Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Los experimentos en la línea de haz de nanoimagen ID16A se realizaron en el marco de las propuestas de ESRF LS2430, LS2303 y LS2765.

<ol>
	<li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage/genotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors.">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li><li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging.">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li><li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , (2000).</li><li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity,+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions,+and+down+regulation+of+MAO-B.">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li><li>Leapman, R. 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Los autores no tienen conflictos de intereses.

La microscopía crioelectrónica (crio-EM) ganó el Premio Nobel de Química 2017 y como tal el desarrollo realizado por J. Dubochet sobre la vitrificación de material biológico para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas en la solución25. Como informó Dubochet en su conferencia del Nobel "Saber cómo vitrificar una gota de agua es una cosa, preparar una muestra biológica para la observación biológica es otra"25. Los pasos de criopreparación ahora se consideran la técnica estándar para mitigar el daño de la dosis de radiación y estudiar las células cerca de su estado nativo. Sin embargo, la preparación sigue siendo tediosa. Esto se debe a que la microscopía electrónica, debido a su resolución espacial insuperable, es sensible a cualquier artefacto ultraestructural que se produce durante la preparación de la muestra. Los crionanos de sincrotrón se están acercando ahora a dificultades similares que bajan a resoluciones espaciales tan bajas como 13 nm en el rango de rayos X de alta energía26. La microscopía de rayos X dura puede analizar células enteras, mientras que la microscopía electrónica sufre de la poca profundidad de penetración de los electrones, lo que permite observar solo rebanadas de células muy delgadas.
Las monocapas de células son lo suficientemente delgadas como para que al congelarse por inmersión en el etano líquido, se alcancen las tasas de enfriamiento necesarias para la vitrificación del agua. En teoría, las tasas de enfriamiento tan altas como 108 K/s son posibles utilizando la congelación de alta presión27 que permite la vitrificación de muestras demasiado gruesas para la congelación por inmersión. Una velocidad de enfriamiento de 105 K/s, necesaria para permitir la vitrificación completa de la muestra a presión ambiente28,se alcanza reproduciblemente utilizando la máquina de congelación automática y los parámetros presentados aquí. Esto permite a un investigador vitrificar muestras biológicas delgadas (<10 m) como una monocapa de células12,13,14,15,29,30 por congelación por inmersión en etano líquido.
Un desafío importante con este protocolo es también preservar en la medida de lo posible la integridad química del contenido intracelular para proporcionar distribuciones elementales confiables dentro de la célula en 2D o 3D. Como se publicó en otros lugares2,16,17,31, en el caso de la toma de imágenes elementales a nivel subcelular, se debe considerar el análisis de las células hidratadas congeladas. De lo contrario, la combinación de congelación por inmersión y secado por congelación de células se puede utilizar para el análisis de la temperatura ambiente. Para este último, el hielo amorfo se elimina a través del proceso de sublimación, mientras que las moléculas de agua enlazadas se eliminan a través del proceso de desorción. Este proceso puede estar lejos de ser ideal en comparación con las muestras hidratadas congeladas debido a la posible alteración de las membranas celulares y la morfología de algunas estructuras subcelulares32. Además, para estudios de especiación, la extracción de agua puede conducir a artefactos de especiación de metal. Aún así, ha tenido éxito y la mejor alternativa a las muestrashidratadas congeladas para imágenes elementales en niveles sub-100 nm2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Como se ha informado37, la calidad de las preparaciones celulares crioconservadas se puede evaluar a través de la relación potasio-sodio K / Na. Desafortunadamente, todavía no se puede determinar con la nanosonda de rayos X dura utilizada aquí, debido al corte de baja energía del detector de deriva de silicio utilizado para detectar los fotones de fluorescencia de rayos X de los elementos (E 1.3 keV magnesio). De hecho, una alta relación K/Na (>10) que se puede medir utilizando TOF-SIMS, EPMA o microsonda nuclear PIXE16,37 es indicativo de la integridad química preservada de la célula en comparación con el K/Na esperado de 25 en una celda viva37. Esto puede ser apoyado por una relación cl/K baja concomitante38. Sin embargo, la vitrificación imperfecta, especialmente si la velocidad de enfriamiento de la muestra es demasiado baja, puede conducir a la formación de grandes cristales de hielo que pueden dañar las membranas celulares y los orgánulos, alterando en consecuencia la distribución de elementos químicos. Aunque no existe un procedimiento rutinario para monitorear este daño potencial e impacto en la distribución intracelular, las proporciones elementales anteriores y la posibilidad de tomar imágenes de la célula a alta resolución utilizando contraste de fase de rayos X o microscopía de rayos X crioblanda pueden ser los mejores enfoques para apoyar una buena preservación de los compartimentos intracelulares con preservación concomitante de la integridad elemental. La combinación de estas técnicas y el uso de microscopios ópticos de fluorescencia criocorrelativa recientemente desarrollados ayudarán a evaluar en qué medida se produce este daño y afecta a la distribución elemental intracelular.
En general, se presenta un protocolo detallado y completo para preparar muestras celulares para el nanoanálisis de fluorescencia de rayos X de sincrotrón. Es un buen punto de partida para la comunidad de investigación, ayudando a resolver el difícil problema de cómo preparar muestras celulares apropiadas para imágenes elementales 2D y 3D en nanosondas de rayos X duros (crio). Estos enfoques se pueden combinar con capacidades de fluorescencia óptica y microscopía electrónica para imágenes químicas y estructurales correlativas en profundidad de las células.

Las nanosondas de fluorescencia de rayos X de sincrotrón (SR-XRF) de nuevo diseño permiten la visualización de la distribución subcelular de los elementos de una manera totalmente cuantitativa. Como ejemplo, esta capacidad analítica permite investigar la ingesta de nanopartículas1 o moléculas organometálicas como los complejos basados en osmio2,proporcionando información sobre la ingesta intracelular de moléculas basadas en metal es con potentes propiedades anticancerígenas. Como técnica multielemento, SR-XRF3 con nanosonda proporciona simultáneamente una manera de cuantificar y localizar simultáneamente los elementos intracelularmente más importantes biológicamente, incluyendo fósforo, azufre, potasio, calcio, hierro, cobre y zinc. De hecho, el uso de rayos X duros proporciona una gran profundidad de penetración para crear imágenes de células enteras hidratadas congeladas de una manera libre de etiquetas. Además, al proporcionar acceso al borde K de la mayoría de los elementos de interés, la fluorescencia de rayos X se excita de la manera más eficiente. El uso de enfoques criogénicos permite la reducción del daño por radiación y la optimización de la preservación de la estructura celular y la distribución elemental.
La mayoría de las técnicas analíticas resueltas espacialmente disponibles para estudiar metales en células son técnicas superficiales que requieren secciones muy delgadas y planas de las células que se van a producir. Esto abarca principalmente la microscopía electrónica de transmisión de escaneo con análisis de rayos X de dispersión de energía (STEM-EDX), microscopía electrónica de transmisión filtrada por energía (EF-TEM) y espectrometría de masas ióncasecundaria a nanoescala (nanoSIMS). Esto último no se puede realizar en secciones celulares congeladas e hidratadas, mientras que el crioanálisis se puede hacer con microscopía electrónica con una resolución espacial insuperable pero poca sensibilidad elemental. La emisión de rayos X inducida por partículas (PIXE) ha permitido el estudio de distribuciones elementales en células enteras. Tiene la ventaja de ser totalmente cuantitativo con una sensibilidad elemental justa a escala de micras e incluso en la resolución submicras4,pero sufre de daño por radiación y falta de capacidades criogénicas para estudiar células hidratadas congeladas. Todas estas técnicas analíticas se complementan entre sí en la toma de imágenes elementales de las células, pero para todas las técnicas el procedimiento de preparación de la muestra es un paso crucial. Debe mantenerse simple de limitar la posible contaminación, así como la redistribución elemental y / o fugas para obtener resultados significativos. Como se demuestra en la microscopía electrónica, un flujo de trabajo criogénico, incluyendo crio-inmovilización de la célula y criotransferencia a una etapa crioescaneada, permite una preservación elemental óptima a niveles subcelulares lo más cercanos posible al estado nativo5,6,7,8,9,10. Esta comprensión se ha implementado con éxito en el desarrollo de la microscopía de rayos X crio-blando sincrotrón (por ejemplo, microscopios de campo completo y microscopios de exploración) para producir imágenes ultraestructurales de células enteras hidratadas congeladas en 2D o 3D. Varios flujos de trabajo criogénicos fueron desarrollados11 para microscopios de rayos X blandos en Beamline 2.1 (XM-2) de la Fuente de Luz Avanzada en el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley12, haz lensia U41-XM en el anillo de almacenamiento de electrones BESSY II (Alemania)13, haz línea MISTRAL de la fuente de luz ALBA (España)14,y en Beamline B24 de la fuente de luz Diamond15,entre otros. Recientemente se demostró que un flujo de trabajo similar era el método de preparación y conservación más fiable para el análisis elemental intracelular utilizando microsondas de rayos X16,17.
Aunque las técnicas de nanosonda de rayos X están empezando a ser ampliamente utilizadas para el análisis elemental celular, particularmente con la llegada de las capacidades criogénicas SR-XRF, no se ha difundido ningún protocolo escalonado hasta ahora a la comunidad de investigación. Aquí, se proporciona un procedimiento detallado para preparar células adherentes criofijadas cultivadas como monocapas en membranas de nitruro de silicio para ser analizadas en condiciones criogénicas. También se proporciona un paso de secado por congelación después del protocolo en caso de que el análisis de rayos X se realice a temperatura ambiente. Mientras que el protocolo propuesto se ha utilizado con éxito con las células de cáncer de mama humano MD-MB-2312 y el secado por congelación se demostró entre otros en las neuronas de ratón18,20,21, se puede extender fácilmente a varios tipos de células humanas o animales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

Se sabe muy poco sobre la distribución de iones metálicos a nivel subcelular. Sin embargo, esos elementos químicos tienen funciones reguladoras esenciales y su homeostasis perturbada está involucrada en diversas enfermedades. Las nanosondas de fluorescencia de rayos X de sincrotrón de última generación proporcionan la sensibilidad y la resolución espacial necesarias para dilucidar la distribución y concentración bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) de metales dentro de células enteras en la distribución y concentración bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) de metales dentro de células enteras en la distribución y concentración bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) dentro de células enteras en la distribución y concentración bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) de metales dentro de células enteras en la distribución y concentración bidimensional (2D) y tridimensional (3D) de metal nivel de organelo. Esto abre nuevos y emocionantes campos científicos de investigación sobre el papel de los metales en la fisiopatología de la célula. La preparación celular es un procedimiento clave y a menudo complejo, particularmente para el análisis básico. Aunque las técnicas de fluorescencia de rayos X están ahora generalizadas y se han utilizado varios métodos de preparación, muy pocos estudios han investigado la preservación del contenido elemental de las células en el mejor de los casos, y no hay un protocolo detallado escalonado para la criopreparación de hasta ahora se han liberado células adherentes para nanosondas de fluorescencia de rayos X. Esta es una descripción de un protocolo que proporciona la preparación celular escalonada para la criofixación rápida para permitir el nanoanálisis de fluorescencia de rayos X sincrotrón de células en un estado hidratado congelado cuando un entorno criogénico y la transferencia está disponible. En caso de que el nanoanálisis tenga que realizarse a temperatura ambiente, se proporciona un procedimiento adicional para el secado por congelación de la preparación celular adhesiva adherente criofija. Los protocolos propuestos se han utilizado con éxito en trabajos anteriores, más recientemente en el estudio de la distribución intracelular 2D y 3D de un compuesto organometálico en células de cáncer de mama.

En la Figura 7Ase muestra una vista típica del microscopio de vídeo óptico de células MDA-MB-231 hidratadas congeladas que fueron subcultivadas en un soporte de membrana Si3N4 recubierto de poli-L-lisina. La vista óptica de la muestra en la cámara de vacío se obtuvo en modo de reflexión utilizando el microscopio de vídeo en línea dedicado de la línea de haz ID16A de la ESRF22. Mientras que la microscopía de rayos X blanda o electrónica requiere que la capa de hielo que incrusta la célula sea lo más delgada posible (normalmente <0,5 m), los rayos X duros (>10 keV) tienen la ventaja de una profundidad de penetración mucho mayor y una deposición de dosis más baja. Por lo tanto, el espesor del hielo puede ser más grande, normalmente <10 m incluyendo la célula para que el hielo que incrusta la célula sea de unos pocos m de espesor. Esto se puede estimar a través de la intensidad de rayos X medida en la transmisión en comparación con la intensidad sin la muestra, teniendo en cuenta la absorción de la membrana de 500 nm de espesor Si3N4. Este espesor de hielo se puede lograr a través de la hincha manual como se describe en el protocolo actual. En la región de los anillos de Newton, el espesor del hielo puede ser aún más delgado (no medido).
El mapeo elemental de fluorescencia de rayos X de la célula hidratada congelada se muestra en la Figura 7B con las distribuciones representativas de elementos fisiológicos como potasio (K), azufre (S) y zinc (Zn). Estos mapas representan la masa areal elemental (es decir, la masa proyectada elemental). Aunque no se hace en el presente caso, dichos mapas pueden normalizarse mediante imágenes de contraste de fase basadas en la propagación de rayos X que proporcionan la estimación de la masa proyectada de la muestra23. Como se informó en muchos estudios, se supone que el ion K altamente difusible en células conservadas en su estado casi nativo se distribuyó homogéneamente a lo largo de toda la celda23,24,16. Como se muestra en las imágenes elementales de fluorescencia de rayos X 2D en la Figura 7B, el elemento firmemente unido S se distribuyó uniformemente dentro de la célula, de forma similar a K, y representa una buena estimación del perfil de masa celular. La distribución Zn tenía una señal más alta en el núcleo que en el citosol y delineó claramente el núcleo. Cabe señalar que las pequeñas regiones enriquecidas con Zn se pueden detectar en la resolución espacial (50 nm) en la región nuclear.
Las nanosondas de rayos X existentes o las que se van a construir no se adaptan necesariamente a las capacidades criogénicas. En este caso, la mejor alternativa para obtener imágenes de fluorescencia de rayos X de células a resoluciones espaciales inferiores a 100 nm es realizar un procedimiento de secado por congelación descrito en este protocolo después de la congelación por inmersión de la célula. La Figura 8A muestra una vista típica de la microscopía de campo brillante de las neuronas del hipocampo primario salinadas con liofilidad resultantes cultivadas directamente en la membrana Si3N4. En este caso, si se almacenan en una cámara limpia desecada, las muestras se pueden preparar con 1 a 2 semanas de antelación y se observan con un microscopio óptico vertical ordinario para el registro de las regiones de interés. Se debe tener cuidado para evitar la exposición a la humedad ambiental, ya que puede ser capturada por la muestra liofilizada y provocar daños bajo el nanohaz de rayos X. Este procedimiento se aplicó con éxito a células muy sensibles (es decir, células neuronales) e incluso mejores resultados se obtuvieron con otros tipos más robustos de células, como las células cancerosas. En cuanto a las células congeladas, las imágenes de fluorescencia de rayos X de K, S y Zn en toda la pantalla de células liofilizadas son similares a las descritas anteriormente. Son representativos de las distribuciones elementales que se encuentran en varios tipos de células liofilizadas a una resolución espacial de 50 a 100 nm. Mientras que el secado por congelación de células enteras es una alternativa para preservar la integridad elemental, es a expensas de una preservación perfecta de la morfología celular16,particularmente las membranas celulares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> Figura 1: Soporte típico de la muestra para el nanoanálisis de fluorescencia de rayos X. Un soporte de membrana Si3N4 en su cápsula protectora. Este tipo de sustrato se puede utilizar tanto para el análisis de la temperatura ambiente (preparación celular de congelación de inmersión seguida de baja temperatura y proceso de secado por congelación al vacío bajo) o para el análisis de fluorescencia criogénica de rayos X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> Figura 2: Vista esquemática de las ventanas de nitruro de silicio después de la sembración celular. Las células se cultivan directamente sobre la superficie plana recubierta de poli-L-lisina del soporte de membrana Si3N4. A veces las burbujas de aire pueden quedar atrapadas en la cavidad posterior del soporte de membrana Si3N4 y tienen que ser removidas como se describe en el protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> Figura 3: La criocaja impresa en 3D desarrollada internamente para el almacenamiento a largo plazo de soportes de membrana Si3N4 congelados por inmersión en nitrógeno líquido Dewar. (A) Cryo-box desmontado con el recipiente y las tapas (parte inferior) y (B) la crio-caja montada con tapas bloqueadas. Las tapas se pueden manipular con las pinzas, abriendo o bloqueando por rotación. Un plan detallado para la impresión 3D está disponible a petición de ESRF ID16A. El diseño se ha realizado para acomodar rejillas TEM de nitruro de silicio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> Figura 4: Manchadeo de células cultivadas en Si3N4. Antes de congelar la célula monocapa cultivada en una membrana Si3N4 debe enjuagarse en solución de acetato de amonio (A) y se borró cuidadosamente manualmente con papel de filtro (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> Figura 5: Máquina automática EM-GP de congelación por inmersión. (A) El congelador de inmersión automático. (B) Cámara ambiental con las pinzas fijadas. (C) La copa de etano cubierta con el licuador Leica conectado a una botella de etano. (D) El gabinete de congelación por inmersión que muestra la copa negra llena de etano licuado y la crio-caja para su posterior almacenamiento en LN2 de las membranas Vitrificadas Si3N4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> Figura 6: Conjunto de criotransferencia de muestra para procedimiento de secado por congelación. (A) El primer recipiente de latón para membranas Si3N4 está montado encima del soporte de transferencia de muestra proporcionado por el proveedor de secadores de congelación. (B) y (C) muestran que el segundo disco de latón plano se utiliza como cubierta y actúa como una carcasa de trampa fría que se insertará en la carcasa de vacío del secador de congelación. (D) El conjunto completo con la varilla de transferencia con resorte. (E) El portamuestras que lleve la preparación celular vitrificada cultivada en la membrana Si3N4 debe insertarse en el secador de congelación refrigerado LN2. Todos los pasos para montar el montaje se realizan en LN2 en una caja de espuma de poliestireno. Para mayor claridad, todas las imágenes se produjeron en ausencia de LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> Figura 7: Imágenes de fluorescencia de rayos X crio-X de una célula hidratada congelada utilizando nanosonda de rayos X duros. (A) Vista en línea típica en modo de reflexión utilizando el microscopio de vídeo óptico dedicado de la línea de haz ESRF ID16A. Después de la hincha manual, se logró un espesor total de hielo de aproximadamente 5 x 10 m que permite una visión clara de las células hidratadas congeladas. Una región con anillos Newton indicativos de hielo aún mucho más delgado es notable. (B) Distribuciones celulares representativas de la fluorescencia crio-X-rayo de los elementos fisiológicos potasio (K), azufre (S) y zinc (Zn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> Figura 8: Imágenes de fluorescencia de rayos X de una célula neuronal liofilizada utilizando nanosonda de rayos X duros. (A) Vista típica de la microscopía de campo brillante de las células neuronales corticales primarias liofilizadas resultantes cultivadas directamente en la membrana Si3N4. Barra de escala a 200 m(B) Imágenes representativas de la fluorescencia de rayos X a temperatura ambiente de una sola neurona hipocampal liofilizada que muestra las distribuciones de los elementos fisiológicos de potasio (K), azufre (S) y zinc (Zn). Barra de escala de 2 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Aquí se presenta un protocolo para el cultivo celular en membranas de nitruro de silicio y congelación por inmersión antes de la toma de imágenes de fluorescencia de rayos X con una nanosonda de rayos X criogénica de sincrotrón. Cuando sólo se proporciona nanoanálisis a temperatura ambiente, las muestras congeladas se pueden liofilizadas. Estos son pasos críticos para obtener información sobre la composición elemental intracelular.

Cultivo celular en membranas de nitruro de silicio y criopreparación para nanoanálisis de fluorescencia de rayos X de sincrotrón

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Las nanosondas de fluorescencia de rayos X sincrotrón de nuevo diseño permiten visualizar la distribución elemental de una muestra. El uso de enfoques criogénicos es obligatorio para reducir la velocidad de los daños por radiación de rayos X. Por lo tanto, una criofija rápida es esencial para obtener células hidratadas congeladas para optimizar la preservación de la estructura celular y su integridad química.La especificidad de las preparaciones celulares para estudios de sincrotrón conducen a la optimización de este protocolo para la adquisición de monocapas de células hidratadas congeladas. La demostración visual es importante para entender cómo manipular las muestras monocapa de celdas para lograr células criofijas reproduciblemente incrustadas dentro de una fina capa de hielo. Para preparar un soporte de membrana de nitruro de silicio, abra la cápsula que contiene el soporte de la membrana y apriete suavemente la cápsula para aflojar ligeramente el soporte.Utilice pinzas delgadas para agarrar una esquina del marco de silicio teniendo cuidado de no tocar la membrana de nitruro de silicio en el centro del marco y colocar el marco en una placa Petri descubierta en un gabinete de flujo laminar. Luego, los rayos UV esterilizan la membrana durante 25 a 30 minutos. Al final de la esterilización, añadir 10 microlitros del factor de fijación como poli-L-lisina.Incubar durante 25 minutos a 37 grados centígrados y al 5% de dióxido de carbono con humedad. A continuación, llene los pozos de una placa estéril de 48 pozos con 200 a 250 microlitros de 0,22 micrómetros filtrados ultra puro y ultra traza de agua por pozo. Utilice pinzas finas para sumergir cuidadosamente la membrana verticalmente con tres enjuagues sucesivos de 10 segundos en un pozo de agua.Después de enjuagar, coloque la membrana verticalmente en un pozo vacío de una placa estéril de 96 pozos debajo de la campana de flujo laminar y déjela durante la noche hasta que esté seca. Para la siembra de las células de interés, coloque la membrana recubierta con el lado plano hacia arriba en un pozo de una placa estéril de cuatro pozos. Añadir cinco veces 10 a las cuatro células en 10 microlitros de un medio de cultivo apropiado a la superficie de la membrana de nitruro de silicio sin tocar la membrana.La gota debe cubrir toda la membrana. Luego cultiva las células a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono con humedad. Cuando las células han comenzado a adherirse al sustrato, añadir lentamente un mililitro de medio de cultivo completo por la pared de cada pozo que cubre cada membrana.Luego cultiva las células a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono con humedad. Para la criomamovilización de la preparación celular, primero encienda un congelador de inmersión automático y llene el número adecuado de pozos en una placa de plástico de 12 pozos con tampón de acetato de amonio de 37 grados Celsius. Inmediatamente antes de enjuagar y congelar la membrana, retire la muestra de la incubadora y utilice el anillo de abrazadera negro de un par de pinzas de liberación rápida para desbloquear las pinzas.Utilice las pinzas desbloqueadas para agarrar el soporte de membrana y sumergir la membrana verticalmente dentro de la solución tampón de acetato de amonio durante unos cinco segundos. Para eliminar cualquier exceso de tampón, presione la parte inferior del soporte de membrana sobre el papel del filtro y borre cada lado del marco sobre el papel del filtro sin permitir que la membrana toque el papel. Cuando se haya eliminado el exceso de búfer, abra la puerta de la cámara ambiental, deslice rápidamente las pinzas en el enclavamiento de fórceps y cierre la puerta de la cámara.Pulse Blot A plunge. Las pinzas que sostienen la membrana de nitruro de silicio se sumergirán rápidamente en el criogeno. Después de la congelación por inmersión, retire la tapa del recipiente de transferencia con fórceps preenfriados y la transferencia de prensa.La membrana de nitruro de silicio se moverá ligeramente por encima del criogeno. En un solo movimiento rápido, deslice e incline ligeramente las pinzas fuera del enclavamiento de fórceps para llevar las pinzas directamente en una ranura vacía de la criobox en el recipiente de transferencia lleno de líquido de nitrógeno. A continuación, suelte el anillo de abrazadera negro para liberar la membrana.Para el secado por congelación de las células congeladas por inmersión, utilice el interruptor basculante situado en el panel posterior del instrumento de secado por congelación para encender el instrumento. La pantalla mostrará pulse intro cuando esté listo para cargar la muestra. Monte el soporte de latón de membrana de nitruro de silicio en la parte superior del soporte de transferencia de muestra proporcionado por el proveedor en el contenedor de almacenamiento de poliestireno manteniendo el nivel de nitrógeno líquido a aproximadamente uno a dos milímetros por debajo del borde superior de la primera pieza de latón.Coloque la membrana con el lado de la muestra de celda hacia arriba en la cavidad numerada del soporte de latón y pre-enfríe la varilla de transferencia en una caja de espuma de poliestireno lleno de nitrógeno líquido. Utilice la varilla para fijar el conjunto completo, presione enter para romper el vacío para liberar la tapa de la cámara de secador de congelación, transfiera inmediatamente la muestra en la cámara de secador de congelación y cierre la tapa de la cámara de congelación. A continuación, pulse inmediatamente start para continuar con el ciclo de secado por congelación.Al final del ciclo de secado por congelación, presione stop para ventilar la cámara y retire el conjunto completo para acceder a las muestras liofiladas. Aquí se muestra una vista típica del microscopio óptico de video microscopio de células de línea celular hidratadas congeladas subcultadas en un soporte de membrana de nitruro de silicio recubierto de poli-L-lisina como se ha demostrado. El mapeo elemental de fluorescencia de rayos X de las células hidratadas congeladas revela las distribuciones de elementos fisiológicos como potasio, azufre y zinc.En este ejemplo representativo, el elemento de azufre estrechamente unido se distribuyó uniformemente dentro de la célula en un patrón similar al observado para el potasio y representa una buena estimación del perfil de masa celular. La distribución del zinc, sin embargo, exhibió una señal más alta dentro del núcleo que en el citosol con una separación claramente definida de la señal entre el citosol y el núcleo. En esta vista típica de microscopía de Brightfield de las neuronas hipocampales primarias de ratón liofilizados cultivadas directamente en una membrana de nitruro de silicio como se ha demostrado, las células exhiben una morfología neuronal típica que no se ve afectada por su cultivo o método de preservación.Las imágenes de fluorescencia de rayos X de las células congeladas por inmersión también revelan distribuciones elementales típicas que exhiben estas células liofilizadas representativas con una resolución espacial de 50 a 100 nanómetros. Trazar la ventana de nitruro de silicio es fundamental para obtener la capa de hielo más delgada posible de las células después de la congelación por inmersión. La preservación de la integridad química de las células a nivel subcelular permite explorar el metaloma de las células con nanosondas de sincrotrón, así como con otras técnicas microanalíticas.Como no todos los análisis de nanosondas de sincrotrón se pueden realizar a temperatura criogénica, las células hidratadas congeladas se pueden liofilizar aún más para facilitar su análisis a temperatura ambiente. Recuerde utilizar el equipo de protección personal adecuado cuando trabaje con nitrógeno líquido y utilizar siempre gas etano en una campana de humo lejos de las llamas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Investigación

Bioquímica

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Estudios estructurales de las macromoléculas en solución mediante dispersión de rayos-x de ángulo pequeño

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Un soporte de muestra todo en uno para cristalografía de rayos X macromolecular con dispersión mínima de fondo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Cristalografía de rayos X para estudiar la transición del estado oligomérico de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidasse TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Mediciones basadas en fluorescencia del intercambio de fosfatidilserina/fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Recopilación de datos en serie de destino fijo en Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...