Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

הניסויים על הננו-הדמיה beamline ID16A בוצעו במסגרת של הצעות ESRF LS2430, LS2303, ו LS2765.

<ol>
	<li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage/genotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors.">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li><li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging.">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li><li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , (2000).</li><li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity,+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions,+and+down+regulation+of+MAO-B.">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li><li>Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+low+calcium+concentrations+in+cryosectioned+cells+by+parallel-EELS+mapping.">Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping.</a> Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).</li><li>Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+scanning+electron+microscopy+to+X-ray+analysis+of+frozen+hydrated+sections.+I.+Specimen+handling+techniques.">Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques.</a> Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).</li><li>Saubermann, A. J., Heyman, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections.">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, 169-182 (1987).</li><li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells.">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1875-1882 (1984).</li><li>Wroblewski, J., M&#252;ller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+X-ray+microanalysis+of+semi-thick+cryosections.">Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections.</a> Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).</li><li>Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreparation+of+mammalian+tissue+for+X-ray+microanalysis+in+STEM.">Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM.</a> Journal of Microscopy. 125, 149-156 (1982).</li><li>Harkiolaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-soft+X-ray+tomography:+Using+soft+X-rays+to+explore+the+ultrastructure+of+whole+cells.">Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).</li><li>McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+X-ray+tomography+and+cryogenic+light+microscopy:+the+cool+combination+in+cellular+imaging.">Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).</li><li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy.">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).</li><li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MISTRAL:+a+transmission+soft+X-ray+microscopy+beamline+for+cryo+nano-tomography+of+biological+samples+and+magnetic+domains+imaging.">MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).</li><li>Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+tomography+of+adherent+cells+at+European+synchrotrons.">Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons.</a> Methods in Cell Biology. 124, 151-175 (2014).</li><li>Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+single+cell+quantitative+elemental+imaging+using+proton+or+synchrotron+radiation+focused+beams.">Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+elemental+content+in+adherent+mammalian+cells+for+analysis+by+synchrotron-based+x-ray+fluorescence+microscopy.">Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+manganese+on+primary+hippocampal+neurons+from+rodents.">Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents.</a> Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+Cytotoxicity+Assay+on+Hippocampal+Neuronal+Cell+Culture.">Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture.</a> Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).</li><li>Gibon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+over-expression+of+TRPC6+channels+in+HEK-293+cells+favours+the+intracellular+accumulation+of+zinc.">The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).</li><li>Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Uptake+and+Storage+During+the+Formation+of+the+Cerebral+Cortex+in+Mice.">Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice.</a> Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).</li><li>Villar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopositioning+for+the+ESRF+ID16A+Nano-Imaging+Beamline.">Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline.</a> Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).</li><li>Kosior, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+hard+X-ray+phase+contrast+imaging+and+X-ray+fluorescence+microscopy+for+subcellular+metal+quantification.">Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification.</a> Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).</li><li>Bohic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrotron+hard+X-ray+microprobe:+fluorescence+imaging+of+single+cells.">Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells.</a> Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Development+of+Electron+Cryo-Microscopy+(Nobel+Lecture).">On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture).</a> Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).</li><li>Da Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+concentration+of+high-energy+X-rays+for+diffraction-limited+imaging+resolution.">Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution.</a> Optica. 4 (5), 492-495 (2017).</li><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high-pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+pratice+of+high+pressure+freezing.">Theory and pratice of high pressure freezing.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrarapid+freezing+for+the+preservation+of+cellular+ultrastructure.">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).</li><li>Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryo-Tomography.">Electron Cryo-Tomography.</a> Cellular Imaging. , 61-94 (2018).</li><li>Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+metal+content+and+intracellular+distribution+in+primary+hippocampal+neurons+with+synchrotron+X-ray+fluorescence.">Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence.</a> PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).</li><li>Vavpeti&#269;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+distribution+and+sample+integrity+comparison+of+freeze-dried+and+frozen-hydrated+biological+tissue+samples+with+nuclear+microprobe.">Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).</li><li>Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-preparation+procedures+for+elemental+imaging+by+sims+and+eftem.">Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem.</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 499-536 (2008).</li><li>Gramaccioni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+quantification+of+intracellular+element+concentration+by+X-ray+fluorescence+microscopy+combined+with+X-ray+phase+contrast+nanotomography.">Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography.</a> Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).</li><li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+and+Copper+Effects+on+Stability+of+Tubulin+and+Actin+Networks+in+Dendrites+and+Spines+of+Hippocampal+Neurons.">Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons.</a> ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).</li><li>Ortega, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+over-expression+induces+increased+iron+accumulation+and+redistribution+in+iron-exposed+neurons.">&#945;-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).</li><li>Fartmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+atomic+and+molecular+species+in+cancer+cultures+with+TOF-SIMS+and+Laser-SNMS.">Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS.</a> Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).</li><li>P&#229;lsg&#229;rd, E., Lindh, U., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+freeze-substitution+techniques+for+X-ray+microanalysis+of+biological+tissue.">Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue.</a> Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).</li></ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

מיקרוסקופ ההקפאה-אלקטרונים זכה בפרס נובל 2017 בכימיה וככזה הפיתוח של J. Dubochet על ויטריפיקציה של חומר ביולוגי לקביעת המבנה ברזולוציה גבוהה של biomolecules בפתרון25. כפי שדווח על-ידי Dubochet בהרצאה הנובל שלו "לדעת כיצד לחזק את ה-droplet של מים הוא דבר אחד, הכנת דוגמה ביולוגית להתבוננות ביולוגית היא עוד"25. הקפאה צעדים נחשבים כעת את הטכניקה הסטנדרטית כדי לרכך את הנזק למינון קרינה ותאי הלימוד קרוב מדינה מקורית שלהם. ההכנה נותרת מייגעת, עם זאת. הסיבה לכך היא מיקרוסקופ אלקטרוני, בשל הרזולוציה המרחבית מתחרות שלה, הוא רגיש לכל חפץ אולטרה מבנית המתרחשת במהלך ההכנה לדוגמה. סינכרוטרון cryonanoprobes הם כעת מתקרבים קשיים דומים יורדים לרזולוציות מרחבית נמוך כמו 13 ננומטר באנרגיה גבוהה רנטגן טווח26. מיקרוסקופ רנטגן קשיח יכול לנתח תאים שלמים בעוד המיקרוסקופיה אלקטרונית סובלת מעומק החדירה המסכן של אלקטרונים המאפשרים רק פרוסות תא דקות מאוד כדי להיות שנצפו.
מונאולאיירס של תאים הם דקים מספיק כך על ידי הקפאת לצלול ב ethane נוזלי, את שיעורי הצינון הנדרש עבור המים ויטריפיקציה מושגת. בתאוריה, שיעורי צינון גבוה כמו 108 K/s אפשריים באמצעות הלחץ הגבוה בהקפאה27 המאפשר ויטריפיקציה של דגימות עבה מדי לקפוא לצלול. שיעור קירור של 105 K/s, נדרש כדי לאפשר ויטריפיקציה מלא של המדגם בלחץ הסביבתי28, הוא הגיע לידי באמצעות מכונת ההקפאה האוטומטית לצלול ופרמטרים הציג כאן. הדבר מאפשר לחוקר לזייף דגימות ביולוגיות דקות (< 10 μm) כגון מונאולייר של תאים12,13,14,15,29,30 על ידי הקפאת לצלול באתאן הנוזלי.
אתגר חשוב עם פרוטוקול זה הוא גם לשמר ככל האפשר את השלמות הכימית של התוכן תאיים כדי לספק הפצות היסודות אמין בתוך התא 2D או 3D. כפי שפורסם במקום אחר2,16,17,31, במקרה של הדמיה היסודות ברמה subcellular, ניתוח של תאים קפואים מוקפאים צריך להיחשב. אחרת, ניתן להשתמש בשילוב של הקפאת לצלול וייבוש של תאים לניתוח טמפרטורת החדר. עבור האחרון, הקרח אמורפיות מוסר באמצעות תהליך סובלימציה, בעוד מולקולות המים מאוגד מוסרים באמצעות תהליך של desorption. תהליך זה עשוי להיות רחוק מאידיאל בהשוואה לדוגמיות שהוקפאו בשל השינוי האפשרי של הקרומים הסלולאריים והמבנה של כמה מבני subcellular32. כמו כן, ללימודי היווצרות המינים, הפקת המים עלולה להוביל לחפצי מין מתכתיים. עדיין, זה היה מוצלח ואת החלופה הטובה ביותר כדי קפוא דגימות בהתייבשות עבור הדמיה היסודות ב-sub-100 ננומטר רמות2,16,17,18,20,33,34,35,36.
כפי שדווחו37, האיכות של קריואופרסטית הסלולר ההכנות ניתן להעריך באמצעות אשלגן ל-נתרן היחס K/Na. למרבה הצער, זה עדיין לא יכול להיות נחוש עם רנטגן קשה nanoprobe משמש כאן, בשל האנרגיה הנמוכה לגזור של גלאי הסחף סיליקון השתמשו כדי לזהות את הפוטונים הזריחה של הרנטגן של האלמנטים (E ≥ 1.3 מגנזיום הקוו). אכן, יחס k/Na גבוה (> 10) כי ניתן למדוד באמצעות תוף-סימס, epma, או מיקרודיקה גרעינית pixe16,37 מעיד על שלמות כימית שנשמר של התא לעומת הצפוי K/Na של 25 בתא חי37. הדבר יכול להיות נתמך על ידי היחס הנמוך Cl/K38. עדיין, הויטריפיקציה לא מושלמים, במיוחד אם מהירות הצינון המדגם נמוכה מדי, עלולה להוביל להיווצרות גבישי קרח גדולים שעלולים להזיק לקרומים של תאים ולאורגלים, ובכך לשנות את התפלגות היסודות הכימיים. למרות שאין הליך שגרתי כדי לנטר את הנזק הפוטנציאלי וההשפעה על התפלגות תאיים, היחס הבסיסי לעיל ואת האפשרות לדמות את התא ברזולוציה גבוהה באמצעות x-ray בשלב הניגודיות או ההקפאה רך רנטגן מיקרוסקופ יכול להיות הגישות הטובות ביותר לתמוך שימור טוב של תאים תאיים עם שימור במקביל של ה השילוב של טכניקות אלה והשימוש של מיקרוסקופים אופטי החדש שפותחו מיקרוסקופ אופטיים יסייע להעריך מה במידה נזק זה מתרחש ומשפיע על התפלגות תאיים היסודות.
באופן כללי, פרוטוקול מפורט ומקיף להכנת דגימות סלולריות עבור סינכרוטרון X-ray פלואורסצנטית ננו מוצג. זוהי נקודת התחלה טובה לקהילת המחקר, עוזר לפתור את הסוגיה קשה של איך להכין דגימות תאים המתאים עבור 2D ו 3D הדמיה היסודות ב (ההקפאה) קשה רנטגן nanoprobes. ניתן למזג גישות אלה בעזרת קרינה אופטית ומיקרוסקופית אלקטרונים בעזרת יכולות מיקרוסקופ מעמיק והדמיה מבנית של תאים.

החדש תוכנן סינכרוטרון רנטגן X-ray (SR-XRF) nanoprobes אפשר ויזואליזציה של התפלגות subcellular של אלמנטים בצורה כמותית מלאה. כדוגמה, יכולת אנליטית זו מאפשרת חקירה של ספיגת חלקיקים1 או אורגנומתכתית מולקולות כגון osmium מבוססי מתחמי2, מתן תובנה לספיגת תאיים של מולקולות מבוססות מתכת עם תכונות נוגדות סרטן חזקים. כטכניקה multielement, SR-XRF3 עם nanoprobe מספק דרך בו לכמת ולוקליזציה intracellularly האלמנטים החשובים ביותר ביולוגית, כולל זרחן, גופרית, אשלגן, סידן, ברזל, נחושת, אבץ. אכן, השימוש בקרני רנטגן קשים מספק עומק חדירה גדול לתמונה כולה מוקפא תאים בצורה ללא תווית. יתר על כן, מתן גישה K-edge של רוב האלמנטים של העניין, הזריחה רנטגן מתרגש ביותר ביעילות. השימוש בגישות קריוגני מאפשר הפחתת נזק לקרינה ואופטימיזציה של שימור מבנה התא והפצה אלמנטלים.
מרבית הטכניקות האנליטיות הזמינות ביותר לחקר מתכות בתאים הן טכניקות משטח הדורשות חלקים דקים מאוד ושטוחים של תאים להיות מיוצרים. זה כולל בעיקר סריקת הילוכים אלקטרון מיקרוסקופ עם אנרגיה-מפזרים רנטגן ניתוח (גזע-EDX), אנרגיה מסוננים שידור אלקטרון מיקרוסקופ אלקטרוני (EF-TEM), ו-בקנה מידה ננו המוני יון משני ספקטרומטריה (nanoSIMS). האחרון לא יכול להתבצע על קפוא, מקטעים תאים בתוך ההקפאה ניתן לעשות עם המיקרוסקופיה אלקטרונית עם רזולוציה מרחבית מתחרות אך רגישות היסודות העניים. פליטת החלקיקים המושרה רנטגן (PIXE) אפשרה לחקר הפצות היסודות בתאים שלמים. יש לו את היתרון של להיות כמותיים לחלוטין עם רגישות היסודות הוגן בסולם מיקרון ואפילו ברזולוציה יקרונים יקרון4, אבל סובל מנזקי קרינה וחוסר יכולות קריוגניים לחקור תאים קפואים. כל הטכניקות האנליטיות האלה משלימים אחד את השני בהדמיה היסודות של תאים, אבל לכל הטכניקות הליך ההכנה לדוגמה הוא צעד מכריע. זה צריך להישמר פשוט כדי להגביל את הזיהום האפשרי, כמו גם היסודות להפצה משמעותית ו/או דליפה כדי להשיג תוצאות משמעותיות. כפי שמתואר במיקרוסקופיה אלקטרונית, זרימת עבודה קריוגניים, כולל ההקפאה של התא ו קריוטרנספר לשלב הקריוסריקה, מאפשר שימור היסודות אופטימלית ברמות subcellular קרוב ככל האפשר למדינה מקורית5,6,7,8,9,10. הבנה זו יושמה בהצלחה לתוך הפיתוח של סינכרוטרון-מיקרוסקופ רנטגן רך-ray (למשל, מיקרוסקופים שדה מלא סריקת מיקרוסקופים) כדי לייצר הדמיה ultraקונסטרוקטיבי של תאים קפואים להתייבש כולו ב-2D או 3D. זרימות עבודה קריוגניים שונות פותחו11 עבור רנטגן רך מיקרוסקופים ב Beamline 2.1 (XM-2) של מקור אור מתקדם במעבדה הלאומית של לורנס ברקלי12, beamline U41-XM בטבעת האחסון אלקטרון Bessy השני (גרמניה)13, beamline מיסטרל של מקור האור אלבה (ספרד)14, ו Beamline B24 של מקור אור יהלום15, בין היתר. זרימת עבודה דומה הוצגה לאחרונה להיות שיטת ההכנה והשימור האמינה ביותר עבור ניתוח היסודות תאיים באמצעות רנטגן מיקרורגשים16,17.
למרות nanoprobe רנטגן טכניקות מתחילות להיות בשימוש נרחב לניתוח היסודות הסלולר, במיוחד עם הופעתו של הקריוגניים SR-XRF יכולות, פרוטוקול חורג לא הופץ עד כה לקהילת המחקר. כאן, הליך מפורט מסופק כדי להכין את התאים האלה קריוקבוע שאינם מתורבתים כמו monolayers על ממברנות סיליקון ניטריד להיות מנותח בתנאים קריוגניים. במקרה של ניתוח רנטגן יש לבצע את הצעד לייבוש ההקפאה לאחר הפרוטוקול, במידה והבדיקה מבוצעת גם בטמפרטורת החדר. בעוד הפרוטוקול המוצע בשימוש בהצלחה עם תאים סרטן השד האנושי MD-MB-2312 ו-ההקפאה ייבוש הפגינו בין אחרים על נוירונים בעכבר18,20,21, זה יכול להיות מורחב בקלות סוגים שונים של תאים אנושיים או בעלי חיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

מעט מאוד ידוע על חלוקת יוני מתכת ברמה התת תאית. עם זאת, אלמנטים כימיים אלה יש פונקציות רגולטוריות חיוני הומאוסטזיס מופרע שלהם מעורב במחלות שונות. סינכרוטרון רנטגן של המדינה הארט nanoprobes לספק את הרגישות הנדרשת ואת הרזולוציה המרחבית כדי להבהיר את דו מימדי (2d) ו תלת מימדי (3d) הפצה וריכוז של מתכות בתוך תאים שלמים ב רמה ארגונית. זה פותח שדות מדעיים חדשים ומרגשים של חקירה על התפקיד של מתכות בphysiopathology של התא. ההכנה התאית היא מפתח ולעתים קרובות הליך מורכב, במיוחד לניתוח בסיסי. למרות שיטות הקרינה של X-ray נפוצים כעת, שיטות הכנה שונות שימשו, מחקרים מעטים מאוד חקרו את שימור התוכן הבסיסי של תאים בצורה הטובה ביותר, ולא פרוטוקול מפורט החורג של הקריופיקציה של תאים מחסיד עבור nanoprobes רנטגן הקרינה שוחרר עד כה. זהו תיאור של פרוטוקול המספק את ההכנה התאית החורגות עבור הקפאה מהירה כדי לאפשר סינכרוטרון X-ray פלואורסצנטית ננו ניתוח של תאים במצב רטוב קפוא כאשר סביבה קריוגניים והעברה זמין. במקרה ננו ניתוח צריך להתבצע בטמפרטורת החדר, הליך נוסף עבור הקפאת לייבש את ההכנה התאית קריוקבוע מסופק. הפרוטוקולים המוצעים השתמשו בהצלחה בעבודות קודמות, לאחרונה במחקר 2D ו-3D התפלגות תאיים של מתחם אורגנומתכתית בתאי סרטן השד.

טיפוסי מיקרוסקופ וידאו אופטי תצוגה של קפוא הרטוב מד א-MB-231 תאים שהיו תת-תרבותית על פולי-L-ליזין מצופה Si3N4 ממברנה מוצג באיור 7א. התצוגה האופטית של המדגם בחדר ואקום הושגה במצב השתקפות באמצעות מיקרוסקופ וידאו ייעודי מקוון של ID16A beamline של ESRF22. בעוד אלקטרון או מיקרוסקופ רנטגן רך דורש את שכבת הקרח להטביע את התא כדי להיות דק ככל האפשר (בדרך כלל < 0.5 μm), רנטגן קשיח (> 10 קוו) יש את היתרון של עומק חדירה הרבה יותר גבוה ומינון נמוך תצהיר. עובי הקרח יכול אפוא להיות גדול יותר, בדרך כלל < 10 יקרומטר כולל התא כך הקרח הטבעה התא הוא מספר יקרומטר עובי. זה יכול להיות מוערך באמצעות עוצמת רנטגן נמדד הילוכים בהשוואה לעוצמה ללא המדגם, לוקח בחשבון את ספיגת 500 ננומטר עבה Si3N4 ממברנה. עובי קרח זה ניתן להשיג באמצעות כתמים ידניים כפי שמתואר בפרוטוקול הנוכחי. באזור הטבעות של ניוטון, עובי הקרח יכול להיות אפילו דק יותר (לא נמדד).
צילום רנטגן מיפוי היסודות של התא הרטוב מוקפא מוצג באיור 7ב עם הפצות הנציג של אלמנטים פיזיולוגיים כגון אשלגן (K), גופרית (ים), ו אבץ (zn). מפות אלה מייצגים את המסה אריאל היסודות (כלומר, מסה מוקרן היסודות). בעוד לא נעשה במקרה הנוכחי, מפות כאלה ניתן לנרמל באמצעות X-ray המבוססת על הפצת הדמיה בשלב התמונה המספקת את הערכה של המדגם מוקרן23. כפי שדווחו על-ידי מחקרים רבים, ההנחה הקשה ביותר בתאים שנשתמרו במצבם הכמעט-טבעי היתה מופצת באופן הומוגנטי בכל התא23,24,16. כפי שמוצג ב-2D רנטגן תמונות היסודות באיור 7B, הרכיב המאוגד בחוזקה הופץ באופן שווה בתוך התא, בדומה ל-K, ומייצג אומדן טוב של פרופיל מסת הסלולר. התפלגות Zn היה אות גבוה יותר בגרעין מאשר בציטוזול והתווה בבירור את הגרעין. ניתן לציין כי מאזורים קטנים Zn מועשר ניתן להבחין ברזולוציה המרחבית (50 nm) באזור הגרעיני.
הרנטגן הקיים nanoprobes או אלה להיבנות לא בהכרח להכיל יכולות קריוגניים. במקרה זה, החלופה הטובה ביותר כדי לקבל רנטגן תמונות זריחה של תאים ב-sub-100 ננומטר החלטות מרחבית היא לבצע הקפאת ייבוש הליך המתואר בפרוטוקול זה לאחר לצלול-הקפאת התא. איור 8A מראה תצוגה טיפוסית מיקרוסקופ שדה בהיר של תוצאה הקפאת מיובשים העכבר הראשי היפוקמאל ההיפוקומאל באופן ישיר תרבותי על Si3N4 ממברנה. במקרה זה, אם מאוחסן בחדר נקי ומיובש, ניתן להכין את הדגימות 1 עד 2 שבועות מראש ולצפות במיקרוסקופ אופטי אנכי רגיל לרישום אזורי עניין. יש לנקוט כדי למנוע חשיפה ללחות הסביבה כפי שהוא עשוי להילכד על ידי הקפאת מדגם מיובש ולהוביל לנזק מתחת ל-X nanobeam. הליך זה הוחל בהצלחה על תאים רגישים מאוד (כלומר, תאים עצביים) ואף תוצאות טובות יותר הושגו עם סוגים אחרים חזקים יותר של תאים, כגון תאים סרטניים. באשר התאים קפואים לצלול, רנטגן תמונות הזריחה של K, S, ו Zn על המסך כולו הקפאת התאים דומים לאלה שתוארו לעיל. הם מייצגים את ההפצות האלמנטלים להימצא בסוגים שונים של תאים מיובשים הקפאה ב-50-100 ננומטר ברזולוציה מרחבית nm. בעוד הקפאת-ייבוש תאים שלמים היא חלופה כדי לשמר את היושר הבסיסי, זה על חשבון של שימור מושלם של מורפולוגיה התא16, במיוחד תאי ממברנות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> איור 1: תמיכה לדוגמה טיפוסית לננו-אנליזת קרינה ברנטגן. A Si3N4 ממברנה תמיכה הקפסולה המגן שלה. סוג זה של מצע ניתן להשתמש הן עבור ניתוח טמפרטורת החדר (לצלול להקפיא הכנה הסלולר ואחריו טמפרטורה נמוכה הקפאת ואקום ייבוש תהליך) או לניתוח הקפאה רנטגן הקריוגני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> איור 2: השקפה סכמטית של מערכת הסיליקון מרכיבה לאחר זריעת תאים. התאים הם מתורבתים ישירות על משטח שטוח פולי L-ליזין של Si3N4 ממברנה תמיכה. לפעמים בועות אוויר יכול להיות לכוד בחלל האחורי של התמיכה ממברנה3N4 ו צריך להיות מוסר כפי שמתואר בפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> איור 3: In-house פיתח תלת-ממד הדפסה מודפס-box לאחסון לטווח ארוך של לצלול קפוא Si3N4 ממברנה תומך חנקן נוזלי dewar. (א) הקפאה מפורק עם המיכל והאותיות (החלק התחתון) ו-(ב) תיבת ההקפאה התאספו עם אותיות נעולות. ניתן לתמרן את הכיפות עם הפינצטה, הפתיחה או הנעילה בסיבוב. תוכנית מפורטת עבור הדפסה תלת-ממדית זמינה על פי בקשה מ-ESRF ID16A. העיצוב נעשה כדי להתאים סיליקון ניטריד TEM רשתות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> איור 4: בלוק של תאים המתורבים על Si3N4. לפני לצלול-להקפיא את התא מונאולייר תרבותי על ממברנות Si3N4 צריך להיות שוטפים בתמיסה אמוניום אצטט (א) ובזהירות ידנית מחק באמצעות נייר סינון (ב). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> איור 5: מכונת EM-GP הקפאה אוטומטית. (א) מקפיא הצלילה האוטומטי. (ב) חדר האיכות הסביבתי עם הפינצטה הנעולה ב. (ג) גביע אתאן מכוסה בliquefier לייקה המחובר לבקבוק אתיאן. (ד) מארז ההקפאה המראה את הספל השחור המלא במלין ובקופסת ההקפאה לאחסון נוסף ב-LN2 של הממברנותהארבע -שלושN 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> איור 6: מכלול לדוגמה הרכבה להקפאה הליך ייבוש. (א) הנמען פליז הראשון עבור Si3N4 ממברנות מותקן על גבי בעל העברת המדגם המסופק על ידי ספק מייבש ההקפאה. (ב) ו-(ג) מראים כי הדיסק השטוח השני משמש ככיסוי ופועל כמארז מלכודת קרה שיוכנס למארז הוואקום של מייבש ההקפאה. (ד) ההרכבה המלאה עם מוט ההעברה הטעון באביב. (ה) מחזיק המדגם הנושא את ההכנה התאית המוגבהת גדל על הקרום Si3N4 חייב להיות נוסף במייבש בהקפאה2-מקורר. כל השלבים לטעינת ההרכבה נעשים ב-LN2 בתיבת קלקר. לבהירות, כל התמונות הופקו בהיעדר LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> איור 7: ההקפאה-X-ray תמונות הקרינה של תא מוקפא קפוא באמצעות רנטגן קשיח nanoprobe. (א) תצוגה מקוונת טיפוסית במצב השתקפות באמצעות מיקרוסקופ וידאו אופטי ייעודי של ESRF ID16A beamline. לאחר בלוק ידני, עובי הקרח הכולל של כ 5 עד 10 יקרומטר הושג המאפשר תצוגה ברורה של התאים הקפואים קפוא. אזור עם טבעות ניוטון מעיד על קרח רזה אפילו הרבה יותר מורגש. (ב) נציג הקפאה-X-ray הפצות הסלולר של אלמנטים פיזיולוגיים אשלגן (K), גופרית (ים), ו אבץ (zn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> איור 8: x-ray תמונות הזריחה של תא עצבי הקפאה מיובשים באמצעות רנטגן קשיח nanoprobe. (א) השקפה טיפוסית מיקרוסקופ שדה בהיר של כתוצאה הקפאת מיובשים תאים עצביים הראשי מתורבת ישירות על Si3N4 ממברנה. סרגל בקנה מידה = 200 יקרומטר (ב) מייצג טמפרטורה בחדר הנציג X-ray הקרינה הפלואורסצנטית של תא היפוקמאל מיובשים בודד מראה את הפצות של אלמנטים פיזיולוגיים אשלגן (K), גופרית (ים), ו אבץ (zn). סרגל בקנה מידה = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור תרבות התא על ממברנות הסיליקון ניטריד ו-לקפוא לפני לפני הדמיה רנטגן קרני הקרינה עם סינכרוטרון nanoprobe רנטגן הקריוגני. כאשר רק טמפרטורת החדר בניתוח ננו מסופק, הדגימות הקפואות יכול להיות נוסף מיובש להקפיא. אלה הם צעדים קריטיים כדי לקבל מידע על הרכב היסודות תאיים.

תרבות התא על ממברנות הסיליקון נידהר וקריופיקציה עבור סינכרוטרון X-ray פלואורסצנטית ננו-ניתוח

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

ננו-גשושיות רנטגן סנכרון שעוצבו לאחרונה מאפשרות הדמיה של התפלגות היסודות של מדגם. השימוש בגישות קריוגניים הוא חובה כדי להאט את נזקי קרינת רנטגן. לכן, קריופיקציה מהירה חיונית להשגת תאים מיובשים קפואים כדי לייעל את שימור מבנה התא ושלמותו הכימית.הספציפיות של ההכנות התאיות למחקרי סינכרוטרון מובילה לאופטימיזציה של פרוטוקול זה לרכישת מונואליירים תאים מיובשים קפואים. הדגמה חזותית חשובה להבנת האופן שבו ניתן לתפעל את דגימות המונוליאר של התאים כדי להשיג תאים קריופיקציה מתרבים המוטבעים בתוך שכבה דקה של קרח. כדי להכין תמיכה בממברנה ניטרד סיליקון, לפתוח את הקפסולה המכילה את התמיכה קרום בעדינות לסחוט את הקפסולה כדי לשחרר קלות את התמיכה.השתמש פינצטה דקה כדי לתפוס פינה אחת של מסגרת הסיליקון דואג לא לגעת קרום סיליקון ניטריד במרכז המסגרת ול למקם את המסגרת לתוך צלחת פטרי חשופה ארון זרימה למינאר. לאחר מכן UV לעקר את הממברנה במשך 25 עד 30 דקות. בסוף הסטריליזציה, להוסיף 10 microliters של גורם מצורף כגון פולי-L-לינזין.דגירה במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס וב 5% פחמן דו חמצני עם לחות. לאחר מכן מלאו בארות של צלחת סטרילית של 48 בארות עם 200 עד 250 מיקרוליטרים של 0.22 מיקרומטר מסוננים מים טהורים במיוחד ומעקב אולטרה ל באר. השתמש פינצטה עדין כדי להטביע בזהירות את הממברנה אנכית עם שלוש שטיפות רצופות של 10 שניות באר אחת של מים.לאחר שטיפה, מניחים את הממברנה אנכית באר ריקה של צלחת סטרילית 96 באר מתחת מכסה המנוע לזרום למינאר ולהשאיר אותו לילה עד יבש. עבור זריעת התאים של עניין, מניחים את הממברנה מצופה עם הצד השטוח פונה למעלה באר אחת של צלחת סטרילית ארבע בארות. הוסף חמש פעמים 10 לארבעת התאים ב 10 microliters של מדיום תרבות מתאים לפני השטח של קרום סיליקון ניטריד מבלי לגעת קרום.הירידה אמורה לכסות את כל הממברנה. ואז לתרבת את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם לחות. כאשר התאים החלו להיצמד למצע, מוסיפים לאט מיליליטר של מדיום תרבות שלם במורד הקיר של כל באר המכסה כל קרום.ואז לתרבת את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם לחות. להקפאה של ההכנה התאית, הפעל תחילה מקפיא צלילה אוטומטי ומלא את המספר המתאים של בארות בצלחת פלסטיק 12 באר עם חיץ אצטט אמוניום 37 מעלות צלזיוס. מיד לפני שטיפה לצלול הקפאת הממברנה, להסיר את המדגם מהאינקובטור ולהשתמש בטבעת מהדק שחור של זוג פינצטה שחרור מהיר כדי לפתוח את פינצטה.השתמש פינצטה נעולה לתפוס את התמיכה קרום לטבול את הממברנה אנכית בתוך פתרון מאגר אמוניום אצטט במשך כחמש שניות. כדי להסיר מאגר עודף כלשהו, לחץ על תחתית התמיכה בממברנה על נייר סינון ונפח כל צד של המסגרת על נייר הסינון מבלי לאפשר לממברנה לגעת בנייר. כאשר החיץ העודף הוסר, פתח את דלת התא הסביבתי, החלק במהירות את פינצטה לתוך המדפים משתלבים, וסגור את דלת התא.לחץ כתם צלילה. פינצטה מחזיקה את קרום ניטרד סיליקון יהיה צלל במהירות לתוך קריוגן. לאחר הקפאת צלילה, להסיר את המכסה של מיכל ההעברה עם מדפים מקורר מראש ולהעביר לחץ.קרום סיליקון ניטרד יועבר מעט מעל ההקפאה. בתנועה אחת מהירה, להחליק מעט להטות את הפינצטה מתוך המדפים משתלבים כדי להביא את פינצטה ישירות לתוך חריץ ריק של cryobox במיכל ההעברה מלא נוזל חנקן. ואז לשחרר את טבעת מהדק שחור כדי לשחרר את הממברנה.לייבוש הקפאה של התאים הקפואים, השתמש במתג הנדנדה הממוקם בלוח האחורי של מכשיר הייבוש להקפאה כדי להפעיל את המכשיר. הצג יציג את הקשה על Enter כאשר תהיה מוכנה לטעון דוגמה. הר את מחזיק פליז ממברנה חנקן סיליקון על גבי מחזיק העברת מדגם המסופק על ידי הספק במיכל אחסון פוליסטירן שמירה על רמת חנקן נוזלי על אחד עד שני מילימטרים מתחת לקצה העליון של חתיכת פליז הראשון.מניחים את הממברנה כשצד דגימת התא פונה כלפי מעלה בחלל ממוספר של מחזיק הפליז ומקררים מראש את מוט ההעברה בקופסת קצף פוליסטירן נוזלית מלאה בחנקן. השתמשו במוט כדי לנעול את ההרכבה המלאה, לחצו על הכניסה כדי לשבור את הוואקום כדי לשחרר את המכסה של תא מייבש ההקפאה, להעביר מיד את הדגימה בתא המייבש להקפאה ולסגור את מכסה תא המייבש. לאחר מכן מיד לחץ להתחיל להמשיך עם מחזור ייבוש ההקפאה.בסוף מחזור הייבוש להקפאה, לחץ על עצור כדי לפרוק את התא ולהסיר את ההרכבה המלאה כדי לגשת לדגימות מיובשות בהקפאה. כאן תצוגת מיקרוסקופ וידאו אופטי טיפוסית של תאים קפואים של תאים סרטניים בשד מיובשים תת-תרבותיים על תמיכה קרום סיליקון ניטרד מצופה פולי L-ליזן כפי שהוכח. מיפוי יסודי של פלואורסצנטיות רנטגן של התאים הידראטיים הקפואים חושף את ההפצות של יסודות פיזיולוגיים כגון אשלגן, גופרית ואבץ.בדוגמה מייצגת זו, אלמנט הגופרית ההדוק הופץ באופן שווה בתוך התא בתבנית דומה לזו שנצפתה עבור אשלגן ומייצג הערכה טובה של פרופיל המסה התאית. התפלגות האבץ, לעומת זאת, הפגינה אות גבוה יותר בתוך הגרעין מאשר בציטוזול עם הפרדה מוגדרת בבירור של האות בין הציטוסול לגרעין. בתצוגת מיקרוסקופיה טיפוסית זו של Brightfield microscopy של נוירונים ראשוניים מיובשים בהקפאה של עכברים בהיפוקמפוס המתורבים ישירות על קרום סיליקון ניטרייד כפי שהוכח, התאים מפגינים מורפולוגיה עצבית טיפוסית שאינה מושפעת מתרבותם או משיטת השימור שלהם.הדמיית פלואורסצנטיות של קרני רנטגן של תאים קפואים צוללים חושפת גם הפצות יסודות טיפוסיות כפי שהוצגו על ידי תאים מיובשים בהקפאה ברזולוציה מרחבית של 50 עד 100 ננומטר. התוויית חלון ניטרד סיליקון היא קריטית להשגת שכבת הקרח הדקה ביותר האפשרית של תאים לאחר הקפאת צלילה. שמירה על השלמות הכימית של התאים ברמה התת-תאית מאפשרת לחקור את המתכת של התאים באמצעות ננו-גשושיות סינכרוטרון, כמו גם עם טכניקות מיקרואנליטיות אחרות.כמו לא כל ניתוח סינכרוטרון ננו בדיקה יכול להתבצע בטמפרטורה קריוגנית, תאים מיובשים קפואים ניתן להקפיא עוד יותר מיובשים כדי להקל על הניתוח שלהם בטמפרטורת החדר. זכור להשתמש בציוד מגן אישי מתאים בעת עבודה עם חנקן נוזלי תמיד להשתמש בגז אתאן ברדס אדים הרחק להבות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

איסוף נתונים טוריים של יעד קבוע במקור אור יהלום

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...