Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Experimenten på nano-Imaging fd ID16A utfördes inom ramen för ESRF-förslagen LS2430, LS2303 och LS2765.

<ol>
	<li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage/genotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors.">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li><li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging.">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li><li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , (2000).</li><li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity,+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions,+and+down+regulation+of+MAO-B.">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li><li>Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+low+calcium+concentrations+in+cryosectioned+cells+by+parallel-EELS+mapping.">Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping.</a> Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).</li><li>Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+scanning+electron+microscopy+to+X-ray+analysis+of+frozen+hydrated+sections.+I.+Specimen+handling+techniques.">Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques.</a> Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).</li><li>Saubermann, A. J., Heyman, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections.">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, 169-182 (1987).</li><li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells.">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1875-1882 (1984).</li><li>Wroblewski, J., M&#252;ller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+X-ray+microanalysis+of+semi-thick+cryosections.">Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections.</a> Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).</li><li>Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreparation+of+mammalian+tissue+for+X-ray+microanalysis+in+STEM.">Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM.</a> Journal of Microscopy. 125, 149-156 (1982).</li><li>Harkiolaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-soft+X-ray+tomography:+Using+soft+X-rays+to+explore+the+ultrastructure+of+whole+cells.">Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).</li><li>McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+X-ray+tomography+and+cryogenic+light+microscopy:+the+cool+combination+in+cellular+imaging.">Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).</li><li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy.">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).</li><li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MISTRAL:+a+transmission+soft+X-ray+microscopy+beamline+for+cryo+nano-tomography+of+biological+samples+and+magnetic+domains+imaging.">MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).</li><li>Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+tomography+of+adherent+cells+at+European+synchrotrons.">Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons.</a> Methods in Cell Biology. 124, 151-175 (2014).</li><li>Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+single+cell+quantitative+elemental+imaging+using+proton+or+synchrotron+radiation+focused+beams.">Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+elemental+content+in+adherent+mammalian+cells+for+analysis+by+synchrotron-based+x-ray+fluorescence+microscopy.">Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+manganese+on+primary+hippocampal+neurons+from+rodents.">Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents.</a> Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+Cytotoxicity+Assay+on+Hippocampal+Neuronal+Cell+Culture.">Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture.</a> Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).</li><li>Gibon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+over-expression+of+TRPC6+channels+in+HEK-293+cells+favours+the+intracellular+accumulation+of+zinc.">The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).</li><li>Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Uptake+and+Storage+During+the+Formation+of+the+Cerebral+Cortex+in+Mice.">Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice.</a> Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).</li><li>Villar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopositioning+for+the+ESRF+ID16A+Nano-Imaging+Beamline.">Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline.</a> Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).</li><li>Kosior, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+hard+X-ray+phase+contrast+imaging+and+X-ray+fluorescence+microscopy+for+subcellular+metal+quantification.">Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification.</a> Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).</li><li>Bohic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrotron+hard+X-ray+microprobe:+fluorescence+imaging+of+single+cells.">Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells.</a> Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Development+of+Electron+Cryo-Microscopy+(Nobel+Lecture).">On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture).</a> Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).</li><li>Da Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+concentration+of+high-energy+X-rays+for+diffraction-limited+imaging+resolution.">Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution.</a> Optica. 4 (5), 492-495 (2017).</li><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high-pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+pratice+of+high+pressure+freezing.">Theory and pratice of high pressure freezing.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrarapid+freezing+for+the+preservation+of+cellular+ultrastructure.">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).</li><li>Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryo-Tomography.">Electron Cryo-Tomography.</a> Cellular Imaging. , 61-94 (2018).</li><li>Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+metal+content+and+intracellular+distribution+in+primary+hippocampal+neurons+with+synchrotron+X-ray+fluorescence.">Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence.</a> PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).</li><li>Vavpeti&#269;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+distribution+and+sample+integrity+comparison+of+freeze-dried+and+frozen-hydrated+biological+tissue+samples+with+nuclear+microprobe.">Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).</li><li>Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-preparation+procedures+for+elemental+imaging+by+sims+and+eftem.">Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem.</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 499-536 (2008).</li><li>Gramaccioni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+quantification+of+intracellular+element+concentration+by+X-ray+fluorescence+microscopy+combined+with+X-ray+phase+contrast+nanotomography.">Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography.</a> Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).</li><li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+and+Copper+Effects+on+Stability+of+Tubulin+and+Actin+Networks+in+Dendrites+and+Spines+of+Hippocampal+Neurons.">Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons.</a> ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).</li><li>Ortega, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+over-expression+induces+increased+iron+accumulation+and+redistribution+in+iron-exposed+neurons.">&#945;-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).</li><li>Fartmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+atomic+and+molecular+species+in+cancer+cultures+with+TOF-SIMS+and+Laser-SNMS.">Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS.</a> Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).</li><li>P&#229;lsg&#229;rd, E., Lindh, U., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+freeze-substitution+techniques+for+X-ray+microanalysis+of+biological+tissue.">Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue.</a> Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter.

Cryo-Electron mikroskopi (Cryo-EM) vann 2017 Nobel priset i kemi och som sådan den utveckling som J. dubochet på vitrifiering av biologiskt material för högupplöst strukturbestämning av biomolekyler i lösning25. Som rapporterats av Dubochet i hans Nobel föreläsning "att veta hur man vitrify en droppe vatten är en sak, förbereder ett biologiskt prov för biologisk observation är en annan"25. Cryopgottgörelse steg nu anses vara standardteknik för att lindra strålning dos skador och studera celler nära deras hemland. Förberedelserna är dock långtråkigt. Detta beror på att elektronmikroskopi, på grund av dess oöverträffade rumsliga upplösning, är känslig för alla ultrastrukturella artefakter som uppstår under provet preparatet. Den synkrotron cryonanosonder närmar sig nu liknande svårigheter att gå ner till rumsliga upplösningar så lågt som 13 nm i den höga energi X-ray Range26. Hard röntgen Mikroskop kan analysera hela celler medan elektronmikroskopi lider av den dåliga penetrationsdjupet av elektroner som gör att endast mycket tunna cell skivor observeras.
Monolayers av celler är tunna nog så att genom att störta-frysning i flytande etan, den erforderliga kylningen för vatten vitrifiering uppnås. I teorin, kylning priser så höga som 108 K/s är möjliga att använda högtrycks frysning27 som gör att förglasning av prover för tjocka för att störta frysning. En kylhastighet på 105 K/s, som krävs för att möjliggöra full förglasning av provet vid omgivningstryck28, uppnås med hjälp av den automatiska dykmaskinen och parametrarna som presenteras här. Detta gör det möjligt för en forskare att vitrify tunna biologiska prover (< 10 μm) såsom en enskiktslager av celler12,13,14,15,29,30 genom att störta-frysning i flytande etan.
En viktig utmaning med detta protokoll är också att så mycket som möjligt bevara den kemiska integriteten hos det intracellulära innehållet för att ge pålitliga elementära distributioner inom cellen i 2D eller 3D. Som offentliggjorts på annat håll2,16,17,31, när det gäller elementär avbildning på subcellulär nivå, bör analysen av frysta hydrerade celler övervägas. Annars, kombinationen av Plunge-frysning och frystorkning av celler kan användas för rumstemperatur analys. För den senare, den amorfa isen avlägsnas genom processen för sublimering, medan de bundna vattenmolekylerna avlägsnas genom processen för desorption. Denna process kan vara långt ifrån perfekt jämfört med frysta hydratiserade prover på grund av den eventuella förändringen av cellmembranen och morfologin av vissa subcellulära strukturer32. Också, för artbildning studier, vattenutvinning kan leda till metall artbildning artefakter. Ändå har det varit framgångsrikt och det bästa alternativet till frysta hydratiserade prover för elementär avbildning vid sub-100 nm nivåer2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Eftersom det har rapporterats37, kvaliteten på kryopreserverade cellulära preparat kan utvärderas genom kalium-till-natrium K/na förhållandet. Tyvärr kan det ännu inte bestämmas med den hårda röntgen-nanoprobe som används här, på grund av den låga energi cut-off av kisel drift detektor används för att upptäcka röntgen fluorescens fotoner av elementen (E ≥ 1,3 keV magnesium). Faktum är att ett högt K/na-förhållande (> 10) som kan mätas med hjälp av TOF-Sims, epma eller nukleär mikrosond Pixe16,37 är ett tecken på den bevarade kemiska integriteten hos cellen jämfört med den förväntade K/na på 25 i en levande cell37. Detta kan stödjas av en samtidig låg cl/K ratio38. Fortfarande, ofullkomliga förglasning, särskilt om hastigheten på provet kylning är för låg, kan leda till bildandet av stora iskristaller som kan skada cellmembran och organeller, följaktligen förändra distributionen av kemiska element. Även om det inte finns något rutinmässigt förfarande för att övervaka denna potentiella skador och inverkan på den intracellulära distributionen, ovanstående elementärt nyckeltal och möjligheten att bilden cellen med hög upplösning med röntgen faskontrast eller Cryo-mjuk röntgen mikroskopi kan vara de bästa metoderna för att stödja god bevarande av intracellulära fack med samtidig bevarande av elementär integritet. Kombinationen av dessa tekniker och användningen av nya kryokorrelativa fluorescens optiska mikroskop kommer att bidra till att bedöma i vilken utsträckning denna skada uppstår och påverkar den intracellulära elementära distributionen.
Övergripande, ett detaljerat och omfattande protokoll för att förbereda cellulära prover för synkrotron röntgen fluorescens nanoanalys presenteras. Det är en bra utgångspunkt för forskarsamhället, hjälper till att lösa den svåra frågan om hur man förbereder lämpliga cellulära prover för 2D och 3D Elemental Imaging på (Cryo) hård röntgen nanosonder. Dessa metoder kan slås samman med optisk fluorescens och elektronmikroskopi kapacitet för djupgående korrelativa kemisk och strukturell avbildning av celler.

Nydesignade nanosonderna synkrotron X-ray fluorescens (SR-XRF) möjliggör visualisering av subcellulär distribution av element på ett fullständigt kvantitativt sätt. Som ett exempel, denna analytiska förmåga möjliggör utredning av upptaget av nanopartiklar1 eller Metallorganisk molekyler såsom osmium-baserade komplex2, ger insikt i den intracellulära upptaget av metallbaserade molekyler med potenta cancer egenskaper. Som en multielement teknik, SR-XRF3 med en nanoprobe ger ett sätt att samtidigt kvantifiera och lokalisera intracellulärt mest biologiskt viktiga element, inklusive fosfor, svavel, kalium, kalcium, järn, koppar, och zink. Faktum är att användningen av hård röntgen ger stora penetrationsdjup till bilden hela frysta-hydrerade celler i en etikett-fri mode. Dessutom ger tillgång till K-kanten av de flesta delar av intresse, är röntgen fluorescens upphetsad mest effektivt. Användningen av kryogena metoder kan minska strålningsskador och optimering av bevarandet av cellstruktur och elementär distribution.
De flesta tillgängliga rumsligt lösta analytiska tekniker för att studera metaller i celler är yttekniker som kräver mycket tunna och platta delar av celler som skall produceras. Detta omfattar främst scanning transmissionselektronmikroskopi med energi-dispersiv röntgen analys (STEM – EDX), energifiltrerad transmissionselektronmikroskopi (EF-TEM) och nanoskala sekundär Jon masspektrometri (Nanosimer). Den senare kan inte utföras på frysta, hydrerade cell sektioner medan Cryo-analys kan göras med elektronmikroskopi med oöverträffad rumslig upplösning men dålig elementär känslighet. Partikel-inducerad X-ray emission (PIXE) har tillåtit studiet av elementär distributioner i hela celler. Den har fördelen av att vara helt kvantitativ med en rättvis elementär känslighet på micron skalan och även på submicron resolution4, men lider av strålningsskador och brist på kryogena förmåga att studera frysta-hydrerade celler. Alla dessa analytiska tekniker kompletterar varandra i elementarbilden av celler, men för alla tekniker är prov berednings förfarandet ett avgörande steg. Det bör hållas enkelt att begränsa eventuella föroreningar samt elementär omfördelning och/eller läckage för att få meningsfulla resultat. Som demonstreras i elektronmikroskopi, en kryogen arbetsflöde, inklusive Cryo-immobilisering av cellen och kryotransfer till en kryoscanning skede, möjliggör en optimal elementär bevarande på subcellulära nivåer så nära som möjligt till Native State5,6,7,8,9,10. Denna förståelse har framgångsrikt implementerats i utvecklingen av synkrotron Cryo-Soft röntgen mikroskopi (t. ex. full fält Mikroskop och scanning Mikroskop) för att producera ultrastrukturella avbildning av hela frysta hydrerade celler i 2D eller 3D. Olika kryogena arbetsflöden utvecklades11 för Soft X-ray Mikroskop på fd 2,1 (XM-2) av den avancerade ljuskällan på Lawrence Berkeley National Laboratory12, fd U41-XM på elektron lagrings ringen BESSY II (Tyskland)13, fd Mistral i Alba ljuskälla (Spanien)14, och på fd B24 i Diamond Light källa15, bland annat. Ett liknande arbetsflöde har nyligen visat sig vara den mest pålitliga förberedelse-och konserverings metoden för intracellulär elementaranalys med röntgen mikrosonder16,17.
Även röntgen nanoprobe tekniker börjar allmänt användas för cellulära elementär analys, särskilt med tillkomsten av kryogena SR-XRF kapacitet, har ingen stegvis protokoll sprids hittills till forskarvärlden. Här ges ett detaljerat förfarande för beredning av kryofixerade sittande celler odlade som enskiktslager på silikonnitridmembran som skall analyseras under kryogena förhållanden. Ett frys torknings steg som skall appliceras efter protokollet om röntgen analysen skall utföras vid rumstemperatur finns också. Medan det föreslagna protokollet har framgångsrikt använts med mänskliga bröstcancerceller MD-MB-2312 och frystorkning visades bland annat på mus nervceller18,20,21, det kan lätt utvidgas till olika typer av mänskliga eller animaliska celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

Mycket lite är känt om distributionen av metalljoner på subcellulär nivå. Emellertid, dessa kemiska element har viktiga reglerande funktioner och deras störd homeostas är inblandade i olika sjukdomar. State-of-the-art synkrotron röntgen fluorescens nanosonder ger erforderlig känslighet och rumslig upplösning för att belysa den tvådimensionella (2D) och tredimensionell (3D) distribution och koncentration av metaller i hela celler på organellnivå. Detta öppnar nya spännande vetenskapliga områden av utredning på rollen av belägger med metall i physiopatologin av cellen. Den cellulära beredningen är en viktig och ofta komplicerad procedur, särskilt för grundläggande analys. Även om röntgenfluorescensmetoder nu är utbredda och olika beredningsmetoder har använts, har mycket få studier undersökt bevarandet av elementarhalten i celler i bästa fall, och inga stegvisa detaljerade protokoll för frys reparation av anhängare celler för röntgen fluorescens nanoprober har släppts hittills. Detta är en beskrivning av ett protokoll som ger den stegvisa cellulära beredningen för snabb kryofixering för att möjliggöra synkrotron röntgen fluorescens nano-analys av celler i ett fryst hydrerat tillstånd när en kryogen miljö och överföring är tillgänglig. Om nano-analys måste utföras i rumstemperatur, finns ytterligare ett förfarande för frystorkning av den kryofasta anhängare cellulär preparationen. De föreslagna protokollen har framgångsrikt använts i tidigare verk, senast i att studera 2D-och 3D-intracellulär distribution av en organometallisk förening i bröstcancerceller.

En typisk optisk video Mikroskop bild av frysta hydrerade MDA-MB-231 celler som sub-odlade på en poly-L-lysine belagda si3N4 membran stöd visas i figur 7a. Den optiska vyn av provet i vakuumkammaren erhölls i reflektions läge med hjälp av dedikerad online video Mikroskop av ID16A fd av ESRF22. Medan elektron eller mjuk röntgen mikroskopi kräver isskiktet bädda in cellen för att vara så tunn som möjligt (vanligtvis < 0,5 μm), hårda röntgenstrålar (> 10 keV) har fördelen av en mycket högre penetrationsdjup och lägre dos deposition. Isen tjocklek kan därför vara större, typiskt < 10 μm inklusive cellen så att isen bädda in cellen är några μm i tjocklek. Detta kan uppskattas genom den uppmätta röntgenintensiteten i transmission jämfört med intensiteten utan provet, med hänsyn tagen till absorptionen av 500 Nm tjockt si3N4 -membran. Denna is tjocklek kan uppnås genom manuell blotting som beskrivs i detta protokoll. I Newton ringar regionen, isen tjocklek kan vara ännu tunnare (inte mätt).
Röntgen fluorescens elementära kartläggning av den frusna hydrerade cellen visas i figur 7B med representativa fördelningar av fysiologiska element såsom kalium (K), svavel (S) och zink (Zn). Dessa kartor representerar elementär areal massan (dvs. elementär projicerad massa). Även om det inte görs i det aktuella fallet, kan sådana kartor normaliseras genom Röntgenspridning-baserad faskontrast avbildning som ger uppskattningen av provet projicerade massan23. Som rapporterats av många studier, den mycket diffus K ion i celler bevarade i deras nära-infödda tillstånd antogs vara homogent distribueras i hela cellen23,24,16. Som visas i 2D röntgen fluorescens elementära bilder i figur 7B, den tätt bundna element S var jämnt fördelade i cellen, på samma sätt som K, och utgör en bra uppskattning av cellulära massa profil. Zn-distributionen hade en högre signal i kärnan än i cytosolen och tydligt redogjorde för kärnan. Det kan noteras att små Zn-anrikade regioner kan upptäckas vid den rumsliga upplösningen (50 nm) i kärnkrafts regionen.
De befintliga röntgen nanosonderna eller de som ska byggas uppfyller inte nödvändigtvis kryogena egenskaper. I detta fall, det bästa alternativet för att få röntgen fluorescens bilder av celler vid sub-100 nm rumsliga upplösningar är att utföra en frystorkning förfarande som beskrivs i detta protokoll efter djupfrysning av cellen. Figur 8a visar en typisk ljus fält mikroskopi syn på resulterande frystorkad primär mus Hippocampus nervceller direkt odlade på Si3N4 membranet. I detta fall, om de förvaras i en ren, desiccerad kammare, kan proverna beredas 1 − 2 veckor i förväg och observeras med ett vanligt upprätt optiskt mikroskop för registrering av intresseområden. Försiktighet bör iakttas för att förhindra exponering för omgivande luftfuktighet eftersom det kan fångas upp av det frystorkade provet och leda till skador under röntgen nanobeam. Denna procedur tillämpades framgångsrikt på mycket känsliga celler (dvs neuronala celler) och ännu bättre resultat erhölls med andra mer robusta typer av celler, såsom cancerceller. När det gäller djupfrysta celler, röntgen fluorescerande bilder av K, S och Zn på hela frystorkad cell visas liknar de som beskrivs ovan. De är representativa för de elementära distributioner som finns i olika typer av frystorkade celler vid 50 − 100 nm rumslig upplösning. Medan frystorkning hela celler är ett alternativ till att bevara elementär integritet, är det på bekostnad av en perfekt bevarande av cellmorfologin16, särskilt cellmembran.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> Figur 1: typiskt prov stöd för nanoanalys av röntgen fluorescens. Ett si3N4 -membran stöd i sin skyddande kapsel. Denna typ av substrat kan användas både för rumstemperatur analys (Plunge-frys cellulära förberedelse följt av låg temperatur och lågvakuum frystorkning process) eller för kryogen röntgenfluorescens analys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> Figur 2: Schematisk bild av kisel nitrid-Fönstren efter cell sådd. Cellerna odlas direkt på Poly-L-lysine belagda plana ytan av Si3N4 membran stöd. Ibland luftbubblor kan fastna i baksidan hålighet av Si3N4 membran stöd och måste avlägsnas enligt beskrivningen i protokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> Figur 3: egenutvecklade 3D-tryckta Cryo-box för långtidslagring av djupfryst si3N4 membran stöd i flytande kväve Dewar. A) Cryo-Box demonteras med behållaren och locken (nedre delen) och (B) den monterade kryo-boxen med låsta lock. Locken kan manipuleras med pincetten, öppning eller låsning genom rotation. En detaljerad plan för 3D-utskrifter finns på begäran från ESRF ID16A. Designen har gjorts för att rymma kisel nitrid TEM rutnät. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> Figur 4: blottning av celler odlade på Si3N4. Före Plunge-frysning cellen enskiktslager odlade på en SI3N4 membran måste sköljas i ammoniumacetatlösning (a) och försiktigt manuellt utplånas med hjälp av filterpapper (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> Figur 5: automatisk Plunge-frysning EM-GP-maskin. (A) den automatiska dykfrysen. Bmiljökammare med pincetten inlåst.Cden etan-kopp som är täckt med Leica-likriktaren ansluten till en etan-flaska. D) den djupfryst kapsling som visar den svarta koppen som är full av flytande etan och Cryo-boxen för ytterligare förvaring i LN2 av de förglasade si3N4 -membranen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> Figur 6: prov kryotransferenhet för frystorkning. (A) den första mottagaren av mässing för si3N4 -membran monteras ovanpå prov överförings hållaren som tillhandahålls av frys torkens leverantör. (B) och (C) visar att den andra platta mässings skivan används som täckmantel och fungerar som ett kallt fälla hölje som skall sättas in i vakuum höljet av frys torken. D) hela monteringen med den fjäderbelastade överförings staven. E) den provhållare som transporterar den förglasade cellulära beredningen som odlas på Si3N4 -membranet måste införas ytterligare i LN2-kyld frys tork. Alla steg för montering av monteringen görs i LN2 i en frigolit låda. För tydlighetens skull producerades alla bilder i avsaknad av LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> Figur 7: Cryo-röntgen fluorescens bilder av en fryst hydrerad cell med hjälp av hård röntgen nanosond. (A) typisk online-vy i reflektions läge med hjälp av det dedikerade optiska video mikroskopet i ESRF ID16A beamline. Efter manuell blotting uppnåddes en total is tjock lek på ca 5 − 10 μm som ger en klar bild av de frusna hydrerade cellerna. En region med Newton ringer indikativt av även mycket tunnare is är märkbar. Brepresentativa kryoröntgenfluorescens cellulära distributioner av fysiologiska element kalium (K), svavel (S) och zink (Zn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> Figur 8: röntgen fluorescens bilder av en frystorkad neuronala cell med hjälp av hård röntgen nanosond. (A) typisk ljus fälts mikroskopi syn på resulterande frystorkade primära kortikala neuronala celler direkt odlade på Si3N4 -membranet. Skalstapel = 200 μm (B) representativ rumstemperatur X-strålfluorescens bilder av en enda frystorkad Hippocampus neuron som visar fördelningen av fysiologiska element kalium (K), svavel (S) och zink (Zn). Scale bar = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Här presenteras ett protokoll för cellodling på kiselnitridmembran och djupfrysning före röntgenfluorescensavbildning med en synkrotron kryogen röntgennanosond. När endast nano-analys av rumstemperatur tillhandahålls kan de frysta proverna frystorkas ytterligare. Dessa är kritiska steg för att få information om den intracellulära elementära sammansättningen.

Cell odling på Kiselnitridmembran och Kryopreparation för Synchrotron röntgenfluorescens Nanoanalys

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Nydesignade synkrotronröntgenfluorescens nano-sonder tillåter visualisering av elementär fördelning av ett prov. Användningen av kryogena metoder är obligatoriskt att bromsa röntgenstrålning skadestånd. Därför är en snabb kryofixation avgörande för att få frysta hydrerade celler för att optimera bevarandet av cellstrukturen och dess kemiska integritet.Specificiteten hos de cellulära preparaten för synkrotronstudier leder till optimering av detta protokoll för att förvärva frysta monoskikt för hydratiserade celler. Visuell demonstration är viktigt för att förstå hur man manipulerar cellens monolayerprover för att uppnå reproducerbara kryofixade celler inbäddade i ett tunt lager av is. För att förbereda ett stöd av kiselnitridmembranet, öppna kapseln som innehåller membranstödet och försiktigt pressa kapseln för att lätt lossa stödet.Använd tunna pincett för att förstå ett hörn av kiselramen noga med att inte röra kiselnitridmembranet i mitten av ramen och placera ramen i en avtäckt Petriskål i ett laminär flödesskåp. Sedan UV sterilisera membranet i 25 till 30 minuter. I slutet av steriliseringen, tillsätt 10 mikroliter av fästfaktor såsom poly-L-lysin.Inkubera i 25 minuter vid 37 grader Celsius och vid 5%koldioxid med fuktighet. Fyll sedan brunnarna i en steril 48-brunnsplatta med 200 till 250 mikroliter på 0,22 mikrometer filtrerat ultra pure och ultra trace water per brunn. Använd fin pincett för att försiktigt dränka membranet vertikalt med tre på varandra följande 10-sekunders sköljningar i en brunn med vatten.Efter sköljning, placera membranet vertikalt i en tom brunn av en steril 96-brunnsplatta under laminär flödeshuven och lämna den över natten tills den är torr. För sådd av cellerna av intresse, placera den belagda membranet med den platta sidan vänd uppåt i en brunn av en steril fyr-brunnsplatta. Tillsätt fem gånger 10 till de fyra cellerna i 10 mikroliter av ett lämpligt odlingsmedium till ytan av kiselnitridmembranet utan att röra membranet.Droppen ska täcka hela membranet. Sedan odla cellerna på 37 grader Celsius och 5% koldioxid med fuktighet. När cellerna har börjat fästa på substratet, tillsätt långsamt en milliliter av komplett odlingsmedium ner väggen i varje brunn som täcker varje membran.Sedan odla cellerna på 37 grader Celsius och 5% koldioxid med fuktighet. För kryoimmobilisering av den cellulära beredningen, först slå på en automatisk dykbox och fylla lämpligt antal brunnar i en 12-väl plastplatta med 37 grader Celsius ammoniumacetatbuffert. Omedelbart före sköljning och doppfrysning av membranet, ta bort provet från inkubatorn och använd den svarta klämringen av ett par snabbkopplingspincett för att låsa upp pincetten.Använd den upplåsta pincetten för att fatta tag i membranstödet och sänk ned membranet vertikalt inom ammoniumcetatbuffertlösningen i cirka fem sekunder. För att avlägsna eventuell överskottsbuffert trycker du ned botten av membranstödet på filterpapper och blotar varje sida av ramen på filterpapperet utan att låta membranet röra papperet. När överskottsbufferten har tagits bort, öppna miljökammardörren, skjut snabbt in pincetterna i pincetternas förregling och stäng kammarens dörr.Tryck blot Ett dopp. Pincetterna som håller kiselnitridmembranet kommer snabbt att kastas ner i kryogen. Efter störtdykning, avlägsna locket på överföringsbehållaren med förkylda tyfningar och tryck på överföring.Kiselnitridmembranet kommer att flyttas något över kryogen. I en snabb enda rörelse, skjut och luta något pincetterna ur pincett interlock för att få pincett direkt i en tom springa av kryolådan i överföringsbehållaren fylld med kvävevätska. Släpp sedan den svarta klämringen för att frigöra membranet.För frystorkning av de dykfrusna cellerna, använd vippbrytaren som sitter på frystorkningsinstrumentets bakre panel för att ström på instrumentet. Displayen kommer att visa tryck enter när redo att ladda prov. Montera hållare för silicon nitridemembransmäss på toppen av den provöverföringshållare som leverantören tillhandahåller i förvaringsbehållaren för polystyren som håller nivån av flytande kväve till ungefär en till två millimeter under den första mässingsbitens övre kant.Placera membranet med cellprovsidan vänd uppåt i mässingshållaren numrerad hålighet och förkyl överföringsstaven i en flytande kvävefylld polystyrenskumdostlåda. Använd stången för att låsa i hela monteringen, tryck in för att bryta vakuumet för att frigöra locket på frystorkare kammaren, omedelbart överföra provet i frystorkkammaren, och stäng frystork kammaren locket. Tryck sedan omedelbart på start för att fortsätta med frystorkningscykeln.I slutet av frystorkningscykeln trycker du på stopp för att ventilera kammaren och ta bort hela monteringen för att komma åt de frystorkade proverna. Här en typisk optisk video mikroskop syn på frysta hydrerade celler bröstcancer cellinje subkulturerade på en poly-L-lysin belagda kisel nitrid membran stöd som visas visas. Röntgenfluorescens elementär kartläggning av de frysta hydratiserade cellerna avslöjar fördelningen av fysiologiska element som kalium, svavel och zink.I detta representativa exempel var det tätt bundna svavelelementet jämnt fördelat inom cellen i ett liknande mönster som det som observerats för kalium och representerar en god uppskattning av den cellulära massprofilen. Zinkfördelningen uppvisade dock högre signal inom kärnan än i cytosolen med en klart definierad separation av signalen mellan cytosol och kärnan. I denna typiska Brightfield mikroskopi syn på frystorkade primära mus hippocampus nervceller direkt odlade på en kisel nitrid membran som visat, cellerna uppvisar en typisk neural morfologi som inte påverkas av deras kultur eller bevarande metod.Röntgen fluorescens imaging av störta-frysta celler avslöjar också typiska elementära distributioner som visas av dessa representativa frystorkade celler på en 50 till 100 nanometer rumslig upplösning. Plottning av kiselnitridfönstret är avgörande för att få det tunnaste möjliga isskiktet av celler efter dopp frysning. Att bevara cellernas kemiska integritet på subcellulär nivå gör att cellernas metallom utforskas med synkrotronnanosonder samt med andra mikroanalytiska tekniker.Eftersom inte all synkrotron nano-probeanalys kan utföras vid kryogen temperatur, kan de frysta hydratiserade cellerna ytterligare frystorkas för att underlätta deras analys vid rumstemperatur. Kom ihåg att använda lämplig personlig skyddsutrustning vid arbete med flytande kväve och att alltid använda etangas i en rökhuva bort från lågor.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Online Storlek-utanförskap och Jonbyteskromatografi på en SAXS beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomär skala strukturella studier av makromolekylära sammansättningar av Solid-state kärnmagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Att kombinera röntgenkristallografi med små Angle X-Ray Scattering att modellera ostrukturerade regioner av Nsa1 från S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturella studier av makromolekyler i lösningen med små Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En allt-i-ett-provhållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi med minimal bakgrunds spridning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Kristallografi att studera oligomeric staten Övergång av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Fluorescensbaserade mätningar av fosfatidylserin/fosfatidylinositol 4-fosfatutbyte mellan membran

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seriell datainsamling med fast mål vid Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...