Name: cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Nano-görüntüleme ışın çizgisi ID16A üzerinde deneyler ESRF önerileri LS2430, LS2303 ve LS2765 çerçevesinde yapılmıştır.

<ol>
	<li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage/genotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors.">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li><li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging.">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li><li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , (2000).</li><li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity,+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions,+and+down+regulation+of+MAO-B.">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li><li>Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+low+calcium+concentrations+in+cryosectioned+cells+by+parallel-EELS+mapping.">Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping.</a> Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).</li><li>Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+scanning+electron+microscopy+to+X-ray+analysis+of+frozen+hydrated+sections.+I.+Specimen+handling+techniques.">Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques.</a> Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).</li><li>Saubermann, A. J., Heyman, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections.">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, 169-182 (1987).</li><li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells.">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1875-1882 (1984).</li><li>Wroblewski, J., M&#252;ller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+X-ray+microanalysis+of+semi-thick+cryosections.">Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections.</a> Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).</li><li>Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreparation+of+mammalian+tissue+for+X-ray+microanalysis+in+STEM.">Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM.</a> Journal of Microscopy. 125, 149-156 (1982).</li><li>Harkiolaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-soft+X-ray+tomography:+Using+soft+X-rays+to+explore+the+ultrastructure+of+whole+cells.">Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).</li><li>McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+X-ray+tomography+and+cryogenic+light+microscopy:+the+cool+combination+in+cellular+imaging.">Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).</li><li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy.">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).</li><li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MISTRAL:+a+transmission+soft+X-ray+microscopy+beamline+for+cryo+nano-tomography+of+biological+samples+and+magnetic+domains+imaging.">MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).</li><li>Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+tomography+of+adherent+cells+at+European+synchrotrons.">Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons.</a> Methods in Cell Biology. 124, 151-175 (2014).</li><li>Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+single+cell+quantitative+elemental+imaging+using+proton+or+synchrotron+radiation+focused+beams.">Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+elemental+content+in+adherent+mammalian+cells+for+analysis+by+synchrotron-based+x-ray+fluorescence+microscopy.">Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+manganese+on+primary+hippocampal+neurons+from+rodents.">Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents.</a> Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).</li><li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+Cytotoxicity+Assay+on+Hippocampal+Neuronal+Cell+Culture.">Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture.</a> Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).</li><li>Gibon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+over-expression+of+TRPC6+channels+in+HEK-293+cells+favours+the+intracellular+accumulation+of+zinc.">The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).</li><li>Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Uptake+and+Storage+During+the+Formation+of+the+Cerebral+Cortex+in+Mice.">Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice.</a> Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).</li><li>Villar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopositioning+for+the+ESRF+ID16A+Nano-Imaging+Beamline.">Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline.</a> Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).</li><li>Kosior, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+hard+X-ray+phase+contrast+imaging+and+X-ray+fluorescence+microscopy+for+subcellular+metal+quantification.">Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification.</a> Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).</li><li>Bohic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrotron+hard+X-ray+microprobe:+fluorescence+imaging+of+single+cells.">Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells.</a> Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Development+of+Electron+Cryo-Microscopy+(Nobel+Lecture).">On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture).</a> Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).</li><li>Da Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+concentration+of+high-energy+X-rays+for+diffraction-limited+imaging+resolution.">Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution.</a> Optica. 4 (5), 492-495 (2017).</li><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high-pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+pratice+of+high+pressure+freezing.">Theory and pratice of high pressure freezing.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrarapid+freezing+for+the+preservation+of+cellular+ultrastructure.">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).</li><li>Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryo-Tomography.">Electron Cryo-Tomography.</a> Cellular Imaging. , 61-94 (2018).</li><li>Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+metal+content+and+intracellular+distribution+in+primary+hippocampal+neurons+with+synchrotron+X-ray+fluorescence.">Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence.</a> PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).</li><li>Vavpeti&#269;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+distribution+and+sample+integrity+comparison+of+freeze-dried+and+frozen-hydrated+biological+tissue+samples+with+nuclear+microprobe.">Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).</li><li>Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-preparation+procedures+for+elemental+imaging+by+sims+and+eftem.">Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem.</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 499-536 (2008).</li><li>Gramaccioni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+quantification+of+intracellular+element+concentration+by+X-ray+fluorescence+microscopy+combined+with+X-ray+phase+contrast+nanotomography.">Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography.</a> Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).</li><li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+and+Copper+Effects+on+Stability+of+Tubulin+and+Actin+Networks+in+Dendrites+and+Spines+of+Hippocampal+Neurons.">Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons.</a> ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).</li><li>Ortega, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+over-expression+induces+increased+iron+accumulation+and+redistribution+in+iron-exposed+neurons.">&#945;-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).</li><li>Fartmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+atomic+and+molecular+species+in+cancer+cultures+with+TOF-SIMS+and+Laser-SNMS.">Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS.</a> Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).</li><li>P&#229;lsg&#229;rd, E., Lindh, U., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+freeze-substitution+techniques+for+X-ray+microanalysis+of+biological+tissue.">Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue.</a> Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).</li></ol>

Yazarların çıkar çatışması yok.

Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) 2017 Nobel Kimya Ödülü'nü kazandı ve j. Dubochet tarafından biyolojik malzemenin vitrifikasyonu üzerine yapılan gelişme25. Dubochet'in Nobel dersinde bildirdiği gibi "Bir su damlasını nasıl vitrife ediş edeyim bilmek başka bir şeydir, biyolojik gözlem için biyolojik bir örnek hazırlamak başka bir şeydir"25. Kriyohazırlık adımları artık radyasyon dozu hasarı azaltmak ve kendi yerel durumuna yakın çalışma hücreleri için standart teknik olarak kabul edilir. Ancak hazırlık sıkıcı olmaya devam ediyor. Bunun nedeni elektron mikroskopisinin, emsalsiz uzamsal çözünürlüğü nedeniyle, numune hazırlama sırasında oluşan herhangi bir ultrayapısal yapıya duyarlı olmasıdır. Senkrotron cryonanoprobları şimdi yüksek enerjili X-ışını aralığı2613 nm gibi düşük mekansal çözünürlüklere inerek benzer zorluklar yaklaşıyor. Basılı X-ışını mikroskobu tüm hücreleri analiz ederken elektron mikroskobu elektronların yetersiz nüfuz derinliğinden muzdariptir ve sadece çok ince hücre dilimlerinin gözlemlemesini sağlar.
Hücrelerin monokatmanları sıvı etan dalma-donma tarafından, su vitrifikasyon için gerekli soğutma oranları elde böylece yeterince ince. Teorik olarak, 108 K/s'ye varan soğutma oranları, yüksek basınçlı donma27 kullanılarak mümkündür ve bu da dalma donması için çok kalın olan numunelerin vitrifikasyonuna olanak sağlar. 105 K/s'lik bir soğutma hızı, ortam basıncı28'denumunenin tam vitrifikasyonuna izin vermek için otomatik dalma-dondurma makinesi ve burada sunulan parametreler kullanılarak tekrar tekrar ulaşılır. Bu bir araştırmacı ince biyolojik örnekleri vitrifiye sağlar (<10 μm) hücrelerin bir monolayer gibi12,13,14,15,29,30 sıvı etan dalma-dondurma tarafından.
Bu protokol ile önemli bir sorun da 2D veya 3D hücre içinde güvenilir element dağılımları sağlamak için hücre içi içeriğin kimyasal bütünlüğünü mümkün olduğunca korumaktır. Başka bir yerde yayınlandığı gibi2,16,17,31, hücre altı düzeyinde elemental görüntüleme durumunda, dondurulmuş sulu hücrelerin analizi düşünülmelidir. Aksi takdirde, dalma-dondurma ve hücrelerin dondurulması kombinasyonu oda sıcaklığı analizi için kullanılabilir. İkincisi için, amorf buz süblimleşme işlemi ile kaldırılır, bağlı su molekülleri desorpsiyon işlemi ile kaldırılır. Bu süreç, hücre zarlarının olası değişimi ve bazı hücre altı yapıların morfolojisi nedeniyle dondurulmuş sulu numunelere göre ideal olmaktan uzak olabilir32. Ayrıca, türleşme çalışmaları için, su çıkarma metal türleşme eserlere yol açabilir. Yine de, başarılı olmuştur ve alt-100 nm düzeyleri2,16,17,18,20,33,34,35,36elemental görüntüleme için dondurulmuş sulu örnekler için en iyi alternatif olmuştur.
37olarak bildirilmiştir, kriyokorunmuş hücresel preparatların kalitesi potasyum-sodyum K/Na oranı ile değerlendirilebilir. Ne yazık ki, elementlerin X-ışını floresan fotonları (E ≥ 1.3 keV magnezyum) tespit etmek için kullanılan silikon sürüklenme dedektörünün düşük enerji kesme nedeniyle, burada kullanılan sert X-ışını nanoprobuk ile henüz belirlenemez. Nitekim, Yüksek K / Na oranı (>10) TOF-SIMS, EPMA veya nükleer mikroprobun PIXE16kullanılarak ölçülebilir,37 hücrenin korunmuş kimyasal bütünlüğünün göstergesidir 25 canlı hücrede beklenen K / Na ile karşılaştırıldığında37. Bu, eşlik eden düşük Cl/K oranı38ile desteklenebilir. Yine de, kusurlu vitrifikasyon, özellikle numune soğutma hızı çok düşükse, hücre zarlarına ve organellere zarar vererek kimyasal elementlerin dağılımını değiştirebilecek büyük buz kristallerinin oluşmasına yol açabilir. Bu potansiyel hasarı ve hücre içi dağılımı nı izlemek için rutin bir prosedür olmamasına rağmen, yukarıdaki elementoranları ve x-ışını faz kontrastı veya kriyo-yumuşak X-ışını mikroskopisi kullanarak hücreyi yüksek çözünürlükte görüntüleme olasılığı, hücre içi bölmelerin element bütünlüğünün birlikte korunmasıile birlikte iyi korunmasını desteklemek için en iyi yaklaşımlar olabilir. Bu tekniklerin birleşimi ve yeni geliştirilen kriyokorsli floresan optik mikroskopların kullanımı, bu hasarın hücre içi element dağılımını ne ölçüde meydana geldiğini ve etkilediğini değerlendirmeye yardımcı olacaktır.
Genel olarak, senkrotron X-ışını floresans nano-analizi için hücresel numunehazırlamak için ayrıntılı ve kapsamlı bir protokol sunulmuştur. Bu araştırma topluluğu için iyi bir başlangıç noktası, 2D ve 3D elemental görüntüleme için uygun hücresel örnekleri hazırlamak için nasıl zor sorunu çözmek için yardımcı (kriyo) sert X-ışını nanoprobları. Bu yaklaşımlar, hücrelerin derinlemesine korelasyon kimyasal ve yapısal görüntülemesi için optik floresan ve elektron mikroskobu yetenekleri ile birleştirilebilir.

Yeni tasarlanmış senkrotron X-ışını floresansı (SR-XRF) nanoprobları, elementlerin hücre altı dağılımının tamamen nicel bir şekilde görüntülenmesine olanak sağlar. Örnek olarak, bu analitik yeteneği nano tanecikleri alımının araştırılmasını sağlar1 veya osmiyum bazlı kompleksleri gibi organometalikmoleküllerin 2, güçlü antikanser özellikleri ile metal bazlı moleküllerin hücre içi alımı içine fikir sağlayan. Çok elementli bir teknik olarak, sr-xrf3 nanoprobukle aynı anda hesaplamak ve fosfor, kükürt, potasyum, kalsiyum, demir, bakır ve çinko gibi hücre içi en önemli elementleri lokalize etmek için bir yol sağlar. Gerçekten de, sert X-ışınlarının kullanımı etiketsiz bir şekilde tüm dondurulmuş sulu hücreleri görüntü için büyük penetrasyon derinliği sağlar. Ayrıca, ilgi en unsurların K-kenarına erişim sağlayan, X-ışını floresan en verimli heyecan verici. Kriyojenik yaklaşımların kullanımı radyasyon hasarının azaltılmasına ve hücre yapısının ve elementdağılımının korunmasına olanak sağlar.
Hücrelerdeki metalleri incelemek için mekansal olarak çözülen analiz tekniklerinin çoğu, hücrelerin çok ince ve düz bölümlerinin üretilmesi gereken yüzey teknikleridir. Bu esas enerji dağılımlı X-ışını analizi (STEM-EDX), enerji filtreli iletim elektron mikroskobu (EF-TEM) ve nano ölçekli ikincil iyon kütle spektrometresi (nanoSIMS) ile tarama iletim elektron mikroskobu kapsar. Kriyo-analiz, elektron mikroskobu ile eşsiz uzamsal çözünürlük tesbit ivedi ama zayıf elementduyarlılığı ile yapılabiliriken, dondurulmuş, sulu hücre kesitlerinde ikincisi yapılamaz. Parçacık kaynaklı X-ışını salınımı (PIXE) tüm hücrelerdeki elementdağılımlarının incelenmesine olanak sağlamıştır. Mikron ölçeğinde ve hatta submikron çözünürlüğünde4'te adil bir elementsel hassasiyetle tamamen kantitatif olma avantajına sahiptir, ancak radyasyon hasarı ve dondurulmuş susuz hücreleri incelemek için kriyojenik yeteneklerin eksikliğinden muzdaripdir. Tüm bu analitik teknikler hücrelerin elemental görüntülemesinde birbirini tamamlar, ancak tüm teknikler için örnek hazırlama prosedürü çok önemli bir adımdır. Anlamlı sonuçlar elde etmek için olası kontaminasyonun yanı sıra elementel yeniden dağıtım ve/veya sızıntıyı sınırlamak için basit tutulmalıdır. Elektron mikroskobunda gösterildiği gibi, hücrenin kriyo-immobilizasyonu ve kriyotransfer gibi kriyojenik iş akışı, hücre altı seviyelerde mümkün olduğunca yakın olan5,6,7,8,9,10. Bu anlayış, dondurulmuş susuzlu hücrelerin 2D veya 3Boyutlu ultrayapısal görüntülemesini üretmek için senkrotron kriyo-yumuşak X-ışını mikroskobu (örneğin, tam alan mikroskopları ve tarama mikroskopları) geliştirilmesinde başarıyla uygulanmıştır. Çeşitli kriyojenik iş akışları11 Beamline 2.1 (XM-2) Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı12Gelişmiş Işık Kaynağı yumuşak X-ışını mikroskoplar için geliştirilmiştir , elektron depolama halkası BESSY II (Almanya)13, ALBA ışık kaynağının beamline MISTRAL (İspanya)14, ve Beamline B24 Elmas ışık kaynağı15arasında, diğerleri arasında. Benzer bir iş akışı son zamanlarda X-Ray mikroprobları16,17kullanarak hücre içi elementanalizi için en güvenilir hazırlık ve koruma yöntemi olduğu gösterilmiştir.
X-ışını nanoprob teknikleri hücresel elementanalizi için yaygın olarak kullanılmaya başlanmış olsa da, özellikle kriyojenik SR-XRF yeteneklerinin ortaya çıkmasıyla, araştırma topluluğuna şimdiye kadar hiçbir adımsal protokol yayılmıştır. Burada, kriyojenik koşullarda analiz edilecek silikon nitrür membranlarında monolayers olarak kültürlenen kriyofixed yapışık hücrelerin hazırlanması için ayrıntılı bir prosedür sağlanmaktadır. Protokolden sonra uygulanacak bir dondurma-kurutma adımı nda oda sıcaklığında x-ışını analizi yapılması gerekmektedir. Önerilen protokol başarıyla insan meme kanseri hücreleri MD-MB-2312 ile kullanılan ve dondurulma fare nöronlar18,20,21diğerleri arasında gösterilmiştir iken, kolayca insan veya hayvan hücrelerinin çeşitli genişletilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>09691-250mL</td>
			<td>One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>31966-02</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer</td>
			<td>Quorum Technology</td>
			<td>EK3147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane N45</td>
			<td>Air Liquid</td>
			<td>p0505s05r0a001</td>
			<td>C2H6 &#62; 99,995 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>14185-052</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica GP quick-release forceps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-26</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>for hippocampal neuron culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 4-Well Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>176740</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer</td>
			<td>Advanced Instruments</td>
			<td>Osmo1</td>
			<td>Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&#174; Vapor Pressure Osmometer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing robot Leica EM GP main unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride membrane (Si3N4)</td>
			<td>Silson Ltd.</td>
			<td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td>
			<td>The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>W9-1</td>
			<td>MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper with precut hole</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td>Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture on silicon nitride membranes and cryopreparation for synchrotron x-ray fluorescence nano-analysis

Hücre altı düzeyde metal iyonlarının dağılımı hakkında çok az şey bilinmektedir. Ancak, bu kimyasal elementler temel düzenleyici işlevleri var ve rahatsız homeostaz çeşitli hastalıklara karışılır. Son teknoloji senkrotron X-ışını floresan nanoprobları, tüm hücrelerdeki metallerin iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) dağılımını ve konsantrasyonunun açıklığa kavuşturması için gerekli hassasiyeti ve mekansal çözünürlüğü sağlar. organel düzeyi. Bu hücrenin fizyopatoloji metallerin rolü üzerinde araştırma yeni heyecan verici bilimsel alanlar açar. Hücresel hazırlık, özellikle temel analiz için önemli ve genellikle karmaşık bir işlemdir. X-ışını floresan teknikleri artık yaygın ve çeşitli hazırlık yöntemleri kullanılmış olmasına rağmen, çok az çalışma en iyi hücrelerin elementer içeriğinin korunması araştırılmış ve kriyoprepres için hiçbir adım salk›rayrıntılı protokol X-ışını floresan nanoprobları için yapışık hücreler şimdiye kadar serbest bırakıldı. Bu, kriyojenik bir ortam ve aktarım mevcut olduğunda dondurulmuş sulu durumdaki hücrelerin senkrotron X-ışını floresannano analizini sağlamak için hızlı cryofixation için adım adım hücreli hazırlık sağlayan bir protokol açıklamasıdır. Nano-analizin oda sıcaklığında yapılması gerektiği durumlarda, kriyofixed yapışık hücresel preparatın dondurulması için ek bir prosedür sağlanır. Önerilen protokoller önceki çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır, en son meme kanseri hücrelerinde bir organometalik bileşiğin 2D ve 3D hücre içi dağılımının incelenmesinde.

Donmuş sulu MDA-MB-231 hücrelerinin poli-L-lizin kaplı Si3N4 membran desteğinin alt kültürlenmiş tipik optik video mikroskop görünümü Şekil 7A'dagösterilmiştir. Vakum odasındaki numunenin optik görünümü, ESRF22'ninID16A ışın hattının özel çevrimiçi video mikroskobu kullanılarak yansıma modunda elde edildi. Elektron veya yumuşak X-ışını mikroskobu, hücreyi yerleştiren buz tabakasının mümkün olduğunca ince olmasını gerektirirken (tipik olarak <0,5 μm), sert X-ışınları (>10 keV) çok daha yüksek penetrasyon derinliği ve daha düşük doz birikimi avantajına sahiptir. Bu nedenle buz kalınlığı daha büyük olabilir, tipik olarak <10 μm hücre de dahil olmak üzere böylece hücre gömme buz kalınlığı birkaç μm olduğunu. Bu, 500 nm kalınlığındaki Si3N4 membranın emilimi dikkate alınarak, numunesiz yoğunlukla karşılaştırıldığında iletimdeki ölçülen X-ışını yoğunluğu ile tahmin edilebilir. Bu buz kalınlığı, mevcut protokolde açıklandığı gibi manuel lekeleme yoluyla elde edilebilir. Newton halkaları bölgesinde, buz kalınlığı daha da ince olabilir (ölçülmez).
Dondurulmuş sulu hücrenin X-ışını floresan elementeşer haritalaması Şekil 7B'de potasyum (K), kükürt (S) ve çinko (Zn) gibi fizyolojik elementlerin temsili dağılımları ile gösterilmiştir. Bu haritalar elemental areal kütlesini (yani elementel yansıtılan kütleyi) temsil eder. Bu durumda yapılmazken, bu tür haritalar örnek öngörülen kitle23tahmin sağlayan X-ışını yayılım tabanlı faz kontrast görüntüleme ile normalize edilebilir. Birçok çalışma tarafından bildirildiği gibi, onların yakın yerli devlet korunmuş hücrelerde son derece diffusible K iyon homojen tüm hücre23,24,16boyunca dağıtılan olduğu kabul edildi . Şekil 7B'deki2B X-ışını floresan elementi görüntülerinde gösterildiği gibi, sıkıca bağlanmış S elementi hücre içinde, K'ye benzer şekilde eşit olarak dağıtılmış ve hücresel kitle profilinin iyi bir tahminini temsil eder. Zn dağılımının çekirdeğinde sitosoldan daha yüksek bir sinyal vardı ve çekirdeği açıkça özetledi. Bu küçük Zn zenginleştirilmiş bölgeler nükleer bölgede mekansal çözünürlük (50 nm) tespit edilebilir unutulmamalıdır.
Mevcut X-ışını nanoprobları veya inşa edilecek olanlar mutlaka kriyojenik yetenekleri barındırmaz. Bu durumda, alt-100 nm mekansal çözünürlüklerde hücrelerin X-ışını floresan görüntüleri almak için en iyi alternatif hücre dalma-dondurma sonra bu protokolde açıklanan bir dondurma-kurutma işlemi gerçekleştirmektir. Şekil 8A, si3N4 membranüzerinde doğrudan kültürlenmiş, dondurularak kurutulmuş birincil fare hipokampal nöronların tipik bir parlak alan mikroskobu görünümünü gösterir. Bu durumda, temiz bir kurutulmuş odada saklanırsa, numuneler 1−2 hafta önceden hazırlanabilir ve ilgi alanlarının kaydı için sıradan bir dik optik mikroskopla gözlemlenebilir. Dondurularak kurutulmuş numune tarafından yakalanıp X-ışını nanoışının altında hasara yol açabileceğinden ortam nemine maruz kalmamaya özen denilmelidir. Bu işlem çok hassas hücrelere (yani nöronal hücrelere) başarıyla uygulandı ve kanser hücreleri gibi diğer daha sağlam hücre tipleriyle daha iyi sonuçlar elde edildi. Dalma-dondurulmuş hücreler gelince, Tüm dondurulmuş kurutulmuş hücre ekranında K, S ve Zn X-ışını floresan görüntüleri yukarıda açıklananlara benzer. 50−100 nm uzamsal çözünürlükte çeşitli dondurulmuş kurutulmuş hücrelerde bulunan elementdağılımlarını temsil ederler. Tüm hücreleri dondurma elementer bütünlüğünü korumak için bir alternatif olsa da, hücre morfolojisi16mükemmel bir koruma pahasına , özellikle hücre zarları.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> Şekil 1: X-ışını floresans nano-analizi için tipik örnek destek. Koruyucu kapsülünde Si3N4 membran desteği. Bu tip substrat hem oda sıcaklığı analizi (düşük sıcaklık ve düşük vakum dondurma-kurutma işlemi takip dalma-dondurma hücresel hazırlık) veya kriyojenik X-ışını floresan analizi için kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> Şekil 2: Hücre tohumlama dan sonra silikon nitrür pencerelerin şematik görünümü. Hücreler doğrudan Si3N4 membran desteğinin poli-L-lizin kaplı düz yüzeyine kültürlenir. Bazen hava kabarcıkları Si3N4 membran desteğinin arka boşluğunda sıkışıp olabilir ve protokolde açıklandığı gibi kaldırılması gerekir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> Şekil 3: In-house sıvı azot Dewar dalma dondurulmuş Si3N4 membran destekler uzun vadeli depolama için 3D baskılı kriyo-box geliştirdi. (A) Kriyo-kutu konteyner ve kapaklar (alt kısmı) ve (B)kilitli kapaklar ile monte kriyo-kutu ile sökülmüş. Kapaklar cımbızla manipüle edilebilir, dönüşle açılabilir veya kilitlenebilir. ESRF ID16A'nın isteği üzerine 3D yazdırma için ayrıntılı bir plan mevcuttur. Tasarım silikon nitrür TEM ızgaraları karşılamak için yapılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> Şekil 4: Si3N 4'te kültürlenmiş hücrelerin blotlama. Önce dalma-dondurma hücre monolayer üzerine kültürlü bir Si3N4 membran amonyum asetat çözeltisi içinde durulanmalıdır(A) ve dikkatle filtre kağıdı kullanılarak lekeli (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> Şekil 5: Otomatik dalma-donma EM-GP makine. (A) Otomatik dalma dondurucu. (B) Cımbızkilitli çevre odası. (C) Etan bir şişebağlı Leica sıvılaştırıcı ile kaplı etan fincan. (D) Sıvılaştırılmış etan dolu siyah fincanı ve vitrifiye Si3N4 membranların LN2'sinde daha fazla depolama için kriyo-kutuyu gösteren dalma-dondurma muhafazası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> Şekil 6: Dondurma-kurutma işlemi için örnek kriyotransfer montajı. (A) Si3N4 membranlar için ilk pirinç alıcı, dondurucu alıcı tedarikçisi tarafından sağlanan numune transfer tutucunun üzerine monte edilir. (B) ve (C) ikinci düz pirinç diskin kapak olarak kullanıldığını ve dondurucu kurutucunun vakum kasasına yerleştirilmesi için soğuk bir tuzak muhafazası görevi görür. (D) Yay yüklü transfer çubuğu ile tam montaj. (E) Si3N4 membran üzerinde yetiştirilen vitrifiye hücresel preparattaşıyan numune tutucu ln2soğutmalı dondurma kurutucuya daha fazla yerleştirilmelidir. Montaj montaj için tüm adımlar LN2 bir Strafor kutusunda yapılır. Netlik için, tüm görüntüler LN yokluğunda üretildi2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> Şekil 7: Sert X-ışını nanoprobumu kullanarak donmuş sulu bir hücrenin kriyo-X-ışını floresan görüntüleri. (A) ESRF ID16A ışın hattının özel optik video mikroskobu kullanılarak yansıma modunda tipik çevrimiçi görünüm. Manuel blotlamadan sonra, dondurulmuş sulu hücrelerin net bir şekilde görüntülenebilen toplam 5−10 m buz kalınlığı elde edildi. Newton halkaları ile bir bölge bile çok daha ince buz göstergesi fark edilir. (B) Fizyolojik elementlerin potasyum (K), kükürt (S) ve çinko (Zn) temsili kriyo-X-ışını floresan hücresel dağılımları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> Şekil 8: Sert X-ışını nanoprobumu kullanarak dondurulmuş nöronal hücrenin x-ışını floresan görüntüleri. (A) Ortaya çıkan dondurularak kurutulmuş primer kortikal nöronal hücrelerin tipik parlak alan mikroskobu görünümü doğrudan Si3N4 membran üzerine kültürlü. Ölçek çubuğu = 200 μm(B) Temsili oda sıcaklığında tek bir dondurulmuş kurutulmuş hipokampal nöron fizyolojik elementlerin potasyum (K), kükürt (S) ve çinko (Zn) dağılımlarını gösteren X-ışını floresan görüntüleri. Ölçek çubuğu = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis at JoVE.com

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Burada silikon nitrür membranlar ve dalma-donma bir senkrotron kriyojenik X-ışını nanoprobun ile X-ışını floresan görüntüleme öncesinde hücre kültürü için bir protokoldür. Sadece oda sıcaklığında nano-analiz yapıldığında, dondurulmuş numuneler daha da dondurularak kurutulabilir. Bunlar hücre içi element bileşimi hakkında bilgi edinmek için kritik adımlardır.

Silikon Nitrür Membranları ve Synchrotron X-ışını Floresan Nano-Analizi için Kriyopreyeüzerine Hücre Kültürü

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Yeni tasarlanmış senkrotron x-ışını floresannano-probları, bir numunenin elementel dağılımının görselleştirilmesine izin verir. X-ışını radyasyon hasarlarını yavaşlatmak için kriyojenik yaklaşımların kullanılması zorunludur. Bu nedenle, hızlı bir cryofixation hücre yapısı ve kimyasal bütünlüğünün korunmasını optimize etmek için dondurulmuş sulu hücreleri elde etmek için gereklidir.Senkrotron çalışmaları için hücresel preparatların özgüllüğü dondurulmuş sulu hücre monokatmanları elde etmek için bu protokolün optimizasyonuna yol açar. Görsel gösteri, ince bir buz tabakası nın içine gömülü tekrarcı kriyosabitlenmiş hücreler elde etmek için hücre monokatmanlı örneklerinin nasıl manipüle edilebildiğini anlamak için önemlidir. Silikon nitrür membran desteği hazırlamak için, membran desteğini içeren kapsülü açın ve desteği hafifçe gevşetmek için kapsülü hafifçe sıkın.Silikon çerçevenin bir köşesini kavramak için ince cımbız kullanın ve çerçevenin ortasındaki silikon nitrür membranına dokunmamaya özen takın ve çerçeveyi laminar akış dolabında açığa çıkarılmış bir Petri kabına yerleştirin. Sonra UV 25-30 dakika membran sterilize. Sterilizasyon sonunda, poli-L-lizin gibi ek faktörü 10 mikrolitre ekleyin.37 santigrat derecede 25 dakika ve nem oranı %5 karbondioksitte kuluçkaya yat. Daha sonra steril 48 kuyulu bir plakanın kuyularını, her kuyu da filtrelenmiş 0,22 mikrometrelik 200 ila 250 mikrolitre ile doldurun. Bir kuyuda art arda üç adet 10 saniyelik durulama ile membranı dikey olarak dikkatlice batırmak için ince cımbız kullanın.Duruladıktan sonra membranı laminar akış kaputunun altında steril 96 kuyulu bir tabağın boş bir kuyuya dikey olarak yerleştirin ve kuruyana kadar bir gecede bırakın. İlgi çeken hücrelerin tohumlanması için, düz tarafı steril dört kuyulu bir plakanın bir kuyuya bakacak şekilde kaplanmış membranı yerleştirin. Membrandokunmadan silikon nitrür membran yüzeyine uygun bir kültür ortamı 10 mikrolitre dört hücre beş kez 10 ekleyin.Damla tüm membranı kaplayacak. Sonra 37 santigrat derece ve nem ile% 5 karbondioksit hücreleri kültür. Hücreler substrat eklemeye başladığında, yavaş yavaş her kuyu nun her membran kapsayan duvaraşağı tam kültür orta bir mililitre ekleyin.Sonra 37 santigrat derece ve nem ile% 5 karbondioksit hücreleri kültür. Hücresel preparatKrasyon kriyommobilizasyonu için, ilk otomatik bir dalma dondurucu açmak ve 37 derece santigrat amonyum asetat tampon ile 12-kuyu plastik plaka kuyuların uygun sayıda doldurun. Membranı durulamadan ve donmadan hemen önce, numuneyi kuvözden çıkarın ve cımbızları açmak için bir çift hızlı serbest cımbızın siyah kelepçe halkasını kullanın.Membran desteğini kavramak ve membranı amonyum asetat tampon çözeltisi içinde dikey olarak yaklaşık beş saniye boyunca batırmak için kilitli olmayan cımbızları kullanın. Fazla arabelleği kaldırmak için, membran desteğinin alt kısmını filtre kağıdına bastırın ve membranın kağıda dokunmasına izin vermeden çerçevenin her iki tarafını filtre kağıdına yerleştirin. Fazla tampon kaldırıldığında, çevre odası nın kapısını açın, cımbızları hızlıca çerkezliğe kaydırın ve odanın kapısını kapatın.Basın blot A dalma. Silikon nitrür membranını tutan cımbız lar hızla kriyojene daldırılır. Dalma donduktan sonra, önceden soğutulmuş forceps ve basın transferi ile transfer kabının kapağını çıkarın.Silikon nitrür membran kriyojen biraz üzerinde hareket ettirilecektir. Hızlı bir tek hareketle, cımbızları terliklerin iç içe geçmesiyle, cımbızları doğrudan azot sıvısı ile dolu transfer kabındaki kriyometrenin boş yuvasına getirin. Sonra membran serbest bırakmak için siyah kelepçe halkası bırakın.Dondurulan hücrelerin dondurulması için, donma kurutma aletinin arka panelinde bulunan rocker anahtarını kullanarak aletin üzerine güç verir. Ekran, numune yüklemeye hazır olduğunda enter tuşuna basmasını gösterir. İlk pirinç parçanın üst kenarının yaklaşık bir ila iki milimetre altında sıvı azot seviyesini tutarak polistiren depolama konteyner tedarikçi tarafından sağlanan örnek transfer tutucu üstüne silikon nitrür membran pirinç tutucu monte.Hücre numunesi tarafını pirinç tutucu numaralı kaviteye bakacak şekilde yerleştirin ve transfer çubuğunu sıvı nitrojen dolu polistiren köpük kutusuna önceden soğutun. Tam montaj kilitlemek için çubuk kullanın, donma kurutma odasının kapağını serbest bırakmak için vakum kırmak için girin, hemen dondurucu odasında örnek aktarmak ve dondurucu kurutucu odası kapağını kapatın. Sonra hemen bastırmaya başlayın donma kurutma döngüsü ile devam etmeye başlayın.Dondurma kurutma döngüsünün sonunda, odayı havalandırmak için dur tuşuna basın ve dondurulmuş kurutulmuş numunelere erişmek için tam montajı çıkarın. Burada tipik bir optik video mikroskop görünümü olarak gösterildiği gibi bir poli-L-lizin kaplı silikon nitrür membran desteği üzerine alt kültürlü dondurulmuş sulu meme kanseri hücre hattı hücreleri gösterilmiştir. Dondurulmuş sulu hücrelerin X-ışını floresan elementer haritalama potasyum, kükürt ve çinko gibi fizyolojik elementlerin dağılımlarını ortaya koymaktadır.Bu temsili örnekte, sıkıca bağlanmış kükürt elementi potasyum için gözlenene benzer bir modelde hücre içinde eşit olarak dağıtılmış ve hücresel kitle profilinin iyi bir tahminini temsil eder. Ancak çinko dağılımı, sitosol ile çekirdek arasında açıkça tanımlanmış bir ayrım ile çekirdek içinde sitosoldan daha yüksek sinyal sergiledi. Dondurularak kurutulmuş birincil fare hipokampal nöronların bu tipik Brightfield mikroskobu görünümünde doğrudan gösterildiği gibi bir silikon nitrür membran kültürlü, hücreler kendi kültür veya koruma yöntemi etkilenmez tipik bir nöral morfoloji sergiler.Dalma-dondurulmuş hücrelerin X-ışını floresan görüntüleme de 50 ila 100 nanometre uzamsal çözünürlükte bu temsili dondurulmuş kurutulmuş hücreler tarafından sergilenen tipik element dağılımları ortaya koymaktadır. Silikon nitrür penceresinin çizilmesi, dalma donduktan sonra mümkün olan en ince buz tabakasını elde etmek için çok önemlidir. Hücrelerin hücre altı düzeyindeki kimyasal bütünlüğünün korunması, hücrelerin metallomunun senkrotron nano-probların yanı sıra diğer mikroanalitik tekniklerle de araştırılmasını sağlar.Tüm senkrotron nano-sonda analizleri kriyojenik sıcaklıkta yapılamayabileceğinden, dondurulmuş sulu hücreler oda sıcaklığında analizlerini kolaylaştırmak için daha da dondurularak kurutulabilir. Sıvı nitrojenle çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanmayı ve her zaman alevlerden uzak bir duman kaputunda etan gazı kullanmayı unutmayın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...