Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

ナノイメージングビームラインID16Aに関する実験は、ESRF提案LS2430、LS2303、およびLS2765のフレームで行った。

<ol>
	<li>Lewis, D. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections.">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, 169-182 (1987).</li><li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells.">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1875-1882 (1984).</li><li>Wroblewski, J., M&#252;ller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. 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著者は利害の対立を持っていない。

クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)は、2017年ノーベル化学賞を受賞し、溶液25における生体分子の高分解能構造決定のための生体材料のガラス化に関してJ.デュボシェが行った開発を行った。デュボシェがノーベル講演で報告したように、「水滴を生き生きとさせる方法を知ることは別のことだ」25.凍結製剤ステップは、放射線量の損傷を軽減し、彼らの母国に近い細胞を研究するための標準的な技術と考えられています。しかし、準備は退屈なままです。これは、電子顕微鏡は、その卓越した空間分解能のために、サンプル調製中に発生する任意の超構造アーティファクトに敏感であるためです。シンクロトロン・クライオナノプローブは現在、高エネルギーX線範囲26で13nmの低い空間分解能に下がる同様の困難に近づいている。ハードX線顕微鏡は細胞全体を分析できる一方、電子顕微鏡は電子の浸透深さが悪く、非常に薄い細胞スライスしか観察できない。
細胞の単層は、液体エタン中の突っ込み凍結によって、水ガラス化に必要な冷却速度が達成されるように十分に薄い。理論的には、108 K/sの高い冷却速度は、急激な凍結のためにあまりにも厚い標本のガラス化を可能にする高圧凍結27を使用して可能です。周囲圧力28で試料の完全なガラス化を可能にするために必要な105K/sの冷却速度は、ここで提示される自動プランジ凍結機およびパラメータを使用して再現的に到達する。これにより、研究者は、液体エタン中の突っ込み凍結によって、細胞12、13、14、15、29、30などの薄い生体標本(<10μm)を活性化することができます。
このプロトコルの重要な課題は、細胞内の化学的完全性を可能な限り維持し、2Dまたは3Dの細胞内の信頼性の高い元素分布を提供することです。他の場所で公開されているように2,16,17,31,細胞下レベルでの元素イメージングの場合, 凍結水和細胞の分析を考慮する必要があります。.それ以外の場合は、細胞のプランジ凍結と凍結乾燥の組み合わせを室温分析に使用できます。後者の場合、アモルファス氷は昇華の過程を通じて除去され、結合した水分子は脱着の過程を通じて除去される。このプロセスは、細胞膜の可能な変化およびいくつかの細胞内構造32の形態に起因する凍結水和試料と比較して理想的ではないかもしれない。また、種分化研究のために、水抽出は金属種分化アーティファクトにつながる可能性がある。それでも、サブ100nmレベル2、16、17、18、20、33、34、35、36での元素イメージングのための凍結水和サンプルに代わる最良の代替手段として成功している。
37と報告されているように、凍結保存細胞製剤の品質は、カリウム対ナトリウムK/Na比を介して評価することができる。残念ながら、元素のX線蛍光光光子(E≥1.3 keVマグネシウム)の検出に使用されるシリコンドリフト検出器のエネルギー遮断が低いため、ここで使用される硬いX線ナノプローブでは未だ決定できません。実際、TOF-SIMS、EPMA、または核マイクロプローブPIXE16、37を用いて測定できる高いK/Na比(>10)は、生細胞37における期待されるK/Na25と比較して細胞の保存された化学的完全性を示す。これは、付随する低 Cl/K比38によってサポートできます。それでも、不完全なガラス化は、特にサンプル冷却の速度が低すぎる場合、細胞膜やオルガネラに損傷を与える大きな氷結晶の形成につながり、その結果、化学元素の分布を変化させる可能性がある。この潜在的な損傷と細胞内分布への影響を監視する日常的な手順はありませんが、上記の元素比とX線相コントラストまたはクライオソフトX線顕微鏡を用いて細胞を高解像度で画像化する可能性は、要素完全性の併用を伴う細胞内コンパートメントの良好な保存をサポートするための最良のアプローチであり得る。これらの技術と新たに開発されたクライオカ相対蛍光光学顕微鏡の使用の組み合わせは、この損傷がどの程度発生し、細胞内元素分布に影響を与えるかを評価するのに役立ちます。
全体として、蛍光X線蛍光ナノ分析のための細胞サンプルを調製するための詳細かつ包括的なプロトコルが提示される。研究コミュニティにとって良い出発点であり、(クライオ)硬いX線ナノプローブで2Dおよび3D元素イメージングのための適切な細胞サンプルを調製する方法の難しい問題を解決するのに役立ちます。これらのアプローチは、細胞の詳細な相関化学的および構造イメージングのための光学蛍光および電子顕微鏡機能と融合することができる。

新設計の蛍光X線X線(SR-XRF)ナノプローブは、完全に定量的な方法で元素の細胞内分布を可視化することを可能にします。一例として、この分析能力は、オスミウム系錯体2のようなナノ粒子1または有機金属分子の取り込みの調査を可能にし、強力な抗癌特性を有する金属系分子の細胞内取り込みに関する洞察を提供する。多元素技術として、ナノプローブを用いたSR-XRF3は、リン、硫黄、カリウム、カルシウム、鉄、銅、亜鉛などの細胞内で最も重要な元素を同時に定量および局在化する方法を提供します。確かに、硬いX線を使用すると、凍結した水和細胞全体をラベルフリーで画像化するための大きな浸透深さを提供します。さらに、目的とするほとんどの要素のKエッジへのアクセスを提供し、蛍光X線は最も効率的に励起される。極低温アプローチの使用は、放射線損傷の減少および細胞構造および元素分布の保存の最適化を可能にする。
細胞内の金属を研究するために利用可能な空間的に解決された分析技術のほとんどは、生成される細胞の非常に薄く平らなセクションを必要とする表面技術です。主に、エネルギー分散型X線分析(STEM-EDX)、エネルギー濾過透過型電子顕微鏡(EF-TEM)、ナノスケール二次イオン質量分析(nanoSIMS)を用いた走査透過型電子顕微鏡を含みます。後者は凍結した水和細胞切片では行えませんが、クライオ分析は卓越した空間分解能を持つ電子顕微鏡で行うことができますが、元素感度は低いです。粒子誘起X線放射(PIXE)は、全細胞における元素分布の研究を可能にした。ミクロンスケールでもサブミクロン分解能4でも、実質的な元素感度で完全に定量できるという利点がありますが、凍結水和細胞を研究する放射線損傷や極低温能力の欠如に苦しんでいます。これらの分析技術はすべて、細胞の元素イメージングにおいて互いに補完するが、すべての技術において、サンプル調製手順は重要なステップである。有意義な結果を得るためには、可能な汚染だけでなく、元素の再分配や漏出を制限するのは簡単にする必要があります。電子顕微鏡で実証されているように、細胞の凍結固定化およびクライオスキャン段階への凍結移動を含む極低温ワークフローは、天然状態5、6、7、8、9、10に可能な限り近い細胞内レベルで最適な元素保存を可能にする。この理解は、2Dまたは3Dで凍結水和細胞全体の超構造イメージングを生成するために、シンクロトロン凍結ソフトX線顕微鏡(例えば、完全な視野顕微鏡および走査顕微鏡)の開発に正常に実装されています。ローレンス・バークレー国立研究所12の先端光源のビームライン2.1(XM-2)、電子貯蔵リングBESSY II(ドイツ)13、アルバ光源(スペイン)14のビームラインMISTRAL、およびダイヤモンド光源15のビームラインB24で、様々な極低温ワークフローが開発されました。同様のワークフローは、最近、X線マイクロプローブ16、17を用いた細胞内元素分析のための最も信頼性の高い調製および保存方法であることが示された。
X線ナノプローブ技術は細胞元素解析に広く用いられ始めていますが、特に極低温SR-XRF機能の出現により、これまで研究コミュニティに段階的なプロトコルが普及していることは一切ありません。ここでは、極低温条件下で分析する窒化ケイ素膜上に単層として培養した凍結付付付着細胞を調製するための詳細な手順を提供する。X線分析を室温で行わなければならない場合にプロトコルの後に適用される凍結乾燥工程も提供される。提案されたプロトコルはヒト乳癌細胞MD-MB-2312で正常に使用され、凍結乾燥はマウスニューロン18、20、21上で他の間で実証されたが、様々なタイプのヒトまたは動物細胞に容易に拡張することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

細胞下レベルでの金属イオンの分布についてはほとんど知られていない。しかし、これらの化学元素は必須の調節機能を有し、その乱れた恒常性は様々な疾患に関与している。最先端のシンクロトロン蛍光X線蛍光ナノプローブは、細胞全体の2次元(2D)および3次元(3D)分布と濃度を解明するために必要な感度と空間分解能を提供します。オルガネラレベル。これは、細胞の物理病理学における金属の役割に関する調査の新しいエキサイティングな科学的分野を開きます。細胞製剤は、特に基本的な分析のために、重要でしばしば複雑な手順です。蛍光X線技術が普及し、様々な調製方法が用いられているが、細胞の元素含有量の保全をせいぜい調査した研究は非常に少なく、凍結製剤に関する段階的に詳細なプロトコルはない。蛍光ナノプローブのX線系外細胞はこれまでに放出されている。これは、極低温環境および転写が可能な場合に凍結水和状態の細胞のシンクロトロンX線蛍光ナノ分析を可能にする、高速凍結のための段階的な細胞製剤を提供するプロトコルの説明である。ナノ分析を室温で行う必要がある場合には、凍結乾燥付着細胞製剤を凍結乾燥するための追加手順が提供される。提案されたプロトコルは、乳癌細胞における有機金属化合物の2Dおよび3D細胞内分布の研究において、以前の研究で成功を上げている。

ポリL-リジン被覆Si3N4膜支持体にサブ培養した凍結水和MDA-MB-231細胞の典型的な光学ビデオ顕微鏡図を図7Aに示す。真空チャンバ内の試料の光学図は、ESRF22のID16Aビームラインの専用オンラインビデオ顕微鏡を用いて反射モードで得られた。電子または軟X線顕微鏡検査では、細胞を埋め込んだ氷層ができるだけ薄くなる必要がありますが(通常は<0.5μm)、硬質X線(>10 keV)は、はるかに高い浸透深さと低用量堆積の利点を有します。したがって、氷の厚さは、セルを埋め込む氷の厚さが数μmになるように、通常はセルを含む<10 μmより大きくなる可能性があります。これは、500nm厚のSi3N4膜の吸収を考慮して、試料を含まない強度と比較して透過中の測定されたX線強度を介して推定することができる。この氷の厚さは、本プロトコルに記載されているように手動ブロッティングによって達成することができる。ニュートンリング領域では、氷の厚さはさらに薄くすることができます(測定されません)。
凍結水和細胞のX線蛍光元素マッピングは、カリウム(K)、硫黄(S)、亜鉛(Zn)などの生理要素の代表的な分布を用いて図7Bに示す。これらのマップは、元素の実質量(すなわち、元素投影質量)を表します。本場合には行われていないが、このような地図は、試料投影質量23の推定を提供するX線伝播ベースの位相コントラストイメージングを通じて正規化することができる。多くの研究によって報告されるように、その近いネイティブ状態で保存された細胞における高度に拡散性の高いKイオンは、細胞23、24、16全体に均一に分布していると仮定された。図7Bの2DX線蛍光元素画像に示すように、密結合元素Sは、Kと同様に細胞内に均等に分布し、細胞質量プロファイルの良好な推定値を表す。Zn分布は、細胞質よりも核内の方が高いシグナルを有し、核を明確に概説した。なお、小さなZn濃縮領域は、核領域の空間分解能(50nm)で検出することができる。
既存のX線ナノプローブや構築されるものは、必ずしも極低温能力に対応できるとは限りません。この場合、サブ100nm空間分解能で細胞のX線蛍光画像を得るための最良の代替手段は、細胞の突入凍結後にこのプロトコルに記載の凍結乾燥手順を実行することです。図8Aは、Si3N4膜上で直接培養された結果の凍結乾燥一次マウス海馬ニューロンの典型的な明視野顕微鏡図を示す。この場合、清潔な乾燥チャンバーに保存する場合、サンプルは1-2週間前に調製し、目的の領域の登録のための通常の直立光学顕微鏡で観察することができる。凍結乾燥サンプルによって捕捉され、X線ナノビームの下で損傷を引き起こす可能性があるため、周囲の湿度にさらされるのを防ぐため、注意が必要です。この手順は、非常に敏感な細胞(すなわち、神経細胞)に正常に適用され、癌細胞のような他のより堅牢なタイプの細胞でさらに良い結果が得られた。突発凍結細胞に関しては、凍結乾燥細胞ディスプレイ全体におけるK、S、Znの蛍光X線画像は、上述のものと同様である。これらは、50-100 nmの空間分解能で様々なタイプの凍結乾燥セルに見られる元素分布を表します。全細胞の凍結乾燥は元素の完全性を保つための代替手段であるが、細胞形態16、特に細胞膜の完全な保存を犠牲にしている。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> 図1:蛍光X線ナノ分析のための典型的なサンプルサポート保護カプセル内のSi3N4膜支持。このタイプの基板は、室温分析(プランジ凍結セルラー調製後に低温および低真空凍結乾燥プロセス)または極低温蛍光分析に使用できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> 図2:細胞播種後の窒化ケイ素窓の概略図細胞は、Si3N4膜支持体のポリ-L-リジン被覆平坦面上に直接培養される。時には気泡は、Si3N4膜支持の裏側の空洞に閉じ込められ、プロトコルに記載されているように除去されなければならない。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> 図3:液体窒素デュワーにおけるプランジ凍結Si3N4膜支持の長期保存のための3Dプリントクライオボックスを自社開発。(A)クライボックスは、コンテナとキャップ(下部)と(B)ロックされたキャップ付きの組み立てられたクライオボックスで分解しました。キャップはピンセットで操作でき、回転によって開いたりロックしたりすることができます。ESRF ID16Aからのご要望に応じて、3Dプリンティングの詳細なプランをご覧いただけます。設計は窒化されたシリコンTEMの格子を収容するためになされた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> 図4:Si3N4で培養した細胞のブロッティング。 Si3N4膜上に培養した細胞単層を突っ込んで凍結する前に、酢酸アンモニウム溶液(A)でリンスし、濾紙(B)を用いて慎重に手動でブロットする必要があります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> 図5:自動突入凍結EM-GPマシン(A) 自動プランジ冷凍庫。(B) ピンセットがロックされた環境室 (C) エタンボトルに接続されたライカ液化剤で覆われたエタンカップ。(D)液化エタンの完全な黒いカップと、ガラス化されたSi3N4膜のLN2にさらなる貯蔵のためのクライオボックスを示すプランジ凍結エンクロージャ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> 図6:凍結乾燥手順のためのサンプル凍結転写アセンブリ。(A)Si3N4膜の最初の真鍮受領者は、凍結乾燥機サプライヤーによって提供されるサンプル転写ホルダーの上に取り付けられる。(B) および (C) は、2 枚目のフラット ブラス ディスクがカバーとして使用され、凍結乾燥機の真空エンクロージャに挿入されるコールド トラップ エンクロージャとして機能することを示します。(D) バネ付きトランスファーロッドを備えたフルアセンブリ。(E)Si3N4膜上で成長したガラス化細胞製剤を担持する試料ホルダーは、さらにLN2-冷却凍結乾燥機に挿入されなければならない。アセンブリを取り付けるためのすべてのステップは、発泡スチロールボックスのLN2で行われます。わかりやすくするために、すべての画像はLN2の不在で生成されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> 図7:硬いX線ナノプローブを用いた凍結水和細胞のクライオX線蛍光画像。(A)ESRF ID16Aビームラインの専用光学ビデオ顕微鏡を用いた反射モードでの典型的なオンラインビュー。手動ブロッティング後、約5〜10μmの総氷厚が達成され、凍結した水和細胞の明確な視界が可能となった。ニュートンリングが非常に薄い氷を示す領域が顕著です。(B)代表的なクライオX線蛍光細胞分布は、生理学的元素カリウム(K)、硫黄(S)、亜鉛(Zn)である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> 図8:硬いX線ナノプローブを用いた凍結乾燥神経細胞の蛍光X線画像。(A)結果として生じる凍結乾燥原発皮質神経細胞の典型的な明視野顕微鏡図をSi3N4膜上に直接培養した。スケールバー=200μm(B)代表的な室温X線画像は、単一の凍結乾燥海馬ニューロンの蛍光画像、生理学的元素カリウム(K)、硫黄(S)、および亜鉛(Zn)の分布を示す。スケール バー = 2 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。</a>

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Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

ここで提示するプロトコルは、窒化ケイ素膜上での細胞培養およびX線蛍光イメージング前の突起凍結のためのプロトコルであり、シンクロトロン極低温X線ナノプローブを用いた。室温ナノ分析のみが提供される場合、凍結試料をさらに凍結乾燥させることができる。これらは、細胞内元素組成物に関する情報を得るための重要なステップである。

窒化ケイ素膜上の細胞培養とシンクロトロンX線蛍光ナノ分析のための凍結製剤

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

新設計のシンクロトロンX線蛍光ナノプローブは、試料の元素分布の可視化を可能にする。極低温アプローチの使用は、X線放射損傷を遅くするために必須である。そのため、凍結した水和細胞を得るためには、細胞構造の保存と化学的完全性を最適化するために、迅速な凍結が不可欠です。シンクロトロン研究のための細胞製剤の特異性は、凍結水和細胞単層を獲得するためのこのプロトコルの最適化につながります。視覚的なデモンストレーションは、細胞単層サンプルを操作して氷の薄い層に埋め込まれた再現可能な凍結細胞を達成する方法を理解するために重要です。窒化珪素膜支持剤を用意するには、膜支持剤を含むカプセルを開き、カプセルを軽く絞って支持を軽く緩めます。薄いピンセットを使用して、フレームの中央にある窒化シリコン膜に触れないように注意してシリコンフレームの一角をつかみ、フレームを薄層フローキャビネットの中の覆われたペトリ皿に入れます。その後、UVは25〜30分間膜を殺菌する。滅菌の終わりに、ポリL-リジンなどの付着係数を10マイクロリットル加える。摂氏37度で25分間、湿度で5%の二酸化炭素でインキュベートします。その後、滅菌48ウェルプレートのウェルに、0.22マイクロメートルの200〜250マイクロリットルの超純粋で超微量水を井戸ごとに充填します。細かいピンセットを使用して、1つの水の井戸に3つの連続した10秒のすすいで膜を垂直に慎重に水没させます。すすった後、薄層流れフードの下に無菌96ウェルプレートの空の井戸に膜を垂直に置き、乾燥するまで一晩放置します。目的の細胞の播種のために、無菌4ウェルプレートの1つの井戸に平らな面を向けてコーティングされた膜を置きます。膜に触れることなく、適切な培養培地の4つの細胞に10回5倍の10を加え、窒化ケイ素膜の表面に添加する。ドロップは膜全体を覆うはずです。その後、37°Cで細胞を培養し、湿度5%の二酸化炭素を培養します。細胞が基材に付着し始めると、各膜を覆う各ウェルの壁に完全な培養培地を1ミリリットルゆっくりと加える。その後、37°Cで細胞を培養し、湿度5%の二酸化炭素を培養します。細胞製剤の凍結固定化のために、まず自動プランジ冷凍庫をオンにし、37°Cの酢酸アンモニウムバッファーで12ウェルプラスチックプレートに適切な数の井戸を充填します。膜をすすいで急落する直前に、インキュベーターからサンプルを取り出し、クイックリリースピンセットの黒いクランプリングを使用してピンセットのロックを解除します。ロック解除されたピンセットを使用して膜支持体をつかみ、アセテートアンモニウム緩衝液内に膜を垂直に浸します。余分なバッファーを取り除くために、膜支持体の底部を濾紙に押し付け、膜が紙に触れることなく、フレームの両側を濾紙にブロットします。余分なバッファーが取り外されたら、環境室のドアを開き、ピンセットを鉗子インターロックに素早くスライドさせ、チャンバーのドアを閉めます。ブロットを押す プランジ。窒化ケイ素膜を保持するピンセットは、すぐにクライオゲンに突入します。急落凍結後、あらかじめ冷却された鉗子で転写容器の蓋を取り外し、移圧を行います。窒化ケイ素膜は、クライオゲンの上にわずかに移動します。素早い単一の動きで、ピンセットを鉗子インターロックから少し傾けて、ピンセットを窒素液体で満たされた移送容器のクライオボックスの空のスロットに直接持ち込みます。その後、黒いクランプリングを解放して膜を解放します。プランジ冷凍セルの凍結乾燥の場合は、凍結乾燥器具のリアパネルにあるロッカースイッチを使用して機器の電源をオンにします。サンプルをロードする準備ができたら、ディスプレイに Enter キーが表示されます。1番目の真鍮片の上端から約1〜2ミリメートル下に液体窒素のレベルを保つポリスチレン貯蔵容器に、サプライヤーが提供するサンプル転写ホルダーの上にシリコン窒化膜真鍮ホルダーを取り付けます。真鍮ホルダー番号付きキャビティにセルサンプル側を向けて膜を置き、液体窒素充填ポリスチレンフォームボックスに転送ロッドを事前に冷却します。ロッドを使用して完全なアセンブリにロックし、Enterキーを押して真空を破って凍結乾燥機室の蓋を解放し、すぐに凍結乾燥機室でサンプルを移し、凍結乾燥機室の蓋を閉じます。その後、すぐに凍結乾燥サイクルを続行するために開始を押します。凍結乾燥サイクルの終わりに、停止してチャンバーを通気し、完全なアセンブリを取り除き、凍結乾燥したサンプルにアクセスします。ここで示されるようにポリL-リジン被覆された窒化ケイ素膜支持体上にサブ培養された凍結水和乳癌細胞細胞の代表的な光学ビデオ顕微鏡図が示されている。凍結水和細胞の蛍光X線元素マッピングは、カリウム、硫黄および亜鉛などの生理学的元素の分布を明らかにする。この代表例では、密結合した硫黄元素を、カリウムについて観察されたのと同様のパターンで細胞内に均等に分布し、細胞質量プロファイルの良好な推定値を表している。しかし、亜鉛分布は、細胞質ゾルと核との間のシグナルの明確に定義された分離を伴うサイトゾルよりも高いシグナルを有する。この典型的なブライトフィールド顕微鏡では、示されているように、シリコン窒化膜上で直接培養された凍結乾燥一次マウス海馬ニューロンの顕微鏡観察において、細胞は、その培養法または保存方法の影響を受けない典型的な神経形態を示す。プランジ冷凍細胞の蛍光X線イメージングは、これらの代表的な凍結乾燥細胞が50〜100ナノメートルの空間分解能で示す典型的な元素分布も明らかにしている。シリコン窒化物ウィンドウをプロットすることは、急落凍結後に細胞の可能な限り薄い氷層を得るために重要です。細胞内レベルで細胞の化学的完全性を維持することで、細胞のメタロメをシンクロトロンナノプローブや他の微小分析技術で探索することができます。すべてのシンクロトロンナノプローブ分析が極低温で行われるわけではないので、凍結された水和細胞をさらに凍結乾燥させて室温で分析を容易にすることができる。液体窒素を使用する際は、適切な個人用保護具を使用し、常に炎から離れたヒュームフードでエタンガスを使用することを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

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Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

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S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

糖タンパク質 x 線結晶構造解析および生物物理学的手法によって、免疫グロブリンフォールドのキャラクタリゼーション

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

小角 x 線散乱による溶液中の高分子の構造研究

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

背景散乱を最小限に抑えた高分子X線結晶学用オールインワンサンプルホルダー

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X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X線結晶学は 、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する

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Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

ダイヤモンド光源での固定ターゲットシリアルデータ収集

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...