Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Os experimentos na linha de luz de nano-imagem ID16A foram realizados no quadro das propostas da ESRF LS2430, LS2303 e LS2765.

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Os autores não têm conflitos de interesse.

A microscopia crioeletrônica (crio-EM) ganhou o Prêmio Nobel de Química de 2017 e, como tal, o desenvolvimento feito por J. Dubochet na vitrificação de material biológico para a determinação da estrutura de alta resolução das biomoléculas na solução25. Conforme relatado por Dubochet em sua palestra do Nobel "Saber como vitrificar uma gota de água é uma coisa, preparar uma amostra biológica para observação biológica é outra"25. As etapas da criopreparação são consideradas agora a técnica padrão para abrandar dano da dose de radiação e para estudar pilhas perto de seu estado nativo. A preparação permanece tediosa, no entanto. Isso ocorre porque a microscopia eletrônica, devido à sua resolução espacial insuperável, é sensível a qualquer artefato ultraestrutural que ocorra durante a preparação da amostra. O síncrotron crionanoprobes agora estão se aproximando de dificuldades semelhantes indo para baixo para resoluções espaciais tão baixo quanto 13 nm na faixa de raios-X de alta energia26. A microscopia de raios-X duro pode analisar células inteiras, enquanto a microscopia eletrônica sofre com a baixa profundidade de penetração dos elétrons, permitindo que apenas fatias celulares muito finas sejam observadas.
Monocamadas de células são finas o suficiente para que, ao mergulhar-congelamento no etano líquido, as taxas de resfriamento necessárias para vitrificação de água são alcançados. Em teoria, as taxas de resfriamento tão altas quanto 108 K/s são possíveis usando congelamento de alta pressão27, o que permite a vitrificação de espécimes muito grossos para congelamento de mergulho. Uma taxa de resfriamento de 105 K/s, necessária para permitir a vitrificação completa da amostra com pressão ambiente28,é alcançada reproduzidamente usando a máquina automática de congelamento de mergulho e parâmetros apresentados aqui. Isso permite que um pesquisador vitrify espécimes biológicos finos (<10 μm), como um monocamada de células12,13,14,15,29,30 por mergulho de congelamento no etano líquido.
Um desafio importante com este protocolo é preservar também tanto quanto possível a integridade química do índice intracelular para fornecer distribuições elementares de confiança dentro da pilha em 2D ou em 3D. Conforme publicadoem outros lugares2,16,17,31,no caso de imagem elementar no nível subcelular, a análise de células hidratadas congeladas deve ser considerada. Caso contrário, a combinação de congelamento de mergulho e congelamento de células pode ser usada para análise de temperatura ambiente. Para este último, o gelo amorfo é removido através do processo de sublimação, enquanto as moléculas de água encadernadas são removidas através do processo de desorção. Este processo pode estar longe de ser ideal em comparação com amostras hidratadas congeladas devido à possível alteração das membranas celulares e à morfologia de algumas estruturas subcelulares32. Além disso, para estudos de especiação, a extração de água pode levar a artefatos de especiação metálica. Ainda assim, tem sido bem sucedido e a melhor alternativa às amostras hidratadas congeladas para imagens elementares nos níveis sub-100 nm2,16,17,18,20,33,35,35,36.
Como foi relatado37,a qualidade das preparações celulares criopreservadas pode ser avaliada através da relação K/Na de potássio para sódio. Infelizmente, ainda não pode ser determinado com a nanossonda de raios-X dura usada aqui, devido ao corte de baixa energia do detector de deriva de silício usado para detectar os fótons de fluorescência de raios-X dos elementos (E ≥ 1,3 keV magnésio). Na verdade, uma alta relação K/Na (>10) que pode ser medida usando TOF-SIMS, EPMA ou microssonda nuclear PIXE16,37 é indicativo da integridade química preservada da célula em comparação com o K/Na esperado de 25 em uma célula viva37. Isso pode ser suportado por uma baixa relação Cl/K concomitante38. Ainda assim, a vitrificação imperfeita, particularmente se a velocidade do resfriamento da amostra for muito baixa, pode levar à formação de grandes cristais de gelo que podem danificar as membranas celulares e organelas, alterando consequentemente a distribuição de elementos químicos. Embora não haja nenhum procedimento rotineiro para monitorar esse dano potencial e impacto na distribuição intracelular, as proporções elementares acima e a possibilidade de imagem da célula em alta resolução usando contraste de fase de raios-X ou microscopia crio-soft de raios-X podem ser as melhores abordagens para suportar a boa preservação de compartimentos intracelulares com preservação concomitante da integridade elementar. A combinação dessas técnicas e o uso de microscópios ópticos de fluorescência criocorrelativo recém-desenvolvidos ajudarão a avaliar até que ponto esse dano ocorre e afeta a distribuição elementar intracelular.
No geral, um protocolo detalhado e abrangente para preparar amostras celulares para a nanoanálise de fluorescência de raios X síncrotron é apresentado. É um bom ponto de partida para a comunidade de pesquisa, ajudando a resolver a difícil questão de como preparar amostras celulares apropriadas para imagens elementares 2D e 3D em nanoprobes de raios-X (crio) rígidos. Essas abordagens podem ser fundidas com capacidade óptica de fluorescência e microscopia eletrônica para imagens químicas e estruturais correlativas aprofundadas das células.

As nanosprobes recentemente projetadas da fluorescência do raio X do síncrotron (SR-XRF) permitem a visualização da distribuição subcelular dos elementos em uma maneira inteiramente quantitativa. Como exemplo, essa capacidade analítica permite a investigação da captação de nanopartículas1 ou moléculas organometálicas, como complexos à base de ópio2,fornecendo informações sobre a captação intracelular de moléculas à base de metais com potentes propriedades anticanceríons. Como uma técnica multielement, SR-XRF3 com um nanoprobe fornece uma maneira de quantificar simultaneamente e localizar intracellularly os elementos os mais biologicamente importantes, incluindo o fósforo, o enxofre, o potássio, o cálcio, o ferro, o cobre, e o zinco. Na verdade, o uso de raios-X rígidos fornece grande profundidade de penetração para a imagem de células totalmente hidratadas de forma livre de rótulos. Além disso, fornecendo acesso ao K-edge da maioria dos elementos de interesse, a fluorescência de raios-X é animado de forma mais eficiente. O uso de abordagens criogênicas permite a redução dos danos causados pela radiação e otimização da preservação da estrutura celular e distribuição elementar.
A maioria das técnicas analíticas resolvidas espacialmente disponíveis para estudar metais nas células são técnicas de superfície que exigem seções muito finas e planas de células a serem produzidas. Isso abrange principalmente a microscopia eletrônica de transmissão de varredura com análise de raios-X dispersivo de energia (STEM-EDX), microscopia eletrônica de transmissão filtrada de energia (EF-TEM) e espectrometria de massa de íons secundários em nanoescala (nanoSIMS). Este último não pode ser realizado em seções de células congeladas e hidratadas, enquanto a crio-análise pode ser feita com microscopia eletrônica com resolução espacial insuperável, mas má sensibilidade elementar. A emissão de raios-X induzida por partículas (PIXE) permitiu o estudo das distribuições elementares em células inteiras. Ele tem a vantagem de ser totalmente quantitativo com uma sensibilidade elementar justa na escala de mícrons e até mesmo na resolução submicron4,mas sofre de danos causados por radiação e falta de capacidades criogênicas para estudar células hidratadas congeladas. Todas essas técnicas analíticas se complementam na imagem elementar das células, mas para todas as técnicas o procedimento de preparação da amostra é um passo crucial. Deve ser mantido simples limitar a contaminação possível assim como a redistribuição elementar e/ou o escapamento para obter resultados significativos. Como demonstrado na microscopia eletrônica, um fluxo de trabalho criogênico, incluindo crio-imobilização da célula e criotransferência para uma fase de crioscada,permite uma preservação elementar ideal em níveis subcelulares o mais próximo possível do estado nativo5,6,7,8,9,10. Esse entendimento foi implementado com sucesso no desenvolvimento da microscopia de raios X crio-soft síncrotron (por exemplo, microscópios de campo completo e microscópios de varredura) para produzir imagens ultra-estruturais de células totalmente hidratadas em 2D ou 3D. Vários fluxos de trabalho criogênicos foram desenvolvidos11 para microscópios de raios-X macios em Beamline 2.1 (XM-2) da Fonte de Luz Avançada no Lawrence Berkeley National Laboratory12, linha de luz U41-XM no anel de armazenamento de elétrons BESSY II (Alemanha)13, beamline MISTRAL da fonte de luz ALBA (Espanha)14, e no Beamline B24 da fonte de luz Diamond15, entre outros. Um fluxo de trabalho semelhante foi recentemente mostrado como o método de preparação e preservação mais confiável para análise elementar intracelular usando microssondas de raios-X16,17.
Embora as técnicas de nanosonda de raios-X estejam começando a ser amplamente utilizadas para análise elementar celular, particularmente com o advento das capacidades criogênicas do SR-XRF, nenhum protocolo passo a passo foi divulgado até agora para a comunidade de pesquisa. Aqui, um procedimento detalhado é fornecido para preparar células aderentes criofixadas cultivadas como monocamadas nas membranas de nitreto de silício a serem analisadas condições criogênicas. Uma etapa da liofilização a ser aplicada após o protocolo caso que a análise do raio X deve ser executada na temperatura ambiente é fornecida igualmente. Enquanto o protocolo proposto tem sido usado com sucesso com células de câncer de mama humana MD-MB-2312 e o congelamento de secagem foi demonstrado entre outros em neurônios do rato18,20,21, pode ser facilmente estendido para vários tipos de células humanas ou animais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

Muito pouco se sabe sobre a distribuição de íons metálicos no nível subcelular. No entanto, esses elementos químicos têm funções regulatórias essenciais e sua homeostase perturbada está envolvida em várias doenças. Nanoprobes fluorescência de raios-X síncrotron síncrotron síncrotron de última geração fornecem a sensibilidade necessária e a resolução espacial para elucidar a distribuição e concentração bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) de metais dentro de células inteiras nível organela. Isso abre novos campos científicos emocionantes de investigação sobre o papel dos metais na fisiopatologia da célula. A preparação celular é um procedimento fundamental e muitas vezes complexo, particularmente para análise básica. Embora as técnicas de fluorescência de raios-X sejam agora generalizadas e vários métodos de preparação tenham sido usados, muito poucos estudos investigaram a preservação do conteúdo elementar das células na melhor das hipóteses, e nenhum protocolo detalhado em termos intatermos para a criopreparação de células aderentes para nanossondas de fluorescência de raios-X foram liberadas até agora. Esta é uma descrição de um protocolo que fornece a preparação celular stepwise para a criofixação rápida para permitir a fluorescência do raio X do síncrotron nano-análise das pilhas em um estado hidratado congelado quando um ambiente e uma transferência criogenic estão disponíveis. Caso a nano-análise tenha que ser executada na temperatura ambiente, um procedimento adicional para congelar-secar a preparação celular adepto criofixada é fornecido. Os protocolos propostos têm sido utilizados com sucesso em trabalhos anteriores, mais recentemente no estudo da distribuição intracelular 2D e 3D de um composto organometálico em células de câncer de mama.

Uma visão típica do microscópio de vídeo óptico de células mda-MB-231 hidratadas congeladas que foram subcultivadas em um suporte de membrana Si3N4 revestido de poli-l-lisina é mostrada na Figura 7A. A visão óptica da amostra na câmara de vácuo foi obtida em modo de reflexão usando o microscópio de vídeo on-line dedicado da linha de viga ID16A da ESRF22. Enquanto a microscopia de raios-X elétrons ou soft requer que a camada de gelo insera a célula seja o mais fina possível (tipicamente <0.5 μm), raios-X duros (>10 keV) têm a vantagem de uma profundidade de penetração muito maior e deposição de dose mais baixa. A espessura do gelo pode, portanto, ser maior, tipicamente <10 μm incluindo a célula para que o gelo que incorpora a célula é de alguns μm de espessura. Isso pode ser estimado através da intensidade medida de raios-X em transmissão em comparação com a intensidade sem a amostra, levando em conta a absorção da membrana Si3N4 de 500 nm de espessura. Esta espessura do gelo pode ser conseguida com a borração manual como descrito no protocolo atual. Na região dos anéis de Newton, a espessura do gelo pode ser ainda mais fina (não medida).
O mapeamento elementar de fluorescência de raios-X da célula hidratada congelada é mostrado na Figura 7B com as distribuições representativas de elementos fisiológicos como potássio (K), enxofre (S) e zinco (Zn). Esses mapas representam a massa elementar areal (ou seja, massa projetada elementar). Embora não seja feito no presente caso, tais mapas podem ser normalizados através de imagens de contraste de fase baseadas em propagação de raios-X que fornecem a estimativa da massa projetada pela amostra23. Conforme relatado por muitos estudos, o íon K altamente difusável em células preservadas em seu estado quase nativo foi assumido como homogeneamente distribuído por toda a célula23,24,16. Como mostrado nas imagens elementares de fluorescência de raios-X 2D na Figura 7B,o elemento bem encadernado S foi distribuído uniformemente dentro da célula, da mesma forma que K, e representa uma boa estimativa do perfil de massa celular. A distribuição de Zn tinha um sinal maior no núcleo do que no citosol e claramente delineou o núcleo. Note-se que pequenas regiões enriquecidas com Zn podem ser detectadas na resolução espacial (50 nm) na região nuclear.
As nanosprobes existentes do raio X ou as que estão a ser construídas não acomodam necessariamente capacidades criogénicas. Neste caso, a melhor alternativa para obter imagens de fluorescência de raios-X de células em resoluções espaciais sub-100 nm é realizar um procedimento de congelamento de secagem descrito neste protocolo após o congelamento da célula. A Figura 8A mostra uma visão típica de microscopia de campo brilhante dos neurônios hipocampais de camundongos primários liofilizados resultantes diretamente cultivados na membrana Si3N4. Neste caso, se armazenados em uma câmara limpa desidratada, as amostras podem ser preparadas com 1 a 2 semanas de antecedência e ser observadas com um microscópio óptico vertical comum para registro de regiões de interesse. Cuidados devem ser tomados para evitar a exposição à umidade ambiente, pois pode ser capturado pela amostra liofilizada e levar a danos o raio-X nanobeam. Este procedimento foi aplicado com sucesso a células muito sensíveis (ou seja, células neuronais) e resultados ainda melhores foram obtidos com outros tipos mais robustos de células, como células cancerosas. Quanto às células congeladas, as imagens de fluorescência de raios-X de K, S e Zn em toda a tela de células liofilizadas são semelhantes às descritas acima. Eles são representativos das distribuições elementares a serem encontradas em vários tipos de células liofilizadas em resolução espacial de 50 a 100 nm. Embora as células inteiras de congelamento sejam uma alternativa para preservar a integridade elementar, ela é à custa de uma preservação perfeita da morfologia celular16,particularmente as membranas celulares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> Figura 1: Suporte típico da amostra para a nano-análise da fluorescência do raio X. Um suporte de membrana Si3N4 em sua cápsula protetora. Este tipo de substrato pode ser usado tanto para análise da temperatura ambiente (preparação celular de congelamento de mergulho seguido de baixa temperatura e baixo processo de congelamento de gelo a vácuo) ou para análise de fluorescência criogênica de raios-X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> Figura 2: Vista esquemática das janelas do nitreto do silicone após a semeadura da pilha. As células são cultivadas diretamente na superfície plana revestida de poli-L-lisina do suporte de membrana Si3N4. Às vezes, bolhas de ar podem ser presas na cavidade traseira do suporte de membrana Si3N4 e têm que ser removidas conforme descrito no protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> Figura 3: In-house desenvolveu 3D impresso crio-caixa para armazenamento a longo prazo de mergulho congelado Si3N4 membrana suporta em nitrogênio líquido Dewar. (A)Cryo-box desmontado com o recipiente e as tampas (parte inferior) e (B)a crio-caixa montada com tampas trancadas. As tampas podem ser manipuladas com as pinças, abrindo ou travando por rotação. Um plano detalhado para impressão 3D está disponível mediante solicitação da ESRF ID16A. O projeto foi feito para acomodar grades tem do nitreto do silicone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> Figura 4: Borrão de células cultivadas em Si3N4. Antes de mergulhar-congelamento da célula monocamada cultivada em uma membrana Si3N4 precisa ser lavada em solução de acetato de amônio (A)e cuidadosamente borrada manualmente usando papel de filtro (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> Figura 5: Máquina EM-GP de congelamento automático de mergulhos. (A)O congelador automático do mergulho. (B) Câmara ambiental com as pinças trancadas em. (C) O copo de etano coberto com o liquefier Leica ligado a uma garrafa de etano. (D)O recinto de congelamento de mergulho mostrando o copo preto cheio de etano liquefeito e a crio-caixa para maior armazenamento em LN2 das vitrificadas membranas Si3N4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> Figura 6: Montagem de criotransferência de amostras para procedimento de congelamento. (A)O primeiro receptor de latão para membranas Si3N4 é montado em cima do suporte de transferência de amostras fornecido pelo fornecedor de secador de gelo. (B) e (C)mostram que o segundo disco de latão plano é usado como uma capa e atua como um recinto armadilha fria para ser inserido no gabinete de vácuo do secador de gelo. (D)A montagem completa com a haste de transferência de mola. (E)O suporte da amostra que carrega a preparação celular vitrificada cultivada na membrana Si3N4 deve ser inserido ainda mais no secador de congelamento resfriado ln2. Todos os passos para montar a montagem são feitos em LN2 em uma caixa de isopor. Para maior clareza, todas as imagens foram produzidas na ausência de LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> Figura 7: Imagens de fluorescência de raios-X crio-x de uma célula hidratada congelada usando nanossonda de raios-X rígido. (A)Visão on-line típica no modo de reflexão usando o microscópio de vídeo óptico dedicado da linha de feixe ESRF ID16A. Após a absão manual, foi alcançada uma espessura total de gelo de cerca de 5 a 10 μm que permite uma visão clara das células hidratadas congeladas. Uma região com anéis de Newton indicativo de gelo ainda muito mais fino é perceptível. (B) Recrio-Raios-X representativo fluorescência distribuições celulares de elementos fisiológicos potássio (K), enxofre (S) e zinco (Zn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> Figura 8: Imagens de fluorescência de raios-X de uma célula neuronal liofilizada usando nanossonda de raios-X rígido. (A) Visão típica de microscopia de campo brilhante de células neuronais corticais primárias liofilizadas resultantes diretamente cultivadas na membrana Si3N4. Barra de escala = 200 μm (B)Imagens representativas de fluorescência de raios X de temperatura x de um único neurônio hipocampal liofilizado mostrando as distribuições de elementos fisiológicos potássio (K), enxofre (S) e zinco (Zn). Barra de escala = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Apresentado aqui é um protocolo para a cultura celular em membranas de nitreto de silício e congelamento de mergulho antes da imagem de fluorescência de raios-X com uma nanossonda de raios-X criogênico síncrotron. Quando apenas a temperatura ambiente nano-análise é fornecida, as amostras congeladas podem ser mais liofilizadas. Estes são passos críticos para obter informações sobre a composição elementar intracelular.

Cultura celular em membranas de nitreto de silício e criopreparação para a fluorescência de raios-X synchrotron Nano-análise

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Nano-sondas de raios-X síncrotrons recém-projetadas permitem a visualização da distribuição elementar de uma amostra. O uso de abordagens criogênicas é obrigatório para diminuir os danos causados pela radiação de raios-X. Portanto, uma criofixação rápida é essencial para a obtenção de células hidratadas congeladas para otimizar a preservação da estrutura celular e sua integridade química.A especificidade das preparações celulares para estudos síncrotrons leva à otimização deste protocolo para aquisição de monocamadas de células hidratadas congeladas. A demonstração visual é importante para entender como manipular as amostras de monocamadas celulares para alcançar células reproduzivelmente criofixadas embutidas dentro de uma fina camada de gelo. Para preparar um suporte à membrana de nitreto de silício, abra a cápsula contendo o suporte da membrana e aperte suavemente a cápsula para afrouxar levemente o suporte.Use pinças finas para agarrar um canto da estrutura de silicone tomando cuidado para não tocar na membrana de nitreto de silício no centro da moldura e colocar o quadro em uma placa de Petri descoberta em um armário de fluxo laminar. Em seguida, UV esterilizar a membrana por 25 a 30 minutos. No final da esterilização, adicione 10 microliters de fator de fixação, como poli-L-lysina.Incubar por 25 minutos a 37 graus Celsius e a 5% de dióxido de carbono com umidade. Em seguida, encha os poços de uma placa estéril de 48 poços com 200 a 250 microliters de 0,22 micrômetros filtrados de água ultra pura e ultra-traço por poço. Use pinças finas para submergir cuidadosamente a membrana verticalmente com três enxágues consecutivos de 10 segundos em um poço de água.Após a lavagem, coloque a membrana verticalmente em um poço vazio de uma placa estéril de 96 poços sob o capô de fluxo laminar e deixe-a durante a noite até secar. Para a semeadura das células de interesse, coloque a membrana revestida com o lado plano voltado para cima em um poço de uma placa estéril de quatro poços. Adicione cinco vezes 10 às quatro células em 10 microliters de um meio de cultura apropriado à superfície da membrana de nitreto de silício sem tocar na membrana.A gota deve cobrir toda a membrana. Em seguida, cultura as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono com umidade. Quando as células começarem a se prender ao substrato, adicione lentamente um mililitro de cultura completa na parede de cada poço que cobre cada membrana.Em seguida, cultura as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono com umidade. Para a crioimmobilização da preparação celular, primeiro ligue um freezer automático de mergulho e encha o número apropriado de poços em uma placa de plástico de 12 poços com 37 graus Celsius tampão de acetato de amônio. Imediatamente antes de enxaguar e mergulhar congelando a membrana, remova a amostra da incubadora e use o anel de grampo preto de um par de pinças de liberação rápida para desbloquear a pinça.Use a pinça desbloqueada para agarrar o suporte da membrana e imergir a membrana verticalmente dentro da solução tampão de acetato de amônio por cerca de cinco segundos. Para remover qualquer excesso de tampão, pressione a parte inferior do suporte da membrana sobre o papel do filtro e borre cada lado da moldura no papel do filtro sem permitir que a membrana toque no papel. Quando o buffer em excesso tiver sido removido, abra a porta da câmara ambiental, deslize rapidamente a pinça para dentro do bloqueio de fórceps e feche a porta da câmara.Pressione a mancha Um mergulho. As pinças que seguram a membrana de nitreto de silício serão rapidamente mergulhadas no criogen. Após o congelamento do mergulho, remova a tampa do recipiente de transferência com fórceps pré-resfriados e pressione a transferência.A membrana de nitreto de silício será movida ligeiramente acima do criogen. Em um movimento único rápido, deslize e incline ligeiramente as pinças para fora do bloqueio dos fórceps para trazer a pinça diretamente para um slot vazio da caixa de criobox no recipiente de transferência cheio de líquido nitrogênio. Em seguida, solte o anel de grampo preto para liberar a membrana.Para a secagem congelante das células congeladas, use o interruptor de roqueiro localizado no painel traseiro do instrumento de secagem congelante para ligar o instrumento. O visor mostrará a entrada da prensa quando estiver pronto para carregar a amostra. Monte o suporte de latão de membrana de nitreto de silício em cima do suporte de transferência de amostra fornecido pelo fornecedor no recipiente de armazenamento de poliestireno mantendo o nível de nitrogênio líquido para cerca de um a dois milímetros abaixo da borda superior da primeira peça de latão.Coloque a membrana com o lado da amostra celular voltada para cima na cavidade numerada do suporte de latão e pré-esfrie a haste de transferência em uma caixa de espuma de poliestireno cheia de nitrogênio líquido. Use a haste para travar em conjunto completo, pressione digitar para quebrar o vácuo para liberar a tampa da câmara de secador congelante, transfira imediatamente a amostra na câmara de secador congelante e feche a tampa da câmara de secador congelante. Em seguida, pressione imediatamente comece a continuar com o ciclo de secagem congelante.No final do ciclo de secagem congelante, pressione parar para ventilar a câmara e remova o conjunto completo para acessar as amostras congeladas. Aqui, uma visão típica do microscópio óptico de vídeo de células de células cancerígenas de mama hidratadas congeladas subcultadas em um suporte de membrana de nitreto de silício revestida de poli-L-lysina, como demonstrado, é mostrado. O mapeamento elemental de fluorescência de raios-X das células hidratadas congeladas revela as distribuições de elementos fisiológicos como potássio, enxofre e zinco.Neste exemplo representativo, o elemento enxofre firmemente ligado foi distribuído uniformemente dentro da célula em um padrão semelhante ao observado para potássio e representa uma boa estimativa do perfil de massa celular. A distribuição de zinco, no entanto, apresentou maior sinal dentro do núcleo do que no citosol com uma separação claramente definida do sinal entre o citosol e o núcleo. Nesta visão típica de microscopia brightfield de neurônios hipocampais de camundongos primários congelados diretamente cultivados em uma membrana de nitreto de silício, como demonstrado, as células exibem uma morfologia neural típica que não é afetada por sua cultura ou método de preservação.Imagens de fluorescência de raios-X de células congeladas também revelam distribuições elementares típicas exibidas por essas células secas congelantes representativas a uma resolução espacial de 50 a 100 nanômetros. Traçar a janela de nitreto de silício é fundamental para obter a camada de gelo mais fina possível de células após o congelamento do mergulho. A preservação da integridade química das células no nível subcelular permite que o metallome das células seja explorado com nano-sondas síncrotrons, bem como com outras técnicas microanalíticas.Como nem toda análise de nanodessíntrona pode ser realizada à temperatura criogênica, as células hidratadas congeladas podem ser ainda mais congeladas para facilitar sua análise à temperatura ambiente. Lembre-se de usar equipamentos de proteção individual adequados ao trabalhar com nitrogênio líquido e sempre usar gás etano em um capô de fumaça longe das chamas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

On-line Tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Bioquímica

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Estudos estruturais de macromoléculas em solução usando o pequeno ângulo de espalhamento de raios-x

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Um suporte de amostra tudo-em-um para a cristalografia macromolecular do raio X com espalhamento mínimo do fundo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...