Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Эксперименты на нано-изображении луча ID16A были проведены в рамках предложений ESRF LS2430, LS2303 и LS2765.

<ol>
	<li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage/genotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors.">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li><li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging.">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li><li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , (2000).</li><li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity,+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions,+and+down+regulation+of+MAO-B.">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li><li>Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+low+calcium+concentrations+in+cryosectioned+cells+by+parallel-EELS+mapping.">Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping.</a> Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).</li><li>Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+scanning+electron+microscopy+to+X-ray+analysis+of+frozen+hydrated+sections.+I.+Specimen+handling+techniques.">Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques.</a> Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).</li><li>Saubermann, A. J., Heyman, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections.">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, 169-182 (1987).</li><li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells.">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1875-1882 (1984).</li><li>Wroblewski, J., M&#252;ller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+X-ray+microanalysis+of+semi-thick+cryosections.">Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections.</a> Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).</li><li>Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreparation+of+mammalian+tissue+for+X-ray+microanalysis+in+STEM.">Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM.</a> Journal of Microscopy. 125, 149-156 (1982).</li><li>Harkiolaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-soft+X-ray+tomography:+Using+soft+X-rays+to+explore+the+ultrastructure+of+whole+cells.">Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).</li><li>McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+X-ray+tomography+and+cryogenic+light+microscopy:+the+cool+combination+in+cellular+imaging.">Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).</li><li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy.">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).</li><li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MISTRAL:+a+transmission+soft+X-ray+microscopy+beamline+for+cryo+nano-tomography+of+biological+samples+and+magnetic+domains+imaging.">MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).</li><li>Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+tomography+of+adherent+cells+at+European+synchrotrons.">Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons.</a> Methods in Cell Biology. 124, 151-175 (2014).</li><li>Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+single+cell+quantitative+elemental+imaging+using+proton+or+synchrotron+radiation+focused+beams.">Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+elemental+content+in+adherent+mammalian+cells+for+analysis+by+synchrotron-based+x-ray+fluorescence+microscopy.">Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+manganese+on+primary+hippocampal+neurons+from+rodents.">Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents.</a> Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+Cytotoxicity+Assay+on+Hippocampal+Neuronal+Cell+Culture.">Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture.</a> Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).</li><li>Gibon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+over-expression+of+TRPC6+channels+in+HEK-293+cells+favours+the+intracellular+accumulation+of+zinc.">The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).</li><li>Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Uptake+and+Storage+During+the+Formation+of+the+Cerebral+Cortex+in+Mice.">Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice.</a> Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).</li><li>Villar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopositioning+for+the+ESRF+ID16A+Nano-Imaging+Beamline.">Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline.</a> Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).</li><li>Kosior, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+hard+X-ray+phase+contrast+imaging+and+X-ray+fluorescence+microscopy+for+subcellular+metal+quantification.">Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification.</a> Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).</li><li>Bohic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrotron+hard+X-ray+microprobe:+fluorescence+imaging+of+single+cells.">Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells.</a> Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Development+of+Electron+Cryo-Microscopy+(Nobel+Lecture).">On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture).</a> Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).</li><li>Da Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+concentration+of+high-energy+X-rays+for+diffraction-limited+imaging+resolution.">Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution.</a> Optica. 4 (5), 492-495 (2017).</li><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high-pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+pratice+of+high+pressure+freezing.">Theory and pratice of high pressure freezing.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrarapid+freezing+for+the+preservation+of+cellular+ultrastructure.">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).</li><li>Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryo-Tomography.">Electron Cryo-Tomography.</a> Cellular Imaging. , 61-94 (2018).</li><li>Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+metal+content+and+intracellular+distribution+in+primary+hippocampal+neurons+with+synchrotron+X-ray+fluorescence.">Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence.</a> PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).</li><li>Vavpeti&#269;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+distribution+and+sample+integrity+comparison+of+freeze-dried+and+frozen-hydrated+biological+tissue+samples+with+nuclear+microprobe.">Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).</li><li>Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-preparation+procedures+for+elemental+imaging+by+sims+and+eftem.">Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem.</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 499-536 (2008).</li><li>Gramaccioni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+quantification+of+intracellular+element+concentration+by+X-ray+fluorescence+microscopy+combined+with+X-ray+phase+contrast+nanotomography.">Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography.</a> Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).</li><li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+and+Copper+Effects+on+Stability+of+Tubulin+and+Actin+Networks+in+Dendrites+and+Spines+of+Hippocampal+Neurons.">Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons.</a> ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).</li><li>Ortega, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+over-expression+induces+increased+iron+accumulation+and+redistribution+in+iron-exposed+neurons.">&#945;-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).</li><li>Fartmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+atomic+and+molecular+species+in+cancer+cultures+with+TOF-SIMS+and+Laser-SNMS.">Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS.</a> Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).</li><li>P&#229;lsg&#229;rd, E., Lindh, U., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+freeze-substitution+techniques+for+X-ray+microanalysis+of+biological+tissue.">Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue.</a> Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов.

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) получила Нобелевскую премию по химии 2017 года и как таковую разработку, сделанную Дж.Дюбоше по витрификации биологического материала для определения структуры высокого разрешения биомолекул в растворе25. Как сообщил Дюбоше в своей Нобелевской лекции "Зная, как vitrify капли воды это одно, подготовка биологического образца для биологического наблюдения с другой"25. Криоподготовка шаги в настоящее время считается стандартным методом для смягчения повреждения дозы радиации и изучения клеток близко к их родному состоянию. Однако подготовка остается утомительной. Это потому, что электронная микроскопия, из-за его непревзойденного пространственного разрешения, чувствителен к любому ультраструктурному артефакту, который происходит во время подготовки образца. Синхротронные крионанозонды в настоящее время приближается аналогичные трудности спускаясь к пространственным разрешениям как низко как 13 нм в высокой энергии рентгеновского диапазона26. Твердая рентгеновская микроскопия может анализировать целые клетки, в то время как электронная микроскопия страдает от низкой глубины проникновения электронов, позволяя наблюдать только очень тонкие клеточные ломтики.
Монослойы клеток достаточно тонкие, так что при замораживании жидкого этана достигаются необходимые темпы охлаждения для витрификации воды. Теоретически, скорость охлаждения выше 108 К/с возможна с помощью замораживания27 высокого давления, что позволяет витрификации образцов слишком толстыми для замораживания. Скорость охлаждения 105 К/с, необходимая для обеспечения полной витрификации образца при атмосферном давлении28,достигается воспроизводимо с помощью автоматической машины замораживания погружения и представленных здесь параметров. Это позволяет исследователю vitrify тонких биологических образцов (l;10 мкм), таких как монослой клеток12,13,14,15,29,30 путем погружения замораживания в жидком этане.
Важная задача с этим протоколом также сохранить как можно больше химической целостности внутриклеточного содержания для обеспечения надежного элементарного распределения в клетке в 2D или 3D. Как опубликовано в другом месте2,16,17,31, в случае элементарной визуализации на субклеточном уровне, анализ замороженных гидратированных клеток должны быть рассмотрены. В противном случае для анализа комнатной температуры можно использовать комбинацию замораживания и замораживания клеток. Для последнего, аморфный лед удаляется через процесс сублимации, в то время как связанные молекулы воды удаляются через процесс desorpation. Этот процесс может быть далек от идеала по сравнению с замороженными гидратированными образцами из-за возможного изменения клеточных мембран и морфологии некоторых подклеточных структур32. Кроме того, для видообразований, добыча воды может привести к металлообразованию артефактов. Тем не менее, он был успешным и лучшая альтернатива замороженных гидратированных образцов для элементарной визуализации на суб-100 нмуровнях 2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Как было сообщено37, качество криоконсервированных клеточных препаратов может быть оценено через калий к натрию K/ Na соотношение. К сожалению, он пока не может быть определен с жестким рентгеновским нанозондом, используемым здесь, из-за низкой энергии отсечения кремниевого детектора дрейфа, используемого для обнаружения рентгеновских флуоресценции фотонов элементов (E - 1.3 кеВ магния). Действительно, высокое соотношение K/Na (Nogt;10), которое может быть измерено с помощью TOF-SIMS, EPMA, или ядерного микрозонда PIXE16,37 свидетельствует о сохраненной химической целостности клетки по сравнению с ожидаемым K/Na 25 в живой клетке37. Это может быть поддержано сопутствующим низким соотношением Cl/K38. Тем не менее, несовершенная витрификация, особенно если скорость охлаждения образца слишком низка, может привести к образованию крупных кристаллов льда, которые могут повредить клеточные мембраны и органеллы, что, следовательно, изменение распределения химических элементов. Хотя нет рутинной процедуры для мониторинга этого потенциального повреждения и воздействия на внутриклеточное распределение, вышеуказанные элементарные соотношения и возможность изображения клетки с высоким разрешением с помощью рентгеновской фазы контраста или крио-мягкой рентгеновской микроскопии могут быть наилучшими подходами для поддержки хорошего сохранения внутриклеточных отсеков с сопутствующим сохранением элементарной целостности. Сочетание этих методов и использование недавно разработанных криокорных флуоресцентных оптических микроскопов поможет оценить, в какой степени это повреждение происходит и влияет на внутриклеточное элементарное распределение.
В целом представлен подробный и всеобъемлющий протокол подготовки клеточных образцов для синхротронного рентгеновского флуоресценции наноанализа. Это хорошая отправная точка для научного сообщества, помогая решить трудный вопрос о том, как подготовить соответствующие образцы клеток для 2D и 3D элементарных изображений на (крио) жестких рентгеновских нанозондов. Эти подходы могут быть объединены с оптической флуоресценцией и возможностями электронной микроскопии для углубленной коррелятивной химической и структурной визуализации клеток.

Недавно разработанные синхротронные рентгеновские флуоресценции (SR-XRF) нанозонды позволяют визуализировать субклеточное распределение элементов в полностью количественном ключе. В качестве примера, эта аналитическая возможность позволяет исследует поглощение наночастиц1 или органометаллических молекул, таких как осмий на основе комплексов2, обеспечивая понимание внутриклеточного поглощения молекул на основе металла с мощными антираковыми свойствами. Как многоэлементная техника, SR-XRF3 с нанозондом обеспечивает способ одновременной количественной оценки и локализации внутриклеточных наиболее биологически важных элементов, включая фосфор, серу, калий, кальций, железо, медь и цинк. Действительно, использование жестких рентгеновских лучей обеспечивает большую глубину проникновения для изображения целых замороженных гидратированных клеток в без этикетки моды. Кроме того, обеспечивая доступ к K-край большинства элементов, представляющих интерес, рентгеновская флуоресценция возбуждается наиболее эффективно. Использование криогенных подходов позволяет снизить радиационный ущерб и оптимизировать сохранение клеточной структуры и элементарное распределение.
Наиболее доступные пространственно решенные аналитические методы для изучения металлов в клетках являются поверхностными методами, требующими очень тонких и плоских участков клеток, которые должны быть произведены. Это в основном включает в себя сканирование передачи электронной микроскопии с энергетически-дисперсивным рентгеновским анализом (STEM-EDX), энергетической электронной микроскопией передачи (EF-TEM) и наномасштабной вторичной ионной масс-спектрометрией (nanoSIMS). Последние не могут быть выполнены на замороженных, гидратированных секциях клеток, в то время как крио-анализ может быть сделано с электронной микроскопией с непревзойденным пространственным разрешением, но плохой чувствительностью элемента. Рентгеновское излучение, вызванное частицами (PIXE), позволило изучить элементарные распределения в целых клетках. Он имеет то преимущество, что полностью количественный с справедливой чувствительности элементарной в микрон масштабе и даже в субмикрон резолюции4, но страдает от радиационного повреждения и отсутствие криогенных возможностей для изучения замороженных гидратированных клеток. Все эти аналитические методы дополняют друг друга в элементарной визуализации клеток, но для всех методов процедура подготовки образца является важным шагом. Она должна быть простой, чтобы ограничить возможное загрязнение, а также элементарное перераспределение и / или утечки для получения значимых результатов. Как показано в электронной микроскопии, криогенный рабочий процесс, включая криоиммобилизацию клетки и криотрансфер к криосканирующей стадии, позволяет оптимально еле-элементарно сохранять на субклеточных уровнях как можно ближе к родному государству5,6,7,8,9,10. Это понимание было успешно реализовано в разработке синхротронной крио-мягкой рентгеновской микроскопии (например, полное поле микроскопов и сканирующие микроскопы) для получения ультраструктурных изображений целых замороженных гидратированных клеток в 2D или 3D. Различные криогенные рабочие процессы были разработаны11 для мягких рентгеновских микроскопов на Beamline 2.1 (XM-2) из Расширенный источник света в Лоуренс Беркли Национальная лаборатория12, луч U41-XM на электронном хранении кольцо BESSY II (Германия)13, луч MISTRAL источника света ALBA (Испания)14, и на балке B24 из Алмазныйисточник. Аналогичный рабочий процесс был недавно показан как самый надежный метод подготовки и сохранения для внутриклеточного элементарного анализа с использованием рентгеновских микрозондов16,17.
Хотя методы рентгеновского нанозонда начинают широко использоваться для клеточного элементарного анализа, особенно с появлением криогенных возможностей SR-XRF, до сих пор ни один пошаговый протокол не был распространен среди научно-исследовательского сообщества. Здесь предусмотрена подробная процедура подготовки криофиксированных клеток адептов, культивируемых в качестве монослойных на кремниевых нитридных мембранах, которые будут анализироваться в криогенных условиях. После протокола следует применить шаг замораживания для сушки, если рентгеновский анализ должен быть выполнен при комнатной температуре. В то время как предлагаемый протокол был успешно использован с человеческими раковыми клетками молочной железы MD-MB-2312 и замораживание сушки было продемонстрировано среди других на нейронах мыши18,20,21, он может быть легко распространен на различные типы клеток человека или животных.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

О распределении ионов металла на субклеточном уровне известно очень мало. Тем не менее, эти химические элементы имеют основные регулятивные функции и их нарушенный гомеостаз участвует в различных заболеваниях. Современные синхротронные рентгеновские флуоресценционные нанозонды обеспечивают необходимую чувствительность и пространственное разрешение для выяснения двумерного (2D) и трехмерного (3D) распределения и концентрации металлов внутри целых клеток в уровень органеллы. Это открывает новые захватывающие научные области исследования о роли металлов в физиопатологии клетки. Клеточная подготовка является ключевой и часто сложной процедурой, особенно для базового анализа. Хотя методы рентгеновской флуоресценции в настоящее время широко распространены и различные методы подготовки были использованы, очень немногие исследования исследовали сохранение элементарного содержания клеток в лучшем случае, и не пошаговая подробный протокол для криоподготовки Адепт клетки для рентгеновских флуоресценции нанозондов был освобожден до сих пор. Это описание протокола, который обеспечивает пошаговую клеточную подготовку к быстрой криофиксации, чтобы синхротронный рентгеновский флуоресценция нано-анализа клеток в замороженном гидратированных состоянии, когда криогенной среды и передачи доступна. В случае, если нано-анализ должен быть выполнен при комнатной температуре, предусмотрена дополнительная процедура замораживания сушки крионфиксированного адепта клеточного препарата. Предлагаемые протоколы были успешно использованы в предыдущих работах, в последнее время в изучении 2D и 3D внутриклеточного распределения органометаллического соединения в клетках рака молочной железы.

Типичный оптический видеомикроскоп зрения замороженных гидратированных MDA-MB-231 клеток, которые были суб-культуры на поли-L-лизина покрытием Si3N4 мембранной поддержки показано на рисунке 7A. Оптический вид образца в вакуумной камере был получен в режиме отражения с помощью специального онлайн-видеомикроскопа луча ID16A ESRF22. В то время как электронная или мягкая рентгеновская микроскопия требует, чтобы слой льда, встраивающий клетку, был как можно более тонким (обычно ,lt;0.5 мкм), твердые рентгеновские лучи (Зgt;10 keV) имеют преимущество гораздо более высокой глубины проникновения и более низкой дозы осаждения. Толщина льда может быть больше, как правило, lt;10 мкм, включая ячейку, так что лед встраивания ячейки в несколько мкм в толщину. Это можно оценить через измеренную интенсивность рентгеновского снимка в передаче по сравнению с интенсивностью без образца, принимая во внимание поглощение 500 нм толщиной Si3N4 мембраны. Эта толщина льда может быть достигнута с помощью ручного промотирования, как описано в настоящем протоколе. В области колец Ньютона толщина льда может быть еще тоньше (не измеряется).
Рентгеновское флуоресценцию элементарного картирования замороженных гидратированных клеток показано на рисунке 7B с репрезентативным распределением физиологических элементов, таких как калий (K), сера (S) и цинк (N). Эти карты представляют собой элементарную ареальную массу (т.е. элементарной прогнозируемой массой). Хотя в данном случае такие карты не сделаны, такие карты могут быть нормализованы с помощью рентгеновской фазовой контрастной визуализации, которая обеспечивает оценку прогнозируемой массы образца23. Как сообщалось во многих исследованиях, высоко рассеянный Ион K в клетках, сохранившихся в их почти родном государстве, как предполагалось, однородно распространен по всей ячейке23,24,16. Как показано на 2D рентгеновской флуоресценции элементарных изображений на рисунке 7B, плотно связаны элемент S равномерно распределены в ячейке, подобно K, и представляет собой хорошую оценку профиля клеточной массы. Распределение В н имело более высокий сигнал в ядре, чем в цитозоле, и четко обозначило ядро. Можно отметить, что небольшие обогащенные зоны могут быть обнаружены при пространственном разрешении (50 нм) в ядерном регионе.
Существующие рентгеновские нанозонды или те, которые будут построены, не обязательно вмещают криогенные возможности. В этом случае лучшей альтернативой для получения рентгеновских флуоресценции клеток при пространственных разрешениях суб-100 нм является выполнение процедуры замораживания, описанной в этом протоколе после замораживания клетки. Рисунок 8А показывает типичный яркий вид полевой микроскопии резонирующего лиофилизированного первичного мышигиппокампа нейронов, непосредственно культивируемого на мембране Si3N4. В этом случае, если они хранятся в чистой высохлой камере, образцы можно подготовить за 1–2 недели и наблюдать с помощью обычного вертикального оптического микроскопа для регистрации интересуемых регионов. Следует позаботиться о том, чтобы предотвратить воздействие окружающей влажности, поскольку она может быть захвачена лиофилизированным образцом и привести к повреждению под рентгеновским нанолучьем. Эта процедура была успешно применена к очень чувствительным клеткам (т.е. нейронные клетки) и даже лучшие результаты были получены с другими более надежными типами клеток, таких как раковые клетки. Что касается замороженных клеток, рентгеновские флуоресценции изображения K, S, и Зн на весь лиофилизированный дисплей клетки похожи на те, описанные выше. Они являются репрезентативными для элементарных дистрибутивов, которые можно найти в различных типах лиофилизированных ячеек с пространственным разрешением 50–100 нм. В то время как замораживание сушки целые клетки является альтернативой для сохранения элементарной целостности, это за счет идеального сохранения морфологии клеток16, особенно клеточных мембран.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> Рисунок 1: Типичная поддержка образца рентгеновского флуоресценции наноанализа. Мембрана Si3N4 в защитной капсуле. Этот тип субстрата может быть использован как для анализа комнатной температуры (погружение-заморозка клеточной подготовки с последующим низкой температурой и низким вакуумным процессом замораживания сушки), так и для криогенного рентгеновского анализа флуоресценции. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> Рисунок 2: Схематический вид окон нитрида кремния после посева клеток. Клетки культивируются непосредственно на поли-L-лизина покрытием плоская поверхность Si3N4 мембраны поддержки. Иногда пузырьки воздуха могут быть пойманы в ловушку в задней полости мембранной поддержки Si3N4 и должны быть удалены, как описано в протоколе. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> Рисунок 3: В доме разработан 3D печатных крио-бокс для долгосрочного хранения окунуться замороженных Si3N4 мембраны поддерживает в жидком азоте Dewar. (A) Крио-коробка разобрана с контейнером и крышками (нижняя часть) и (B) собранная крио-коробка с locked крышками. Крышки можно манипулировать с пинцетом, открытие или блокировки путем вращения. Подробный план 3D-печати доступен по запросу ESRF ID16A. Конструкция была сделана для размещения кремниевых нитрида TEM сетки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> Рисунок 4: Blotting клеток культивируется на Si3N4. Перед погружением-замораживания монослой клетки культивируется на Si3N4 мембраны необходимо промыть в раствора ацетата аммония ()и тщательно вручную смыты с помощью фильтровальной бумаги (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> Рисунок 5: Автоматическая машина EM-GP. (A) Автоматический морозильник погружения. (B) Экологическая камера с пинцетом заблокирован дюйма (C) этан чашка покрыта Leica сжижения подключен к бутылке этана. (D) Погружение замораживания корпуса с указанием черная чашка полна сжиженного этана и крио-бокс для дальнейшего хранения в LN2 из vitrified Si3N4 мембран. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> Рисунок 6: Образец криотрансферной сборки для процедуры замораживания сушки. ()Первый получатель латуни для Si3N4 мембраны устанавливается на верхней части держателя передачи образца, предоставляемых поставщиком замораживания сушилки. (B)и (C) показывают, что второй плоский латунный диск используется в качестве крышки и действует как холодная ловушка корпуса, которые будут вставлены в вакуумный корпус замораживания сушилки. (D) Полная сборка с пружинно-загруженным штангой передачи. (E) Держатель образца, несущий витрифицированный клеточный препарат, выращенный на мембране Si3N4, должен быть дополнительно вставлен в lN 2-охлажденный сушилку для замораживания. Все шаги для монтажа сборки выполняются в LN2 в пенополистирола поле. Для ясности, все изображения были произведены в отсутствие LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> Рисунок 7: Крио-рентгеновская флуоресценция изображения замороженной гидратасной клетки с помощью жесткого рентгеновского нанозонда. (A) Типичный онлайн-вид в режиме отражения с использованием специального оптического видео микроскопа луча ESRF ID16A. После ручного промотирования была достигнута общая толщина льда в размере около 5,10 мкм, что позволяет четко увидеть замороженные гидратированные клетки. Область с кольцами Ньютона, свидетельствующая о еще более тонком льду, заметна. (B) Представитель крио-рентгеновской флуоресценции клеточных распределения физиологических элементов калия (K), серы (S), и цинка (N). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> Рисунок 8: Рентгеновские флуоресценции изображения лиофилизированной нейронной клетки с использованием жесткого рентгеновского нанозонда. (A) Типичный вид яркой полевой микроскопии резонирующего лиофилизированного первичных корковых нейронных клеток, непосредственно культивированных на мембрану Si3N4. Шкала бар 200 мкм (B) Представитель комнатной температуры рентгеновской флуоресценции изображения одного лиофилизированного гиппокампа нейрон, показывающий распределение физиологических элементов калия (K), серы (S), и цинка (N). Шкала бар 2 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Здесь представлен протокол для клеточной культуры на кремниевых нитридных мембранах и замораживания до рентгеновской флуоресценции с синхротронным криогенным рентгеновским нанозондом. При наличии только наноанализа комнатной температуры замороженные образцы можно дополнительно высушить. Это критические шаги для получения информации о внутриклеточной элементарной композиции.

Клеточная культура на силиконовых нитридных мембранах и криопрепарат для синхротронного рентгеновского флуоресценции Нано-анализа

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Недавно разработанные синхротронные рентгеновские флуоресценции нано-зонды позволяют визуализировать элементарное распределение образца. Использование криогенных подходов является обязательным для замедления рентгеновских повреждений излучения. Таким образом, быстрая криофиксация необходима для получения замороженных гидратированных клеток для оптимизации сохранения структуры клетки и ее химической целостности.Специфика клеточных препаратов для синхротронных исследований приводит к оптимизации этого протокола для приобретения замороженных гидратированных монослой клеток. Визуальная демонстрация важна для понимания того, как манипулировать образцами монослойных клеток для достижения воспроизводимо криофиксированных клеток, встроенных в тонкий слой льда. Чтобы подготовить поддержку мембраны нитрида кремния, откройте капсулу, содержащую мембранную поддержку, и аккуратно сожмите капсулу, чтобы слегка ослабить поддержку.Используйте тонкие пинцеты, чтобы схватить один угол кремниевой рамы, заботясь, чтобы не коснуться кремниевой нитридной мембраны в центре рамы и поместить рамку в нераскрытую чашку Петри в шкафу ламинарного потока. Затем УФ стерилизовать мембрану в течение 25 до 30 минут. В конце стерилизации добавьте 10 микролитров фактора крепления, таких как поли-L-лизин.Инкубировать в течение 25 минут при 37 градусах по Цельсию и при 5%углекислом газе с влажностью. Затем заполните колодцы стерильной 48-колодец пластины с 200 до 250 микролитров 0,22 микрометра фильтруется ультра чистой и ультра след воды на скважину. Используйте тонкие пинцеты, чтобы тщательно погрузить мембрану вертикально с тремя последовательными 10-секундные полоскания в одном колодец воды.После полоскания поместите мембрану вертикально в пустой колодец стерильной пластины 96-хорошо под капотом ламинарного потока и оставьте его на ночь до высыхания. Для посева клеток, представляющих интерес, поместите покрытие мембраны с плоской стороны лицом вверх в один колодец стерильной четырех-хорошо пластины. Добавьте пять раз 10 к четырем клеткам в 10 микролитров соответствующей культурной среды к поверхности мембраны нитрида кремния, не касаясь мембраны.Капля должна покрывать всю мембрану. Затем культуры клеток на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с влажностью. Когда клетки начали прикрепляться к субстрату, медленно добавляйте один миллилитр полной культуры среды вниз по стене каждого хорошо, покрывая каждую мембрану.Затем культуры клеток на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с влажностью. Для криоиммобилизации клеточной подготовки, сначала включите автоматический морозильник погружения и заполнить соответствующее количество скважин в 12-хорошо пластиковой пластины с 37 градусов по Цельсию ацетат буфера. Непосредственно перед полоскать и окунуться замораживания мембраны, удалить образец из инкубатора и использовать черный зажим кольцо пары быстрого выпуска пинцета, чтобы разблокировать пинцет.Используйте разблокированный пинцет, чтобы схватить мембранную поддержку и погрузить мембрану вертикально в буферный раствор ацетата аммония в течение примерно пяти секунд. Чтобы удалить излишки буфера, нажмите нижнюю часть мембранной поддержки на фильтровальную бумагу и промокните каждую сторону кадра на фильтровальную бумагу, не позволяя мембране прикоснуться к бумаге. Когда избыточный буфер был удален, откройте дверь экологической камеры, быстро сдвиньте пинцет в типс блокировки, и закрыть дверь камеры.Пресс пятно окунуться. Пинцет, держащий кремниевую нитридную мембрану, будет быстро погружен в криоген. После погружения замораживания снимите крышку контейнера с предварительно охлажденными типсами и нажмите передачу.Силиконовая нитридная мембрана будет перемещена немного выше криогена. В быстром одном движении, слайд и слегка наклонить пинцет из типса блокировки довести пинцет непосредственно в пустой слот криокам в контейнере передачи заполнены азотной жидкостью. Затем отпустите черное кольцо зажима, чтобы освободить мембрану.Для замораживания сушки замороженных клеток используйте выключатель рокера, расположенный на задней панели инструмента замораживания сушки, для питания прибора. Дисплей будет отображаться нажмите введите, когда готовы к загрузке образца. Намонтировать держатель латуни нитридной мембраны кремния поверх держателя передачи образца, предоставленного поставщиком в контейнере для хранения полистирола, сохраняя уровень жидкого азота примерно на один-два миллиметра ниже верхнего края первого латунного куска.Поместите мембрану с стороны образца клетки лицом вверх в латуни держатель пронумеровав полость и предварительно охладить передачи стержня в жидком азоте заполненные полистирол пены поле. Используйте стержень, чтобы зафиксировать полную сборку, нажмите введите, чтобы сломать вакуум, чтобы освободить крышку камеры сушилки замораживания, немедленно передать образец в камеру сушилки замораживания, и закрыть крышку камеры сушилки замораживания. Затем немедленно нажмите начать продолжать цикл замораживания сушки.В конце цикла замораживания сушки нажмите стоп, чтобы выпустить камеру и удалить полную сборку, чтобы получить доступ к лиофилизированным образцам. Здесь типичный оптический видео микроскоп зрения замороженных гидратированных клеток рака молочной железы линии клеток субкультуры на поли-L-лизин покрытием кремния нитрид мембраны поддержки, как показано на фото. Рентгеновское флуоресцентное элементарное картирование замороженных гидратированных клеток показывает распределение физиологических элементов, таких как калий, сера и цинк.В этом репрезентативном примере плотно связанный элемент серы равномерно распределялся внутри клетки по аналогичной схеме, наблюдаемой для калия, и представляет собой хорошую оценку профиля клеточной массы. Распределение цинка, однако, продемонстрировали более высокий сигнал в ядре, чем в цитозоле с четко определенным разделением сигнала между цитозолом и ядром. В этой типичной Брайтфилд микроскопии зрения лиофилизированных первичных гиппокампа нейронов мыши непосредственно культурируется на кремниевой нитридной мембраны, как попродемонстрировано, клетки демонстрируют типичные нейронной морфологии, которая не зависит от их культуры или сохранения метода.Рентгеновская флуоресценция изображения окунуться замороженных клеток также показывает типичные элементарные распределения, как выставлены эти представительные лиофилизированных клеток на 50 до 100 нанометров пространственного разрешения. Построение кремниевого нитридного окна имеет решающее значение для получения тончайшего ледяного слоя клеток после погружения замораживания. Сохранение химической целостности клеток на субклеточном уровне позволяет исследовать металлом клеток с помощью синхротронных нано-зондов, а также с помощью других микроаналитических методов.Поскольку не все синхротронные нано-зонды анализ может быть выполнен при криогенной температуре, замороженные гидратированные клетки могут быть дополнительно лиофилизированных для облегчения их анализа при комнатной температуре. Не забудьте использовать соответствующее средства индивидуальной защиты при работе с жидким азотом и всегда использовать этотн газа в дымовой капот от пламени.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Интернет эксклюзионной и ионообменной хроматографии на МУРР пучкового

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Структурные исследования атомной шкале макромолекулярных сборок, твердотельного ЯМР спектроскопии

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Сочетая рентгеноструктурного анализа с малоуглового рентгеновского рассеяния для моделирования неструктурированных регионов Nsa1 от S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Структурные исследования макромолекул в решения с помощью небольшой угол рентгеновского рассеяния

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Рентгеновская кристаллография для изучения олигомерского государства Переход Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Флуоресцентные измерения обмена фосфатидилсерина/фосфатидилинозитола 4-фосфата между мембранами

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Сбор последовательных данных с фиксированной целью на алмазном источнике света

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...