Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

나노 이미징 빔라인 ID16A에 대한 실험은 ESRF 제안 LS2430, LS2303, 및 LS2765의 프레임에서 수행되었다.

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저자는 이해관계의 충돌이 없습니다.

저온전자 현미경(cryo-EM)은 2017년 노벨 화학상을 수상했으며, 이에 따라 용액25에서생체분자의 고분해능 구조 판정을 위한 생물학적 물질의 유리화에 대한 J. Dubochet의 개발이 이루어졌습니다. 그의 노벨 강의에서 Dubochet에 의해보고 된 바와 같이 "물 방울을 vitrify하는 방법을 아는 것은 한 가지, 생물학적 관찰을위한 생물학적 샘플을 준비하는 것은 또 다른 것입니다"25. 냉동 준비 단계는 이제 방사선 선량 손상을 완화하고 자신의 모국에 가까운 세포를 연구하는 표준 기술로 간주됩니다. 그러나 준비는 지루한 남아 있습니다. 이것은 전자 현미경 검사법, 그것의 타의 추종을 불허하는 공간 해결책 때문에, 견본 준비 도중 생기는 어떤 초구조적인 유물든지에 민감하기 때문입니다. 싱크로트론 cryonanoprobes는 지금 고에너지 엑스레이 범위26에있는 13 nm의 낮은 공간 해상도로 내려가는 유사한 어려움에 접근하고 있습니다. 단단한 엑스레이 현미경 검사법은 전자 현미경 검사법은 아주 얇은 세포 조각을 관찰할 수 있게 하는 전자의 가난한 침투 깊이 때문에 손해를 입는 동안 전체 세포를 분석할 수 있습니다.
세포의 단층은 충분히 얇아서 액체 에탄의 급락 동결에 의해 물 유리화에 필요한 냉각 속도를 얻을 수 있습니다. 이론적으로, 108 K/s의 높은 냉각 속도는 급락 동결에 너무 두꺼운 시편의 유리화를 허용하는 고압 동결27을 사용하여 가능합니다. 주변 압력28에서시료의 완전한 유리화를 허용하는 데 필요한 105 K/s의 냉각 속도는 여기에 제시된 자동 플런지 동결 기계 및 파라미터를 사용하여 재현가능하게 도달합니다. 이것은 연구원이 액체 에탄에 있는 급락 동결에 의하여 세포의 단층12,13,14,15,29,30와 같은 얇은 생물학 견본 (<10 μm)를 vitrify할 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요한 과제는 세포 내 의 화학적 무결성을 가능한 한 많이 보존하여 세포 내의 신뢰할 수 있는 원소 분포를 2D 또는 3D로 제공하는 것입니다. 다른 곳에서 발표 된 바와 같이2,16,17,31, 세포 내 수준에서 원소 이미징의 경우 냉동 수화 세포의 분석을 고려해야합니다. 그렇지 않으면, 셀의 플런지 동결 및 동결 건조의 조합은 실온 분석에 사용될 수있다. 후자의 경우, 비정질 얼음은 승화 과정을 통해 제거되고 결합 된 물 분자는 탈착 과정을 통해 제거됩니다. 이러한 과정은 세포막의 가능한 변경 및 일부세포구조(32)의형태로 인해 동결된 수화 샘플에 비해 이상적이지 않을 수 있다. 또한, 견본 연구의 경우, 물 추출은 금속 표본 유물로 이어질 수 있습니다. 여전히, 그것은 성공하고 하위 100 nm 수준2,16,17,18,20,33,34,35,36에서원소 이미징을위한 냉동 수화 샘플에 대한 최선의 대안이었다.
37로보고된 바와 같이, 저온 보존 된 세포 제제의 품질은 칼륨 대 나트륨 K / Na 비율을 통해 평가 될 수 있습니다. 불행히도, 요소의 X 선 형광 광자를 검출하는 데 사용되는 실리콘 드리프트 검출기의 낮은 에너지 차단으로 인해 여기에서 사용되는 하드 X 선 나노 프로브로 아직 결정될 수 없습니다 (E ≥ 1.3 keV 마그네슘). 실제로, TOF-SIMS, EPMA, 또는 핵 마이크로프로브 PIXE16을사용하여 측정할 수 있는 높은 K/Na 비율(>10)은 살아있는 셀(37)에서예상되는 K/Na(25)와 비교하여 세포의 보존된 화학적 무결성을 나타낸다. 이것은 수반되는 낮은 Cl/K 비율38에의해 지원될 수 있습니다. 여전히, 불완전한 유리화, 특히 시료 냉각 속도가 너무 낮은 경우, 세포막과 세포기관을 손상시킬 수있는 큰 얼음 결정의 형성으로 이어질 수 있습니다, 결과적으로 화학 원소의 분포를 변경. 이러한 잠재적인 손상과 세포내 분포에 미치는 영향을 모니터링하는 일상적인 절차는 없지만, 위의 원소 비율과 X선 위상 대비 또는 극저온 연약한 X선 현미경을 사용하여 고해상도로 세포를 이미지화할 수 있는 가능성은 원소 무결성의 수반되는 보존과 함께 세포내 구획의 양호한 보존을 지원하는 가장 좋은 방법이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 조합과 새로 개발 된 극저온 형광 광학 현미경의 사용은이 손상이 발생하고 세포 내 원소 분포에 영향을 미치는 정도를 평가하는 데 도움이됩니다.
전반적으로, 싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 위한 세포 샘플을 준비하는 상세하고 포괄적인 프로토콜이 제시된다. 그것은 연구 사회를 위한 좋은 출발점, (cryo) 하드 X 선 나노 프로브에서 2D 및 3D 원소 이미징에 대 한 적절 한 세포 샘플을 준비 하는 방법의 어려운 문제를 해결 하는 데 도움이. 이러한 접근법은 세포의 심층적인 상관 관계 화학 및 구조 이미징을 위해 광학 형광 및 전자 현미경 기능과 병합될 수 있습니다.

새로 설계된 싱크로트론 X선 형광(SR-XRF) 나노프로브는 완전히 정량적인 방식으로 요소의 세포외 분포를 시각화할 수 있게 합니다. 예를 들어, 이 분석 능력은 오스뮴 기반 복합체2와같은 나노 입자1 또는 유기 금속 분자의 섭취를 조사할 수 있게 하여 강력한 항암 특성을 가진 금속 기반 분자의 세포내 섭취에 대한 통찰력을 제공합니다. 다요소 기술로서 나노프로브를 사용한 SR-XRF3는 인, 황, 칼륨, 칼슘, 철, 구리 및 아연을 포함한 세포내 가장 중요한 원소를 동시에 정량화하고 국소화할 수 있는 방법을 제공합니다. 실제로, 하드 엑스레이의 사용은 라벨이없는 방식으로 전체 냉동 수화 세포를 이미지에 큰 침투 깊이를 제공합니다. 또한, 관심있는 대부분의 요소의 K-에지에 대한 액세스를 제공, X 선 형광은 가장 효율적으로 흥분된다. 극저온 접근법의 사용은 방사선 손상의 감소와 세포 구조 및 원소 분포의 보존의 최적화를 허용합니다.
세포에서 금속을 연구하기 위해 공간적으로 해결된 대부분의 분석 기법은 세포의 매우 얇고 평평한 부분의 생산이 필요한 표면 기술입니다. 이것은 주로 에너지 분산 X 선 분석 (STEM-EDX), 에너지 여과 된 전송 전자 현미경 검사법 (EF-TEM), 및 나노 스케일 이차 이온 질량 분광법 (nanoSIMS)를 가진 스캐닝 전송 전자 현미경 검사법을 포함합니다. 후자는 냉동, 수화 세포 섹션에서 수행 할 수 없으며 저온 분석은 타의 추종을 불허하는 공간 해상도를 가진 전자 현미경 검사법으로 수행 할 수 있지만 원소 감도가 좋지 않습니다. 입자 유도 엑스레이 방출 (PIXE)는 전체 세포에서 원소 분포의 연구를 허용했습니다. 미크론 스케일과 서브미크론 해상도4에서도공정한 원소 감도로 완전히 정량화되는 장점이 있지만, 방사선 손상과 냉동 수화 세포를 연구하는 극저온 능력의 부족으로 고통받고 있습니다. 이 모든 분석 기술은 세포의 원소 화상 진찰에 있는 각각을 보완합니다, 그러나 모든 기술에 대한 견본 준비 절차는 중요한 단계입니다. 의미 있는 결과를 얻기 위해 가능한 오염뿐만 아니라 원소 재분배 및/또는 누출을 제한하기 위해 단순하게 유지해야 합니다. 전자 현미경검사법에서 입증된 바와 같이, 극저온 세포의 극저온 고정화 및 저온 스캐닝 단계로의 극저온전달을 포함하는 극저온 워크플로우는, 원어민 상태5,6,7,8,9,10에가능한 한 가까운 세포 내 수준에서 최적의 원소 보존을 가능하게 한다. 이러한 이해는 2D 또는 3D로 전체 냉동 수화 세포의 초구조 이미징을 생성하기 위해 싱크로트론 저온 연약한 X 선 현미경 검사법 (예 : 전체 필드 현미경 및 스캐닝 현미경)의 개발에 성공적으로 구현되었습니다. 로렌스 버클리 국립 연구소 12, 전자 저장 링 BESSY II (독일)13,ALBA 광원 (스페인) 14의 빔 라인 MISTRAL ,14,빔 라인 B2에서 로렌스 버클리 국립 연구소12의고급 광원의 Beamline 2.1 (XM-2)에서 부드러운 X 선 현미경을 위해11을 개발하였다. 유사한 워크플로우가 최근 X선 마이크로프로브16,17을이용한 세포내 원소 분석을 위한 가장 신뢰할 수 있는 준비 및 보존 방법으로 나타났다.
X 선 나노 프로브 기술은 세포 원소 분석에 널리 사용되기 시작하지만, 특히 극저온 SR-XRF 기능의 출현과 함께, 어떤 단계적 프로토콜은 지금까지 연구 커뮤니티에 보급되지 않았습니다. 여기서, 극저온 조건하에서 분석될 실리콘 질화물 멤브레인상상에 단층으로 배양된 저온 고정 부착 세포를 제조하기 위한 상세한 절차가 제공된다. 실온에서 X선 분석을 수행해야 하는 경우에 대비하여 프로토콜 이후에 적용되는 동결 건조 단계도 제공됩니다. 제안된 프로토콜은 인간 유방암 세포MD-MB-2312와 함께 성공적으로 사용되었지만 동결건조는 마우스 뉴런18,20,21에서다른 사람들 사이에서 입증되었으며, 다양한 유형의 인간 또는 동물 세포로 용이하게 확장될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

세포 외 수준에서 금속 이온의 분포에 대해서는 거의 알려져 없습니다. 그러나, 그 화학 요소는 필수적인 규제 기능을 가지고 있고 그들의 방해된 항상성각종 질병에 관여합니다. 최첨단 싱크로트론 X선 형광 나노프로브는 2차원(2D) 및 3차원(3D) 금속 의 분포 및 전체 세포 내부의 금속 농도를 해명하는 데 필요한 감도 및 공간 분해능을 제공합니다. 세포 수준. 이것은 세포의 생리병리학에 있는 금속의 역할에 조사의 새로운 흥미진진한 과학적인 필드를 엽니다. 세포 준비는 키와 종종 복잡 한 절차, 특히 기본 분석에 대 한. X 선 형광 기술이 지금 광범위하고 각종 준비 방법이 이용되었더라도, 아주 몇몇 연구 결과는 세포의 원소 내용의 보존을 기껏해야 조사하고, 극저온 준비를 위한 단계적으로 상세한 프로토콜이 없습니다 X선 형광 나노프로브에 대한 부착 세포는 지금까지 출시되었습니다. 이는 동결된 수화 상태에서 세포의 싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 가능하게 하는 빠른 저온 광에 대한 단계적 세포 제제를 제공하는 프로토콜에 대한 설명이다. 나노 분석이 실온에서 수행되어야 하는 경우, 냉동 고착 부착 세포 제제를 동결 건조하기 위한 추가 적인 절차가 제공된다. 제안된 프로토콜은 유방암 세포에 있는 유기금속 화합물의 2D 및 3D 세포 내 분포를 공부하기에서, 전작에서 성공적으로 이용되었습니다.

폴리-L-리신 코팅 Si3N4 멤브레인 지지체 에 서브 배양된 동결 수화 MDA-MB-231 세포의 전형적인 광학 비디오 현미경 뷰는 도 7A에도시되어 있다. 진공 챔버 내의 시료의 광학 뷰는 ESRF22의ID16A 빔라인의 전용 온라인 비디오 현미경을 사용하여 반사 모드에서 수득하였다. 전자 또는 연약한 X선 현미경 검사법은 세포를 가능한 한 얇게 삽입하는 얼음 층(일반적으로 <0.5 μm)을 필요로 하지만, 하드 X선(>10 keV)은 훨씬 더 높은 침투 깊이와 낮은 용량의 증착이라는 장점이 있습니다. 얼음 두께는 따라서 셀을 포함하는 전형적으로 <10 μm더 클 수 있으므로 세포를 포함하는 얼음은 두께가 몇 μm입니다. 이는 500 nm 두께의 Si3N4 멤브레인의 흡수를 고려하여 시료없이 강도에 비해 전송에서 측정된 X선 강도를 통해 추정될 수 있다. 이러한 얼음 두께는 본 프로토콜에 기재된 바와 같이 수동 블로팅을 통해 달성될 수 있다. 뉴턴 링 영역에서 얼음 두께는 더 얇을 수 있습니다(측정되지 않음).
동결된 수화 세포의 X선 형광 원소 매핑은 칼륨(K), 황(S) 및 아연(Zn)과 같은 생리학적 원소의 대표적인 분포와 함께 도 7B에 도시되어 있다. 이러한 맵은 원소 아레알 질량(즉, 원소 투영 질량)을 나타냅니다. 본 사례에서 수행되지 않는 동안, 이러한 맵은 시료 투영 질량23의추정을 제공하는 X선 전파 기반 위상 대비 이미징을 통해 정규화될 수 있다. 많은 연구에 의해 보고된 바와 같이, 그들의 근거체 상태로 보존된 세포에서 고도로 확산성이 높은 K 이온은 전체 세포23,24,16에걸쳐 균질하게 분포되는 것으로 가정되었다. 도 7B의2D X선 형광 원소 이미지에 도시된 바와 같이, 단단히 결합된 요소 S는 K와 유사하게 세포 내에서 고르게 분포되었고, 세포 질량 프로파일의 양호한 추정치를 나타낸다. Zn 분포는 시토졸에서 보다 핵에서 더 높은 신호를 가졌고 명확하게 핵을 설명했다. 핵 영역의 공간 해상도(50nm)에서 작은 Zn 농축 영역을 감지할 수 있다는 점에 유의할 수 있습니다.
기존의 X선 나노프로브 또는 구축될 나노프로브가 반드시 극저온 기능을 수용할 필요는 없다. 이 경우, 서브-100 nm 공간 분해능에서 세포의 X선 형광 이미지를 얻는 가장 좋은 대안은 세포의 플런지 동결 후 이 프로토콜에 기재된 동결 건조 절차를 수행하는 것이다. 도 8A는 Si3N4 멤브레인 상에서 직접 배양된 결과동결건조 원발성 마우스 해마 뉴런의 전형적인 밝은 필드 현미경 도를 나타낸다. 이 경우, 깨끗한 건조 챔버에 저장하는 경우, 샘플은 사전에 1-2 주 제조 될 수 있으며 관심 영역의 등록을위한 일반 직립 광학 현미경으로 관찰 될 수있다. 동결 건조 된 샘플에 의해 포착 될 수 있으며 X 선 나노 빔 하에서 손상을 초래할 수 있으므로 주변 습도에 대한 노출을 방지하기 위해주의를 기울여야합니다. 이 절차는 매우 민감한 세포 (즉, 신경 세포)에 성공적으로 적용되었으며 암세포와 같은 다른 보다 강력한 유형의 세포로 더 나은 결과를 얻었습니다. 플런지 동결 된 세포에 관해서는, 전체 동결 건조 세포 디스플레이에 K, S 및 Zn의 X 선 형광 이미지는 위에서 설명한 것과 유사하다. 이들은 50-100 nm 공간 해상도에서 다양한 유형의 동결 건조 세포에서 발견되는 원소 분포를 대표한다. 동결 건조 전체 세포는 원소 무결성을 보존하는 대안이지만, 세포 형태(16)특히 세포막의 완벽한 보존을 희생한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> 그림 1: X선 형광 나노 분석을 위한 일반적인 샘플 지원. Si3N4 멤브레인은 보호 캡슐에 지지합니다. 이러한 유형의 기판은 실온 분석(저온 및 저진공 동결 건조 공정에 이어 플런지 동결 셀룰러 준비) 또는 극저온 X선 형광 분석에 모두 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> 그림 2: 셀 파종 후 실리콘 종화물 윈도우의 개략적 보기. 세포는 Si3N4 멤브레인 지지체의 폴리-L-리신 코팅 된 평평한 표면에 직접 배양된다. 때때로 기포는 Si3N4 멤브레인 지지체의 후면 캐비티에 포획될 수 있으며 프로토콜에 기재된 바와 같이 제거되어야 한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> 그림 3: 액체 질소 Dewar에서 플런지 냉동 Si3N4 멤브레인 지지체의 장기 보관을 위해 자체 개발한 3D 프린팅 저온 상자. (A)냉동 상자는 용기와 캡 (하부 부분)과(B)냉동 캡이있는 냉동 상자로 분해됩니다. 캡은 핀셋으로 조작할 수 있으며 회전에 의해 열리거나 잠글 수 있습니다. ESRF ID16A의 요청시 3D 프린팅에 대한 자세한 계획을 세우실 수 있습니다. 이 설계는 실리콘 염화물 TEM 그리드를 수용할 수 있도록 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> 도 4: Si3N4에서 배양된 세포의 블로팅. Si3N4 멤브레인상에 배양된 세포 단층을 급락-동결시키기 전에 암모늄 아세테이트 용액(A)으로 헹구고 필터 페이퍼(B)를 사용하여 신중하게 수동으로 블로틴화해야 한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> 그림 5: 자동 플런지 동결 EM-GP 기계. (A)자동 플런지 냉동고. (B)핀셋이 잠겨있는 환경 챔버(C)에탄 컵은 에탄 병에 연결된 라이카 액화로 덮여 있습니다. (D)유리화된 Si3N4 멤브레인의 LN2에 추가 저장을 위해 액화 에탄 및 저온 상자로 가득 찬 블랙 컵을 보여주는 플런지 동결 인클로저. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> 그림 6: 동결 건조 절차를 위한 시료 저온 전달 어셈블리. (A)Si3N4 멤브레인의 첫 번째 황동 수신자는 동결 건조기 공급 업체가 제공하는 샘플 이송 홀더 위에 장착됩니다. (B)및(C)제2 플랫 브라스 디스크가 커버로 사용되고 동결 건조기의 진공 인클로저에 삽입되는 콜드 트랩 인클로저로서 작용한다는 것을 보여준다. (D)스프링 이재형 전사봉이 있는 전체 어셈블리. (e)Si3N4 멤브레인에서 성장된 유리화된 세포 전제가 운반되는 샘플 홀더는 LN2-냉각동결 건조기에 추가로 삽입되어야 한다. 어셈블리를 장착하기 위한 모든 단계는 스티로폼 상자에 LN2로 이루어집니다. 명확성을 위해 모든 이미지는 LN2가없는 상태에서 제작되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> 그림 7: 하드 X선 나노프로브를 사용하여 냉동 수화 된 세포의 저온 X 선 형광 이미지. (A)ESRF ID16A 빔라인의 전용 광학 비디오 현미경을 사용하여 리플렉션 모드에서 일반적인 온라인 보기. 수동 블로팅 후, 약 5-10 μm의 총 얼음 두께가 달성되어 냉동 수화 된 세포를 명확하게 볼 수 있습니다. 뉴턴 링이 있는 지역은 훨씬 더 얇은 얼음을 가리키는 것이 눈에 띈다. (B)대표적인 저온-X선 형광 세포 분포의 생리적 원소 칼륨(K), 황(S), 및 아연(Zn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> 그림 8: 하드 X선 나노프로브를 사용하여 동결건조된 뉴런 세포의 X선 형광 이미지. (a)Si3N4 멤브레인상에 직접 배양된 결과동결건조 1차 피질 뉴런 세포의 전형적인 밝은 필드 현미경 보기. 스케일 바 = 200 μm(B)대표적인 실온 X선 형광 이미지는 생리학적 원소 칼륨(K), 황(S) 및 아연(Zn)의 분포를 나타내는 단일 동결 건조 해마 뉴런이다. 배율 표시줄 = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

여기에 제시된 것은 싱크로트론 극저온 X선 나노프로브를 사용한 X선 형광 이미징 이전에 실리콘 질화물 멤브레인 및 플런지 동결에 대한 세포 배양 프로토콜이다. 실온 나노 분석만 이 제공되면, 동결된 시료는 더욱 동결건조될 수 있다. 이들은 세포내 원소 조성물에 대한 정보를 얻기 위한 중요한 단계이다.

싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 위한 실리콘 질화물 멤브레인의 세포 배양 및 저온 준비

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

새로 설계된 싱크로트론 x선 형광 나노 프로브는 시료의 원소 분포를 시각화할 수 있습니다. 극저온 접근법의 사용은 엑스레이 방사선 손상을 늦추기 위하여 필수적입니다. 따라서, 급속한 극저온은 세포 구조와 그 화학적 무결성의 보존을 최적화하기 위해 냉동 수화 세포를 얻기 위해 필수적이다.싱크로트론 연구를 위한 세포 제제의 특이성은 동결 수화 세포 단층층을 획득하기 위한 이 프로토콜의 최적화로 이끌어 내게 합니다. 시각적 데모는 얇은 얼음 층 내에 내장 된 재현적으로 극저온 고정 된 세포를 달성하기 위해 세포 단층 샘플을 조작하는 방법을 이해하는 데 중요합니다. 실리콘 체탈화물 멤브레인 지지체를 준비하려면 멤브레인 지지체가 들어있는 캡슐을 열고 캡슐을 부드럽게 짜서 지지체를 가볍게 풀어냅니다.얇은 핀셋을 사용하여 프레임 중앙에 있는 실리콘 질화물 멤브레인을 만지지 않도록 주의하고 프레임을 라미나르 플로우 캐비닛에 발견된 페트리 접시에 넣으세요. 그런 다음 UV는 멤브레인을 25~30분 동안 살균합니다. 멸균의 끝에서, 폴리 L-리신과 같은 부착 인자의 10 마이크로 리터를 추가합니다.섭씨 37도에서 25분, 습도가 높은 이산화탄소 5%를 배양합니다. 그런 다음 멸균 48웰 플레이트의 우물을 0.22 마이크로미터의 200~250마이크로리터로 채우고 우물당 초순수및 초미미미수로 여과하였다. 미세핀셋을 사용하여 멤브레인을 수직으로 조심스럽게 물에 10초 간 3개의 헹구는 데 사용하십시오.헹구고, 멤브레인을 라미나르 플로우 후드 아래에 멸균 96웰 플레이트의 빈 우물에 수직으로 놓고 건조할 때까지 밤새 둡니다. 관심 있는 세포의 파종을 위해, 코팅된 멤브레인을 평평한 면을 멸균 4웰 플레이트의 한 웰에 올려 놓습니다. 적절한 배양 배지의 10 마이크로리터에서 4개의 세포에 5회 10번을 첨가하여 막을 건드리지 않고 실리콘 진타막의 표면에 넣습니다.드롭은 전체 멤브레인을 커버해야합니다. 그런 다음 섭씨 37도, 습도가 있는 이산화탄소 5%로 세포를 배양합니다. 세포가 기판에 부착하기 시작했을 때, 천천히 각 멤브레인을 덮고 각 우물의 벽 아래로 완전한 배양 배지의 1 밀리리터를 추가합니다.그런 다음 섭씨 37도, 습도가 있는 이산화탄소 5%로 세포를 배양합니다. 셀룰러 제제의 극저온동원을 위해 먼저 자동 플런지 냉동고를 켜고 섭씨 37도의 암모늄 아세테이트 버퍼로 12웰 플라스틱 플레이트에 적절한 수의 우물을 채웁니다. 멤브레인을 헹기 직전에 인큐베이터에서 샘플을 제거하고 빠른 릴리스 핀셋 쌍의 검은 클램프 링을 사용하여 핀셋의 잠금을 해제합니다.잠금 해제 된 핀셋을 사용하여 멤브레인 지지체를 파악하고 암모늄 아세테이트 버퍼 용액 내에서 멤브레인을 수직으로 약 5 초 동안 침수하십시오. 초과 버퍼를 제거하려면 멤브레인 지지체의 바닥을 필터 용지에 누르고 멤브레인이 종이에 닿지 않고 프레임의 각 면을 필터 용지에 블롯합니다. 초과 버퍼가 제거되면 환경 챔버 도어를 열고 핀셋을 집게 연동에 빠르게 밀어 넣고 챔버의 문을 닫습니다.플로트 A 플런지를 누릅니다. 실리콘 질화물 멤브레인을 들고 있는 핀셋은 극저온으로 빠르게 급락합니다. 급락 동결 후, 미리 냉각 된 집게와 프레스 전송전송용기의 뚜껑을 제거합니다.실리콘 질화물 멤브레인은 극저온 위로 약간 이동됩니다. 빠른 단일 움직임에서 핀셋을 집게 에서 약간 기울여 핀셋을 질소 액체로 채워진 전송 용기의 냉동 상자의 빈 슬롯에 직접 가져옵니다. 그런 다음 검은 색 클램프 링을 해제하여 멤브레인을 해제합니다.플런지 냉동 셀의 동결 건조는 동결 건조 기기의 후면 패널에 있는 로커 스위치를 사용하여 기기에 전원을 공급합니다. 샘플을 로드할 준비가 되면 디스플레이에 누압 입력이 표시됩니다. 폴리스티렌 저장 용기에 공급 업체가 제공하는 샘플 전송 홀더 위에 실리콘 질소 막 황동 홀더를 장착하여 액체 질소의 수준을 첫 번째 황동 조각의 상단 가장자리보다 약 1 ~ 2 밀리미터 낮게 유지합니다.상기 셀 샘플 측이 황동 홀더 번호가 매겨진 캐비티에 위를 향하여 멤브레인을 놓고 액체 질소가 채워진 폴리스티렌 폼 박스에서 이송 막대를 미리 냉각시킵니다. 막대를 사용하여 전체 조립품에 고정하고, 진공을 눌러 동결 건조기 챔버의 뚜껑을 열고, 즉시 동결 건조기 챔버에서 샘플을 전송하고, 동결 건조기 챔버 뚜껑을 닫습니다. 그런 다음 즉시 눌러 동결 건조 주기를 계속합니다.동결 건조 주기의 끝에서, 챔버를 배출하고 동결 건조 샘플에 액세스하기 위해 전체 어셈블리를 제거하기 위해 정지를 누릅니다. 여기서 는 폴리-L-리신 코팅 실리콘 질화물 멤브레인 지지체에 서브배양된 냉동 수화 유방암 세포세포의 전형적인 광학 비디오 현미경이 입증된 바와 같이 나타난다. 얼어붙은 수화 세포의 X선 형광 원소 매핑은 칼륨, 황 및 아연과 같은 생리적 요소의 분포를 보여줍니다.본 대표적인 예에서, 단단히 결합된 유황 원소는 칼륨을 관찰하는 것과 유사한 패턴으로 세포 내로 균등하게 분포되었고 세포 질량 프로파일의 양호한 추정을 나타낸다. 그러나 아연 분포는 사이토솔과 핵 사이의 신호가 명확하게 정의된 사이토솔보다 핵 내에서 더 높은 신호를 나타냈다. 이 전형적인 브라이트필드 현미경 검사에서 실리콘 질화물 막에서 직접 배양된 동결 건조 1차 마우스 해마 뉴런의 전형적인 시야에서, 세포는 그들의 배양 또는 보존 방법에 의해 영향을 받지 않는 전형적인 신경 형태를 나타낸다.플런지-냉동 세포의 X선 형광 화상 진찰은 또한 50 100 나노미터 공간 해상도에서 이 대표적인 동결 건조 세포에 의해 전시된 전형적인 원소 분포를 제시합니다. 실리콘 질화물 창을 플롯하는 것은 급락 동결 후 세포의 가장 얇은 가능한 얼음 층을 얻기위한 것이 중요합니다. 세포 전지의 화학적 무결성을 보존하면 세포의 금속질이 싱크로트론 나노 프로브뿐만 아니라 다른 미세 분석 기술로 탐구될 수 있습니다.모든 싱크로트론 나노 프로브 분석이 극저온 온도에서 수행될 수 있는 것은 아니기 때문에, 냉동 수화 세포는 실온에서 분석을 용이하게 하기 위해 더 동결 건조될 수 있다. 액체 질소로 작업 할 때 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 항상 화염에서 멀리 연기 후드에 에탄 가스를 사용하는 것을 기억하십시오.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

연구

생화학

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

작은 각 엑스레이 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 고분자의 구조 연구

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

열토가 마리티마 M42 아미노펩티다제 TmPep1050의 올리고메릭 상태 전환을 연구하는 엑스레이 결정학

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...