Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Eksperimentene på nano-Imaging beamline ID16A ble utført i rammen av ESRF forslag LS2430, LS2303, og LS2765.

<ol>
	<li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage/genotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors.">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li><li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging.">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li><li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , (2000).</li><li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity,+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions,+and+down+regulation+of+MAO-B.">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li><li>Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+low+calcium+concentrations+in+cryosectioned+cells+by+parallel-EELS+mapping.">Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping.</a> Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).</li><li>Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+scanning+electron+microscopy+to+X-ray+analysis+of+frozen+hydrated+sections.+I.+Specimen+handling+techniques.">Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques.</a> Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).</li><li>Saubermann, A. J., Heyman, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections.">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, 169-182 (1987).</li><li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells.">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1875-1882 (1984).</li><li>Wroblewski, J., M&#252;ller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+X-ray+microanalysis+of+semi-thick+cryosections.">Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections.</a> Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).</li><li>Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreparation+of+mammalian+tissue+for+X-ray+microanalysis+in+STEM.">Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM.</a> Journal of Microscopy. 125, 149-156 (1982).</li><li>Harkiolaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-soft+X-ray+tomography:+Using+soft+X-rays+to+explore+the+ultrastructure+of+whole+cells.">Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).</li><li>McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+X-ray+tomography+and+cryogenic+light+microscopy:+the+cool+combination+in+cellular+imaging.">Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).</li><li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy.">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).</li><li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MISTRAL:+a+transmission+soft+X-ray+microscopy+beamline+for+cryo+nano-tomography+of+biological+samples+and+magnetic+domains+imaging.">MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).</li><li>Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+tomography+of+adherent+cells+at+European+synchrotrons.">Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons.</a> Methods in Cell Biology. 124, 151-175 (2014).</li><li>Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+single+cell+quantitative+elemental+imaging+using+proton+or+synchrotron+radiation+focused+beams.">Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+elemental+content+in+adherent+mammalian+cells+for+analysis+by+synchrotron-based+x-ray+fluorescence+microscopy.">Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+manganese+on+primary+hippocampal+neurons+from+rodents.">Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents.</a> Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+Cytotoxicity+Assay+on+Hippocampal+Neuronal+Cell+Culture.">Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture.</a> Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).</li><li>Gibon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+over-expression+of+TRPC6+channels+in+HEK-293+cells+favours+the+intracellular+accumulation+of+zinc.">The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).</li><li>Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Uptake+and+Storage+During+the+Formation+of+the+Cerebral+Cortex+in+Mice.">Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice.</a> Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).</li><li>Villar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopositioning+for+the+ESRF+ID16A+Nano-Imaging+Beamline.">Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline.</a> Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).</li><li>Kosior, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+hard+X-ray+phase+contrast+imaging+and+X-ray+fluorescence+microscopy+for+subcellular+metal+quantification.">Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification.</a> Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).</li><li>Bohic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrotron+hard+X-ray+microprobe:+fluorescence+imaging+of+single+cells.">Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells.</a> Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Development+of+Electron+Cryo-Microscopy+(Nobel+Lecture).">On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture).</a> Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).</li><li>Da Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+concentration+of+high-energy+X-rays+for+diffraction-limited+imaging+resolution.">Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution.</a> Optica. 4 (5), 492-495 (2017).</li><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high-pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+pratice+of+high+pressure+freezing.">Theory and pratice of high pressure freezing.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrarapid+freezing+for+the+preservation+of+cellular+ultrastructure.">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).</li><li>Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryo-Tomography.">Electron Cryo-Tomography.</a> Cellular Imaging. , 61-94 (2018).</li><li>Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+metal+content+and+intracellular+distribution+in+primary+hippocampal+neurons+with+synchrotron+X-ray+fluorescence.">Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence.</a> PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).</li><li>Vavpeti&#269;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+distribution+and+sample+integrity+comparison+of+freeze-dried+and+frozen-hydrated+biological+tissue+samples+with+nuclear+microprobe.">Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).</li><li>Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-preparation+procedures+for+elemental+imaging+by+sims+and+eftem.">Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem.</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 499-536 (2008).</li><li>Gramaccioni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+quantification+of+intracellular+element+concentration+by+X-ray+fluorescence+microscopy+combined+with+X-ray+phase+contrast+nanotomography.">Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography.</a> Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).</li><li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+and+Copper+Effects+on+Stability+of+Tubulin+and+Actin+Networks+in+Dendrites+and+Spines+of+Hippocampal+Neurons.">Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons.</a> ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).</li><li>Ortega, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+over-expression+induces+increased+iron+accumulation+and+redistribution+in+iron-exposed+neurons.">&#945;-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).</li><li>Fartmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+atomic+and+molecular+species+in+cancer+cultures+with+TOF-SIMS+and+Laser-SNMS.">Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS.</a> Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).</li><li>P&#229;lsg&#229;rd, E., Lindh, U., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+freeze-substitution+techniques+for+X-ray+microanalysis+of+biological+tissue.">Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue.</a> Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Mikroskopi vant 2017 Nobel prisen i kjemi og som sådan ble utbyggingen gjort av J. Dubochet på vitrifikasjon av biologisk materiale for en høyoppløsnings struktur bestemmelse av biomolekyler i løsning25. Som rapportert av Dubochet i sin Nobel foredrag "å vite hvordan å vitrify en dråpe vann er en ting, forbereder en biologisk prøve for biologisk observasjon er en annen"25. Cryopreparation trinn er nå betraktet som standard teknikk for å dempe stråling dose skade og studere celler nær deres opprinnelige tilstand. Forberedelsene er imidlertid kjedelig. Dette er fordi elektron mikroskopi, på grunn av sin uovertruffen romlig oppløsning, er følsom for alle ultrastructural gjenstand som oppstår under prøven forberedelse. Den Synchrotron cryonanoprobes er nå nærmer lignende vanskeligheter går ned til romlige vedtak så lavt som 13 NM i høy energi X-ray rekkevidde26. Hard X-ray mikroskopi kan analysere hele celler mens elektron mikroskopi lider av de fattige penetrasjon dybden av elektroner slik at bare svært tynne celle skiver som skal overholdes.
Monolagere av celler er tynne nok til at ved å fryse i flytende etan, er de påkrevde kjøle hastighetene for vann vitrifikasjon oppnådd. I teorien, kjøling priser så høyt som 108 K/s er mulig ved hjelp av høytrykks frysing27 som gjør at vitrifikasjon av prøvene for tykk for stuper frysing. En kjøle hastighet på 105 K/s, som kreves for å tillate full vitrifikasjon av prøven ved omgivelsestrykk28, er nådd reproduserbar ved hjelp av automatisk stupe frysing maskin og parametre som presenteres her. Dette gjør det mulig for en forsker å vitrify tynne biologiske prøver (< 10 μm), for eksempel en monolag av cellene12,13,14,15,29,30 ved å fryse i flytende etan.
En viktig utfordring med denne protokollen er å også bevare så mye som mulig den kjemiske integriteten til intracellulære innhold for å gi pålitelige Elemental distribusjoner i cellen i 2D eller 3D. Som publisert andre steder2,16,17,31, i tilfelle av elementær Imaging på subcellulære nivå, bør analysen av frosne hydrert celler vurderes. Ellers kan kombinasjonen av stupe-frysing og fryse-tørking av celler brukes til romtemperatur analyse. For sistnevnte fjernes amorfe isen gjennom prosessen med sublimering, mens de bundne vannmolekylene fjernes gjennom prosessen med desorpsjon. Denne prosessen kan være langt fra ideelt i forhold til frosne hydrert prøver på grunn av mulig endring av cellulære membraner og morfologi av noen subcellulære strukturer32. Også for artsdannelse studier, vann utvinning kan føre til metall artsdannelse gjenstander. Likevel har det vært vellykket og det beste alternativet til frosne hydrert prøver for elementær bildebehandling ved sub-100 NM nivå2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Som det har blitt rapportert37, kvaliteten på embryo cellulære preparater kan evalueres gjennom kalium-til-natrium K/na ratio. Beklageligvis, den kan ikke ennå være besluttet med det hard X-rokke hippocampusen anvendt her over, på grunn av det lav energi kutt-av av det Silicon drift merker pleide merker det X-rokke fluorescens fotoner av delene (E ≥ 1,3 keV magnesium). Faktisk, en høy K/na-forhold (> 10) som kan måles ved hjelp av TOF-Sims, EPMA, eller kjernefysiske microprobe PIXE16,37 er en indikasjon på den bevarte kjemiske integriteten til cellen i forhold til den forventede K/na av 25 i en levende celle37. Dette kan støttes av et samtidig lavt CL/K-forhold38. Likevel, ufullkommen vitrifikasjon, spesielt hvis hastigheten på prøven kjøling er for lav, kan føre til dannelse av store iskrystaller som kan skade cellemembraner og organeller, følgelig endre fordelingen av kjemiske elementer. Selv om det ikke er noen rutine prosedyre for å overvåke denne potensielle skaden og innvirkningen på den intracellulære fordelingen, kan de ovennevnte element forholdene og muligheten til å avbilde cellen med høy oppløsning ved hjelp av X-ray fase kontrast eller fryse-Soft røntgen mikroskopi være de beste tilnærmingene for å støtte god bevaring av intracellulære rom med samtidig bevaring av elementær integritet. Kombinasjonen av disse teknikkene og bruken av nyutviklet cryocorrelative fluorescens optiske mikroskop vil bidra til å vurdere i hvilken grad denne skaden oppstår og påvirker intracellulære Elemental fordeling.
Total, en detaljert og allsidig protokollen å forberede Cellular eksemplar for Synchrotron X-rokke fluorescens nano-analyse er forevist. Det er et godt utgangspunkt for forskningen samfunnet, bidrar til å løse den vanskelige spørsmålet om hvordan å forberede passende cellulære prøver for 2D og 3D elementær Imaging på (fryse) hard X-ray hjemme. Disse tilnærmingene kan slås sammen med optiske fluorescens og elektron mikroskopi evner for dyptgående correlative kjemisk og strukturell bildebehandling av celler.

Nydesignede Synchrotron X-ray fluorescens (SR-XRF) hjemme tillate visualisering av subcellulære fordeling av elementer i en fullstendig kvantitativ måte. Som et eksempel, denne analytiske evnen tillater gransking av opptaket av nanopartikler1 eller organometalliske molekyler som Osmium-baserte komplekser2, gir innsikt i intracellulære opptak av metall-baserte molekyler med potente anticancer egenskaper. Som en multielement teknikk, SR-XRF3 med en hippocampusen gir en måte å samtidig kvantifisere og lokalisere intracellulært mest biologisk viktige elementer, inkludert fosfor, svovel, kalium, kalsium, jern, kobber og sink. Faktisk gir bruk av harde røntgenstråler stor penetrasjon dybde til bildet hele frosne-hydrert celler i en etikett-fri mote. Videre gir tilgang til K-kanten av de fleste elementer av interesse, er X-ray fluorescens spent mest effektivt. Bruken av kryogene tilnærminger tillater reduksjon av strålings skade og optimalisering av bevaring av cellestrukturen og Elemental fordeling.
De fleste tilgjengelige romlig løst analytiske teknikker for å studere metaller i cellene er overflate teknikker som krever svært tynne og flate deler av celler som skal produseres. Dette omfatter hovedsakelig skanning overføring elektron mikroskopi med energi-dispersive X-ray analyse (STEM-EDX), energi-filtrert overføring elektron mikroskopi (EF-TEM), og nanoskala sekundære ion Mass massespektrometri (nanoSIMS). Sistnevnte kan ikke utføres på frosne, hydrert celle seksjoner mens fryse-analyse kan gjøres med elektron mikroskopi med uovertruffen romlig oppløsning, men dårlig Elemental følsomhet. Partikkel-indusert X-ray-utslipp (PIXE) har tillatt studiet av elementær distribusjoner i hele celler. Det har fordelen av å være fullt kvantitative med en rettferdig Elemental følsomhet på mikron skala og selv på submikron oppløsning4, men lider av stråling skader og mangel på kryogene evner å studere frossen-hydrert celler. Alle disse analytiske teknikker utfyller hverandre i elementær bildebehandling av celler, men for alle teknikker prøven forberedelse prosedyren er et avgjørende skritt. Det bør holdes enkelt å begrense mulig forurensning, samt Elemental omfordeling og/eller lekkasje for å oppnå meningsfulle resultater. Som demonstrert i elektron mikroskopi, en kryogene arbeidsflyt, inkludert immobilisering av cellen og cryotransfer til et cryoscanning Stadium, tillater en optimal element bevaring på subcellulære nivåer så nær som mulig til den innfødte staten5,6,7,8,9,10. Denne forståelsen har blitt implementert i utviklingen av Synchrotron fryse-Soft røntgen mikroskopi (f.eks. full felt mikroskop og skanning mikroskop) for å produsere ultrastructural avbildning av hele frosne-hydrert celler i 2D eller 3D. Ulike kryogene arbeidsflyter ble utviklet11 for Soft X-ray mikroskop på Beamline 2,1 (XM-2) av Advanced Light kilde ved Lawrence Berkeley National Laboratory12, Beamline U41-XM ved ELEKTRON lagring ringen BESSY II (Tyskland)13, Beamline MISTRAL av Alba lyskilde (Spania)14, og på Beamline B24 av Diamond lyskilde15, blant andre. En lignende arbeidsflyt ble nylig vist å være den mest pålitelige Forberedelses-og bevarings metoden for intracellulære elementær analyse ved hjelp av røntgen microprobes16,17.
Selv om X-ray hippocampusen teknikker begynner å bli mye brukt for mobilnettet elementær analyse, særlig med bruk av kryogene SR-XRF evner, ingen trinnvis protokollen har blitt formidlet så langt til forskningsmiljøet. Her er en detaljert prosedyre gitt for å forberede cryofixed tilhenger celler kultivert som monolagere på silisium nitride membraner som skal analyseres under kryogene forhold. En fryse-tørking trinn som skal påføres etter at protokollen i tilfelle X-ray analyse må utføres ved romtemperatur er også gitt. Mens den foreslåtte protokollen har blitt brukt med menneskelige brystkreftceller MD-MB-2312 og fryse-tørking ble demonstrert blant annet på mus neurons18,20,21, det kan lett utvides til ulike typer av menneske-eller dyreceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

Svært lite er kjent om fordelingen av metall ioner på subcellulære nivå. Men de kjemiske elementene har viktige regulatoriske funksjoner og deres forstyrret homeostase er involvert i ulike sykdommer. State-of-the-art Synchrotron X-ray fluorescens hjemme gi den nødvendige følsomhet og romlig oppløsning for å belyse den todimensjonale (2D) og tredimensjonal (3D) distribusjon og konsentrasjon av metaller i hele celler på organelle nivå. Dette åpner nye spennende vitenskapelige felt av etterforskning på rollen av metaller i physiopathology av cellen. Den cellulære forberedelse er en nøkkel og ofte komplisert prosedyre, spesielt for grunnleggende analyse. Selv om X-ray fluorescens teknikker er nå utbredt og ulike forberedelser metoder har blitt brukt, svært få studier har undersøkt bevaring av Elemental innhold av celler i beste fall, og ingen trinnvis detaljert protokoll for cryopreparation av tilhenger celler for X-ray fluorescens hjemme har blitt sluppet så langt. Dette er en beskrivelse av en protokoll som gir trinnvis cellulær forberedelse for rask cryofixation å muliggjøre Synchrotron X-ray fluorescens nano-analyse av celler i en frossen hydrert tilstand når et kryogene miljø og overføring er tilgjengelig. I tilfelle nano-analyse må utføres ved romtemperatur, en ekstra prosedyre for fryse-tørking cryofixed tilhenger Cellular forberedelse er gitt. De foreslåtte protokollene har blitt brukt i tidligere arbeider, senest i å studere 2D og 3D intracellulære distribusjon av en organometalliske sammensatte i brystkreftceller.

En typisk optisk video mikroskop visning av frossen hydrert MDA-MB-231 celler som var sub-kultivert på en Poly-L-lysin belagt si3N4 membran støtte er vist i figur 7a. Den optiske visningen av prøven i vakuumkammeret ble innhentet i refleksjon modus ved hjelp av dedikert online video mikroskop av ID16A beamline av ESRF22. Mens elektron eller myk røntgen mikroskopi krever at isen laget embedding cellen å være så tynn som mulig (vanligvis < 0,5 μm), hard røntgen (> 10 keV) har fordelen av en mye høyere gjennomtrenging dybde og lavere dose avsetning. Isen tykkelse kan derfor være større, vanligvis < 10 μm inkludert cellen slik at isen embedding cellen er noen μm i tykkelse. Dette kan anslås gjennom den målte X-ray intensitet i overføring sammenlignet med intensiteten uten prøven, tar hensyn til absorpsjon av 500 NM tykk si3N4 membran. Denne isen tykkelse kan oppnås gjennom manuelle blotting som beskrevet i denne protokollen. I Newton ringene regionen, kan isen tykkelse bli enda tynnere (ikke målt).
Den X-ray fluorescens Elemental kartlegging av den frosne hydrert cellen er vist i figur 7B med representative distribusjoner av fysiologiske elementer som kalium (K), svovel (S) og sink (Zn). Disse kartene representerer elementær areal massen (dvs. elementær projisert masse). Selv om det ikke er gjort i den foreliggende sak, kan slike kart bli normalisert gjennom X-ray forplantning-basert fase kontrast Imaging som gir estimering av prøven projiserte massen23. Som rapportert av mange studier, den svært ekstremt K ion i cellene bevart i nær-native State ble antatt å være homogent fordelt gjennom hele cellen23,24,16. Som vist i 2D X-ray fluorescens Elemental bilder i figur 7B, ble tett bundet element S jevnt fordelt i cellen, på samme måte som K, og representerer et godt anslag over mobilnettet masse profil. Den Zn fordelingen hadde et høyere signal i kjernen enn i stoffer og tydelig skissert kjernen. Det kan bemerkes at små Zn-beriket regioner kan påvises ved romlig oppløsning (50 NM) i den kjernefysiske regionen.
Det eksisterende X-rokke hjemme eller det seg å bli bygget ikke nødvendigvis huse kryogene evnene. I dette tilfellet er det beste alternativet å få X-ray fluorescens bilder av celler ved sub-100 NM romlige oppløsninger er å utføre en fryse-tørking prosedyre beskrevet i denne protokollen etter stuper frysing av cellen. Figur 8a viser en typisk lyse feltet mikroskopi syn på resulterende fryse-tørket primær mus hippocampus neurons direkte kultivert på si3N4 membran. I dette tilfellet, hvis det oppbevares i et rent desiccated kammer, kan prøvene fremstilles 1 − 2 uker på forhånd og observeres med et vanlig oppreist optisk mikroskop for registrering av interesseområder. Det bør utvises forsiktighet for å hindre eksponering for omgivelsesluft fuktighet, da det kan fanges opp av den fryse-tørkede prøven og føre til skade under røntgen nanobeam. Denne prosedyren ble brukt med hell på svært følsomme celler (dvs. neuronal celler) og enda bedre resultater ble innhentet med andre mer robuste typer celler, for eksempel kreftceller. Som for stup frosne celler, X-ray fluorescens bilder av K, S, og Zn på hele fryse-tørket celle displayet ligner på de som er beskrevet ovenfor. De er representative for de grunnleggende distribusjonene som finnes i ulike typer fryse-tørkede celler ved 50 − 100 NM romlig oppløsning. Mens fryse-tørking hele celler er et alternativ til å bevare elementær integritet, er det på bekostning av en perfekt bevaring av cellen morfologi16, spesielt cellemembraner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> Figur 1: typisk eksempel støtte for X-ray-fluorescens nano-analyse. A si3N4 membran støtte i sin beskyttende kapsel. Denne typen substrat kan brukes både for romtemperatur analyse (stupe-fryse Cellular forberedelse etterfulgt av lav temperatur og lav vakuum fryse-tørking prosess) eller for kryogene X-ray fluorescens analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> Figur 2: skjematisk visning av silisium nitride Vinduer etter celle seeding. Cellene er kultivert direkte på Poly-L-lysin belagt flate overflaten av si3N4 membran støtte. Noen ganger luftbobler kan være fanget i baksiden hulrom av si3N4 membran støtte og må fjernes som beskrevet i protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> Figur 3: egenutviklet 3D-trykt fryseboks for langtidsoppbevaring av stupe frosset si3N4 membran støtter i flytende nitrogen Dewar. (A) fryseboks demontert med beholderen og caps (nedre del) og (B) den monterte fryseboksen med låste caps. Caps kan manipuleres med pinsett, åpning eller låsing ved rotasjon. En detaljert plan for 3D-utskrift er tilgjengelig på forespørsel fra ESRF ID16A. Designet har blitt gjort for å imøtekomme silisium nitride TEM-nett. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> Figur 4: blotting av celler kultivert på si3N4. Før stupe-frysing cellen monolag kultivert på en si3N4 membran må skylles i ammonium acetate løsning (a) og forsiktig manuelt blotted ved hjelp av filter papir (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> Figur 5: automatisk stupe-FRYSING EM-GP maskin. (A) automatisk stupe fryseboks. (B) miljøkammer med pinsett låst inn (C) etan-koppen dekket med Leica-liquefier som er koblet til en etan-flaske. (D) det spranget fryse skapet som viser den sorte koppen full av flytende etan og fryseboksen for videre lagring i ln2 av vitrified si3N4 membraner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> Figur 6: sample cryotransfer forsamlingen for fryse-tørking prosedyre. (A) den første messing mottaker for si3N4 membraner er montert på toppen av prøven overførings holde ren levert av fryse tørketrommel leverandøren. (B) og (C) viser at den andre flate messing platen brukes som deksel og fungerer som et kaldt felleskap som skal settes inn i vakuum kabinettet til fryse tørketrommelen. (D) full montering med den fjær fylte overførings stangen. (E) prøve holderen som frakter den vitrified celle blandingen som dyrkes på si3N4 -membranen, må legges ytterligere inn i ln2-avkjølt fryse tørketrommel. Alle trinnene for montering av forsamlingen gjøres i LN2 i en Styrofoam boks. For klarhet, ble alle bildene produsert i fravær av LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> Figur 7: fryse-X-ray fluorescens bilder av en frossen hydrert celle ved hjelp av hard X-ray-hippocampusen. (A) typisk online visning i refleksjon modus ved hjelp av dedikert optisk video MIKROSKOP av ESRF ID16A beamline. Etter manuell blotting ble det oppnådd en total is tykkelse på ca 5 − 10 μm som gir klar sikt til de frosne væske cellene. En region med Newton ringer indikasjon på enda mye tynnere isen er merkbar. (B) en representant fryse-X-ray fluorescens cellulære distribusjoner av fysiologiske elementer kalium (K), svovel (S), og sink (Zn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> Figur 8: X-ray fluorescens bilder av en fryse-tørket neuronal celle ved hjelp av hard X-ray hippocampusen. (A) typisk lyse feltet mikroskopi syn på resulterende fryse-tørket primære kortikale neuronal celler direkte kultivert på si3N4 membran. Scale bar = 200 μm (B) representant romtemperatur X-ray fluorescens bilder av en enkelt fryse-tørket hippocampus Nevron viser distribusjoner av fysiologiske elementer kalium (K), svovel (S), og sink (Zn). Scale bar = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Presentert her er en protokoll for cellekultur på silisium nitride membraner og stupe-frysing før X-ray fluorescens Imaging med en Synchrotron kryogene X-ray hippocampusen. Når bare romtemperatur nano-analysen er gitt, kan de frosne prøvene bli ytterligere fryse-tørket. Dette er avgjørende skritt for å få informasjon om intracellulære Elemental sammensetning.

Cell kultur på Silicon nitride membraner og Cryopreparation for Synchrotron X-ray fluorescens nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Nydesignede synchrotron x-ray fluorescens nano-prober tillater visualisering av elementær fordeling av en prøve. Bruken av kryogene tilnærminger er obligatorisk for å bremse røntgenstrålingsskader. Derfor er en rask kryofiksering avgjørende for å oppnå frosne hydrerte celler for å optimalisere bevaringen av cellestrukturen og dens kjemiske integritet.Spesifisiteten til cellulære preparater for synchrotron-studier fører til optimalisering av denne protokollen for å anskaffe frosne hydrerte cellemonolag. Visuell demonstrasjon er viktig for å forstå hvordan man manipulerer cellemonolagsprøvene for å oppnå reproduserbar kryofixed celler innebygd i et tynt lag av is. For å forberede en silisiumnitriummembranstøtte, åpne kapselen som inneholder membranstøtten og klem forsiktig kapselen for å løsne støtten lett.Bruk tynne pinsett til å gripe det ene hjørnet av silisiumrammen som tar vare på ikke å berøre silisiumnitrtidmembranen i midten av rammen og legg rammen i en avdekket petriskål i et laminært strømningskabinett. Deretter steriliserer UV membranen i 25 til 30 minutter. På slutten av steriliseringen, tilsett 10 mikroliter med festefaktor som poly-L-lysin.Inkuber i 25 minutter ved 37 grader Celsius og ved 5% karbondioksid med fuktighet. Fyll deretter brønnene på en steril 48-brønnsplate med 200 til 250 mikroliter på 0,22 mikrometer filtrert ultra rent og ultrasporvann per brønn. Bruk fine pinsett for å forsiktig senke membranen vertikalt med tre påfølgende 10-sekunders skyll i en brønn med vann.Etter skylling, legg membranen vertikalt i en tom brønn av en steril 96-brønnsplate under laminærstrømningshetten og la den stå over natten til den er tørr. For såing av cellene av interesse, legg den bebelagte membranen med den flate siden vendt opp i en brønn av en steril firebrønns plate. Legg fem ganger 10 til de fire cellene i 10 mikroliter av et passende kulturmedium til overflaten av silisiumnitrtidmembranen uten å berøre membranen.Dråpen skal dekke hele membranen. Deretter kultur cellene på 37 grader Celsius og 5% karbondioksid med fuktighet. Når cellene har begynt å feste seg til substratet, legg langsomt til en milliliter komplett kulturmedium nedover veggen på hver brønn som dekker hver membran.Deretter kultur cellene på 37 grader Celsius og 5% karbondioksid med fuktighet. For kryoimmobilisering av cellulær forberedelse, først slå på en automatisk stup fryser og fyll riktig antall brønner i en 12-brønns plastplate med 37 grader Celsius ammonium acetat buffer. Umiddelbart før skylling og stup frysing av membranen, fjern prøven fra inkubatoren og bruk den svarte klemmeringen til et par hurtigutløsnings pinsett for å låse opp pinsettene.Bruk de ulåste pinsettene til å gripe membranstøtten og dyppe membranen vertikalt i ammoniumacetatbufferløsningen i omtrent fem sekunder. Hvis du vil fjerne overflødig buffer, trykker du på bunnen av membranstøtten på filterpapir og tørker hver side av rammen på filterpapiret uten at membranen berører papiret. Når den overskytende bufferen er fjernet, åpner du døren til miljøkammeret, skyver raskt pinsettene inn i tangsperren og lukker døren til kammeret.Trykk blot Et stup. Pinsettene som holder silisiumnitrtidmembranen vil raskt bli kastet inn i kryogenet. Etter å ha stupt frysing, fjern lokket på overføringsbeholderen med forhåndskjølte tang og trykkoverføring.Silisiumnitrmembranen vil bli flyttet litt over kryogenet. I en rask enkelt bevegelse skyver du og vipper pinsettene litt ut av tangen for å bringe pinsettene direkte inn i et tomt spor av kryoboksen i overføringsbeholderen fylt med nitrogenvæske. Slipp deretter den svarte klemmeringen for å frigjøre membranen.For frysing av de stupefrosne cellene, bruk vippebryteren på bakpanelet på frysetørkingsinstrumentet for å slå på instrumentet. Displayet vil vise trykk enter når klar til å laste prøve. Monter silikonnitrøvmbranens messingholder på toppen av prøveoverføringsholderen som leverandøren har levert i lagerbeholderen med polystyren, og hold nivået av flytende nitrogen til omtrent en til to millimeter under den øverste kanten av det første messingstykket.Plasser membranen med celleprøvesiden vendt opp i messingholderen nummerert hulrom og forkjøl overføringsstangen i en flytende nitrogenfylt polystyrenskumboks. Bruk stangen til å låse i hele enheten, trykk enter for å bryte vakuumet for å frigjøre lokket på frysetørkerkammeret, umiddelbart overføre prøven i frysetørkerkammeret, og lukk frysetørkerkammeret lokket. Trykk deretter umiddelbart på start for å fortsette med frysetørkesyklusen.På slutten av frysetørkesyklusen trykker du på stopp for å lufte kammeret og fjerner hele enheten for å få tilgang til de frysetørkede prøvene. Her en typisk optisk video mikroskop visning av frosne hydrert brystkreft cellelinjeceller subkulturert på en poly-L-lysin belagt silisium nitrid membran støtte som vist er vist. Røntgenfluorescens elementær kartlegging av de frosne hydrerte cellene avslører fordelingene av fysiologiske elementer som kalium, svovel og sink.I dette representative eksemplet ble det tett bundne svovelelementet jevnt fordelt i cellen i et lignende mønster som observert for kalium og representerer et godt estimat av cellulær masseprofil. Sinkfordelingen viste imidlertid høyere signal i kjernen enn i cytosolen med en klart definert separasjon av signalet mellom cytosolen og kjernen. I denne typiske Brightfield mikroskopi visning av frysetørket primær mus hippocampal nevroner direkte dyrket på en silisium nitrin membran som demonstrert, cellene viser en typisk neural morfologi som er upåvirket av deres kultur eller bevaring metode.Røntgenfluorescensavbildning av stupefrosne celler avslører også typiske elementære fordelinger som utstilt av disse representative frysetørkede cellene med en romlig oppløsning på 50 til 100 nanometer. Plotting av silisiumnitrtridevinduet er avgjørende for å oppnå det tynneste mulige islaget av celler etter stuping frysing. Bevaring av cellenes kjemiske integritet på subcellulært nivå gjør at cellenes metallomme kan utforskes med synchrotron nano-sonder så vel som med andre mikroanalytiske teknikker.Siden ikke alle synchrotron nano-probeanalyse kan utføres ved kryogen temperatur, kan de frosne hydrerte cellene fryses ytterligere for å lette analysen ved romtemperatur. Husk å bruke egnet personlig verneutstyr når du arbeider med flytende nitrogen og alltid bruke etangass i en røykhette vekk fra flammer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Online Size-eksklusjon og ionebytterkromatografi på en SAXS tros

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomic skala strukturelle studier av Macromolecular samlinger av Solid-state kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombinere Røntgenkrystallografi med liten vinkel X-Ray spredning modell ustrukturert regioner i Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle studier av makromolekyler i løsning med liten vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En alt-i-ett sample holder for makro molekylære X-ray Crystallography med minimal bakgrunn spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Røntgenkrystallografi for å studere oligomerisk tilstand overgang av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Fluorescensbaserte målinger av fosfatidylserin/fosfatidylinositol 4-fosfatutveksling mellom membraner

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seriedatasamling med fast mål ved diamantlyskilde

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...