kryofixierung unerlässlich, um gefrorene hydratisierte Zellen zu erhalten, um die Erhaltung der Zellstruktur und ihre chemische Integrität zu optimieren.Die Spezifität der zellulären Präparate für Synchrotronstudien führt zur Optimierung dieses Protokolls für den Erwerb gefrorener hydratisierter Zellmonolayer. Visuelle Demonstration ist wichtig, um zu verstehen, wie man die Zellmonolayer-Proben manipuliert, um reproduzierbar kryofixierte Zellen zu erreichen, die in eine dünne Eisschicht eingebettet sind. Um eine Siliziumnitrid-Membranstütze vorzubereiten, öffnen Sie die Kapsel mit der Membranstütze und drücken Sie die Kapsel vorsichtig, um die Stütze leicht zu lösen.Verwenden Sie dünne Pinzette, um eine Ecke des Siliziumrahmens zu greifen, wobei darauf zu achten ist, dass die Siliziumnitridmembran in der Mitte des Rahmens nicht berührt wird, und legen Sie den Rahmen in eine ungedeckte Petrischale in einem laminaren Strömungsschrank. Anschließend sterilisiert UV die Membran für 25 bis 30 Minuten. Am Ende der Sterilisation 10 Mikroliter Befestigungsfaktor wie Poly-L-Lysin hinzufügen.25 Minuten bei 37 Grad Celsius und bei 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit inkubieren. Dann füllen Sie die Brunnen einer sterilen 48-Well-Platte mit 200 bis 250 Mikroliter 0,22 Mikrometer gefiltertultrar und Ultra-Spurenwasser pro Brunnen. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Membran vorsichtig vertikal mit drei aufeinanderfolgenden 10-Sekunden-Spülungen in einem Brunnen mit Wasser zu untertauchen.Nach dem Spülen die Membran vertikal in einen leeren Brunnen einer sterilen 96-Well-Platte unter die laminare Strömungshaube legen und über Nacht bis zum Trocknen lassen. Für die Aussaat der von Interesse interessierten Zellen die beschichtete Membran mit der flachen Seite nach oben in einem Brunnen einer sterilen Vier-Brunnen-Platte legen. Fügen Sie den vier Zellen in 10 Mikrolitern eines geeigneten Kulturmediums fünfmal 10 Zellen zur Oberfläche der Siliziumnitridmembran hinzu, ohne die Membran zu berühren.Der Tropfen sollte die gesamte Membran abdecken. Dann kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit. Wenn die Zellen begonnen haben, sich an das Substrat zu heften, fügen Sie langsam einen Milliliter komplettes Kulturmedium an die Wand jedes Brunnens hinzu, der jede Membran bedeckt.Dann kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit. Für die Kryoimmobilisierung der zellulären Zubereitung zuerst einen automatischen Tauchgefrierschrank einschalten und die entsprechende Anzahl von Brunnen in einer 12-Well-Kunststoffplatte mit 37 Grad Celsius Ammoniumacetatpuffer füllen. Unmittelbar vor dem Spülen und Tauchen der Membran, entfernen Sie die Probe aus dem Inkubator und verwenden Sie den schwarzen Klemmring einer Schnellspannzange, um die Pinzette zu entsperren.Verwenden Sie die entsperrte Pinzette, um die Membranstütze zu erfassen und die Membran für etwa fünf Sekunden vertikal in die Ammoniumacetat-Pufferlösung einzutauchen. Um überschüssige Puffer zu entfernen, drücken Sie die Unterseite der Membranstütze auf Filterpapier und bteilen Sie jede Seite des Rahmens auf das Filterpapier, ohne dass die Membran das Papier berühren kann. Wenn der überschüssige Puffer entfernt wurde, öffnen Sie die Umweltkammertür, schieben Sie die Pinzette schnell in die Zangenverriegelung und schließen Sie die Tür der Kammer.Drücken Sie Blot Ein Sprung. Die Pinzette, die die Siliziumnitridmembran hält, wird schnell in das Kryogen gestürzt. Nach dem Einfrieren den Deckel des Transferbehälters mit vorgekühlten Zangen und Pressentransfer entfernen.Die Siliziumnitridmembran wird leicht über dem Kryogen bewegt. In einer schnellen Einzelbewegung schieben und kippen Sie die Pinzette leicht aus der Zangenverriegelung, um die Pinzette direkt in einen leeren Schlitz der Kryobox im mit Stickstoffflüssigkeit gefüllten Transferbehälter zu bringen. Lassen Sie dann den schwarzen Klemmring los, um die Membran zu befreien.Zum Einfrieren der Gefriertrocknung der tauchgefrorenen Zellen verwenden Sie den Wippschalter auf der Rückseite des Gefriertrocknungsgeräts, um das Gerät einzuschalten. Auf dem Display wird die Drucktaste angezeigt, wenn die Probe geladen werden kann. Montieren Sie den Siliziumnitrid-Membran-Messinghalter auf den vom Lieferanten bereitgestellten Probentransferhalter im Polystyrol-Lagerbehälter, wodurch der Gehalt an flüssigem Stickstoff etwa ein bis zwei Millimeter unter der Oberkante des ersten Messingstücks liegt.Legen Sie die Membran mit der Zellprobenseite nach oben in den messinghalternummerierten Hohlraum und kühlen Sie den Transferstab in einer flüssigen, mit Stickstoff gefüllten Polystyrolschaumbox vor. Verwenden Sie die Stange, um in der vollmontage zu verriegeln, drücken Sie enter, um das Vakuum zu brechen, um den Deckel der Gefriertrocknerkammer zu lösen, sofort die Probe in die Gefriertrocknerkammer zu übertragen, und schließen Sie den Gefriertrockner-Kammerdeckel. Dann sofort drücken Sie beginnen, um mit dem Gefriertrocknungszyklus fortzufahren.Drücken Sie am Ende des Gefriertrocknungszyklus den Stopp, um die Kammer zu entlüften, und entfernen Sie die vollständige Baugruppe, um auf die gefriergetrockneten Proben zuzugreifen. Hier wird eine typische optische Videomikroskopansicht von gefrorenen hydratisierten Brustkrebszellzellen gezeigt, die auf eine poly-L-Lysin beschichtete Siliziumnitridmembranunterstützung subkultiviert werden. Die Röntgenfluoreszenz-Elementarkartierung der gefrorenen hydratisierten Zellen zeigt die Verteilung physiologischer Elemente wie Kalium, Schwefel und Zink.In diesem repräsentativen Beispiel war das eng gebundene Schwefelelement gleichmäßig innerhalb der Zelle in einem ähnlichen Muster wie bei Kalium verteilt und stellt eine gute Schätzung des zellulären Massenprofils dar. Die Zinkverteilung zeigte jedoch ein höheres Signal im Kern als im Zytosol mit einer klar definierten Trennung des Signals zwischen Zytosol und Kern. In dieser typischen Brightfield-Mikroskopie-Ansicht von gefriergetrockneten primären Maus-Hippocampus-Neuronen, die direkt auf einer Siliziumnitridmembran kultiviert werden, wie gezeigt, zeigen die Zellen eine typische neuronale Morphologie, die von ihrer Kultur oder Konservierungsmethode nicht beeinflusst wird.Röntgenfluoreszenz-Bildgebung von tauchgefrorenen Zellen zeigt auch typische Elementarverteilungen, wie sie von diesen repräsentativen gefriergetrockneten Zellen mit einer räumlichen Auflösung von 50 bis 100 Nanometern gezeigt werden. Das Plotten des Siliziumnitridfensters ist entscheidend, um die dünnste mögliche Eisschicht von Zellen nach dem Einfrieren zu erhalten. Die Erhaltung der chemischen Integrität der Zellen auf subzellulärer Ebene ermöglicht die Erforschung des Metalloms der Zellen mit Synchrotron-Nanosonden sowie mit anderen mikroanalytischen Techniken.Da nicht alle Synchrotron-Nanosondenanalysen bei kryogener Temperatur durchgeführt werden können, können die gefrorenen hydratisierten Zellen weiter gefriergetrocknet werden, um ihre Analyse bei Raumtemperatur zu erleichtern. Denken Sie daran, bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff geeignete persönliche Schutzausrüstungen zu verwenden und ethangas immer in einer Dunstabzugshaube zu verwenden, die von Flammen entfernt ist.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Forschung

Biochemie

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle Studien von Makromolekülen in Lösung mit kleinen Winkel Röntgenstreuung

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Ein All-in-One-Probenhalter für makromolekulare Röntgenkristallographie mit minimaler Hintergrundstreuung

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Röntgenkristallographie zur Untersuchung des oligomeren Zustandsübergangs der Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...