Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) المنح R44GM113545 وP20GM103434.

1. SCV ظروف النمو والتنشيط الفسيولوجي لمسار الإنقاذ
<ol><li>الكشف عن SCV.<ol>
<li>المتتالية P. aeruginosa سلالات PAO1, PAO1ΟpyrD,PAO581, وPAO581ΟpyrD على لوحات العزل ة الزائفة prewarmed (PIA) وتنمو في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. على لوحة النمو حدد عزل مستعمرة واحدة يحتوي على النمط الظاهري SCV (حجم المستعمرة من 1-3...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

كل من SCV وalginate هي علامات المرض الهامة المتورطة في العديد من الالتهابات المزمنة. ولذلك، فإن القدرة على زراعة SCV وكذلك دراسة تنظيم وإنتاج الجينات من قبل P. aeruginosa هو جزء لا يتجزأ من اكتشاف علاجات جديدة لهذه الأمراض المزمنة.
سلالات SCV من الصعب المعروف أن تنمو بسبب معدل نموها ا...

التهابات الرئة المزمنة مع Pseudomonas aeruginosa هي سبب رئيسي للمراضة والوفيات في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF). خلال مرحلة الطفولة المبكرة ، يتم استعمار المرضى من قبل مسببات الأمراض البكتيرية المتعددة بما في ذلك عزل nonmucoid P. aeruginosa1،2. ظهور البديل مستعمرة صغيرة (SCV) يعزل وكذلك عزل المخاطية هو علامة لبداية للالتهابات المزمنة. عزلات SCV هي مقاومة للأدوية عالية3 بسبب معدلات نموها البطيء4، مما يجعلها رادعا شديدا في أفواج العلاج وغيرها من الالتهابات المزمنة5 من قبل P. aeruginosa. وأظهر العمل الذي قام به الأحمر وآخرون6 وجود صلة بين SCV والفيويدي الذي يربطه التمثيل الحيوي دي نوفو بيريميدين. البيريميدين المجاعة، بسبب الطفرات في الجينات المشاركة في إنتاج البيريميدين، أدى إلى النمط الظاهري SCV في سلالة المرجع nonmucoid PAO1 ومشتق مخاطي، PAO581 (PAO1mucA25).
على الرغم من أن الإفراط في إنتاج الجينات هو علامة مرض مهمة لالتهابات الرئة المزمنة في CF ، إلا أنه ليس من الواضح ما إذا كان هناك ارتباط مباشر بين كمية الجينات وأمراض الرئة ، ومن غير الواضح ما إذا كان يمكن استخدام الجينات كعلامة تشخيص للعلاج7. وينظم أساسا إنتاج الجينات من قبل اثنين من operons، وoperon التنظيمية(algumucABCD)8،9 وoperon الاصطناعية الحيوية(algD operon)10،11. وينظم بإحكام إنتاج الجينات من قبل عامل سيغما AlgU9،12 (المعروف أيضا باسم AlgT) وتدهور عامل مكافحة سيغما MucA13. القدرة على رصد إنتاج الجينات في الموقع من عينات البلغم المرضى يمكن أن تساعد في تطوير خيارات علاجية جديدة.
هنا، ونحن نصف حالة النمو الذي يكشف عن وجود SCV الناجمة عن المسوخ التي لا يمكن توليف البيريميدين دي نوفو. مكملات الأوراسيل و / أو السيتوزين ، قاعدة النيتروجين من النيوكليوتيد البيريميدين ، إلى المتوسط ينشط مسار الإنقاذ ، وبالتالي استعادة النمو الطبيعي في المسوخ. ويمكن استخدام طريقة النمو هذه لمسوخ SCV محددة هذه كوسيلة فحص لتحديد الطفرات البيريميدين في عينات المرضى. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش طريقتين للكشف عن وقياس الجينات التي تنتجها ويفرزها P. aeruginosa. الأول هو الطريقة التقليدية14،15،16 من تحلل السكريات باستخدام تركيز عال من الحمض ثم إضافة مؤشر قياس الألوان إلى كمية التركيز في العينة. الطريقة الثانية، التي تم تطويرها في مختبرنا، تستخدم الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة (mAb) تم تطويره بواسطة QED Biosciences. تثبت طريقة ELISA أنها أكثر تحديدًا وحساسية من مُقازحمض البوليتيك وتسمح باستخدام أكثر أمانًا بسبب تجنب حمض الكبريتيك عالي التركيز. مع قدرة ELISA لاستخدامها مباشرة على عينات البلغم المريض لقياس الجينات، يمكن تطويره كأداة تشخيصية رصد لمتابعة كمية الجينات الموجودة في الرئتين في فترات مختلفة من العدوى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

Pseudomonas aeruginosa، وهو عامل ممرض البكتيرية سلبية الغرام الانتهازية ، يمكن أن تنتج الإفراط في الجينات exopolysaccharide مما أدى إلى نمط ظاهري فريد يسمى المخاطية. يرتبط Alginate بالتهابات الرئة المزمنة مما يؤدي إلى سوء التكهن في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF). يمكن أن يساعد فهم المسارات التي تنظم إنتاج الجينات في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة تستهدف تكوين الجينات. نمط ظاهري آخر مرتبط بالمرض هو متغير المستعمرة الصغيرة (SCV). SCV يرجع ذلك إلى بطء نمو البكتيريا وغالبا ما يرتبط مع زيادة المقاومة لمضادات الميكروبات. في هذه الورقة، نظهر أولا طريقة لزراعة شكل محدد وراثيا من P. aeruginosa SCV بسبب الطفرات البيريميدين الحيوي. مكملات من القواعد النيتروجينية، أوراسيل أو السيتوزين، يعيد النمو الطبيعي لهذه المسوخ، مما يدل على وجود مسار الإنقاذ الذي يمسح القواعد الحرة من البيئة. بعد ذلك ، نناقش طريقتين لقياس الجينات البكتيري. وتعتمد الطريقة الأولى على التحلل المائي للسكاريد المتعدد السكاريد إلى مونومر حمض البولينيك متبوعاً بالاشتقاق باستخدام كاشف لوني، وهو الركلازول، في حين تستخدم الطريقة الثانية مادة ELISA على أساس mAb المتاحة تجارياً والمحددة بالجينات. تتطلب كلتا الطريقتين منحنى قياسي للكمية. كما نُظهر أن الطريقة المناعية محددة للقياس الكمي للجينات ويمكن استخدامها لقياس الجينات في العينات السريرية.

يوضح الشكل 1 لوحات PAO1 و PAO581 مع أو بدون حذف في الإطار في الجين الحراري (جين في مسار التخليق الحيوي البيريميدين) الذي ينتج عنه SCV6. تم استعادة متحولة PAO1 SCV إلى النمو الطبيعي استجابة لمكملات uracil(الشكل 1A, B). وعلاوة على ذل...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

هنا ، ونحن نصف شرط النمو لثقافة البديل مستعمرة صغيرة من Pseudomonas aeruginosa. كما وصفنا طريقتين منفصلتين للكشف عن الجينات الثيوبولية الهاريادية المنتَجة التي تنتجها P. aeruginosa وكمية الجينات التي تنتجها P. aeruginosa باستخدام مقادير حمض البوليازول التقليدي ة وجسم مضاد أحادي النسيلة (mAb) قائم على ELISA.

ثقافة البديل مستعمرة صغيرة من Pseudomonas aeruginosa وكمية من Alginate لها

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

المتغير مستعمرة صغيرة أو تقنية SCV يسمح لاختيار ونمو المتغيرات مستعمرة صغيرة من aeruginosa Pseudomonas. الأسلوب هو نهائي جدا ويسمح لاختيار أسهل من الطرق العادية. هذا البروتوكول أيضا تفاصيل أكثر أمنا, طريقة أكثر حساسية ELISA للحصول على كمية alginate بالمقارنة مع طريقة الكربزول حمض أورونيك القياسية, تمكين الكم alginate مباشرة في العينات دون الكي أو معالجة العينة.ومن خلال هذا الإجراء سيكون براندون كيربي، وهو فني مختبر، وروي الأحمر، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. للكشف عن متغير مستعمرة صغيرة أو SCV، خط الأول سلالة P.aeruginosa سلالة PAO1 دلتا PYRD على لوحات PIA ساخنة مسبقا. تنمو سلالات في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.على لوحة النمو، تحديد عزل مستعمرة واحدة التي لديها النمط الظاهري SCV تتميز بحجم مستعمرة من واحد إلى ثلاثة ملليمترات بدلا من حجم المستعمرة العادية من ثلاثة إلى خمسة ملليمترات. إعادة خط المستعمرات المختارة للحصول على عزل نقي من SCV. لتنفيذ التفعيل الفسيولوجي لمسار الإنقاذ، استخدم حلقة تطعيم عقيمة لاختيار مستعمرة SCV من لوحة PIA.خط المستعمرة المختارة على لوحة PIA ساخنة مسبقًا مكمّلة بـ 0.1 ملليمولار أوراسيل. تنمو لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة. لبدء اختبار الكاربزول حمض uronic، وتحديد مستعمرة واحدة من ثقافة نقية من سلالة المطلوب أن يتم اختبارها واختيار مستعمرة باستخدام مسواك معقمة.ضع المسواك في أنبوب اختبار ثقافة يحتوي على خمسة ملليلترات من PIB. تنمو في حاضنة شاكر في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة، أضف aliquot من مرق PIB مثقف على لوحة PIA ساخنة مسبقا.باستخدام موزع الخلايا العقيمة، ونشر مرق على لوحة وتنمو في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. باستخدام وحدة تحكم ماصة والماصات 50 ملليلتر معقمة، إضافة 0.85٪ كلوريد الصوديوم إلى العشب الكبار وجمع العينة عن طريق كشط لوحة باستخدام موزع الخلية. استلهم العينة باستخدام ماصة جديدة 50 ملليلتر ونقلها إلى أنبوب جمع 50 ملليلتر.دوامة العينة على ارتفاع لخلط ووضع العينات على الجليد. لقياس OD600 من العينات، أولا فارغة الطيفي باستخدام ملليلتر واحد من كلوريد الصوديوم 0.85٪. ثم إضافة ملليلتر واحد من العينة إلى cuvette جديدة يمكن التخلص منها وقراءة OD. كرر هذه الخطوة مرتين للحصول على ثلاث مرات من القراءة لكل عينة.الآن إضافة ثلاثة ملليلتر من محلول بورات حمض الكبريتيك في أنابيب الثقافة والسماح للجلوس على الجليد. إضافة 350 ميكرولترات من العينة التي تم جمعها ببطء إلى خليط حمض في أنابيب الاختبار. بعد دوامة لفترة وجيزة على انخفاض، إضافة 100 ميكرولترات من 0.1٪ كاربازول والمحلول الإيثانول إلى خليط عينة حمض.اِكِلَ الأنبوب و الدوامة على الإعداد المتوسط لمدة خمس ثوانٍ. ثم وضع في حمام جاف في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، دوامة الأنابيب لفترة وجيزة على ارتفاع والسماح لتبرد لمدة خمس دقائق.استخدام أنبوب مع 0.85٪ كلوريد الصوديوم كفراغ إلى مقياس الطيف. ثم يضاف ملليلتر واحد من الخليط إلى cuvette نظيفة وقراءة OD من العينات في 530 نانومتر على مقياس الطيف. إعداد منحنى قياسي من خلال قياس OD530 من التخفيفات التسلسلية من تركيزات معروفة من حمض d-mannuronic.كرر مرتين واستخرج معادلة خطية من هذه القراءات. حساب تركيز الحدين في كل عينة باستخدام المنحنى القياسي وتقسيم تركيز الحد من معادلة خطية بواسطة OD600 للحصول على المبلغ الإجمالي من alginate لكل OD600. باستخدام ميكروسيبيت، إضافة 50 ميكرولترات من العينة التي تم جمعها إلى لوحة 96 جيدا غير المعالجة.ثم إضافة 50 ميكرولترات من عازلة طلاء ELISA إلى الآبار. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. باستخدام زجاجة بخ، وغسل آبار لوحة مرتين مع برنامج تلفزيوني-T عن طريق ملء الآبار ومن ثم استنزاف لهم عن طريق التقليب لوحة أكثر.إضافة 200 ميكرولترات من العازلة سد إلى الآبار مع micropipette واحتضان في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وغسل لوحة مرتين مع برنامج تلفزيوني-T كما كان من قبل. ثم إضافة 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية المخففة إلى الآبار واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين.بعد الحضانة، وغسل الآبار لوحة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني-T كما كان من قبل. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المخففة إلى الآبار واحتضانها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد غسل لوحة مرة أخرى ثلاث مرات، واستخدام micropipette لإضافة 100 ميكرولترات من TMB ELISA الحل.احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام عن طريق وضع لوحة في درج أو التفاف في احباط. ثم إضافة 100 ميكرولترات من حل التوقف. استخدم قارئ لوحة لقياس الـ OD عند 450 نانومتر.إنتاج منحنى قياسي من خلال قياس OD450 من التخفيفات التسلسلية من تركيزات معروفة من حمض d-مانيوروك. كرر القياسات مرتين واستخرج معادلة خطية. حساب تركيز الحدين في كل عينة باستخدام المنحنى القياسي وتقسيم تركيز الحدس من المعادلة الخطية بواسطة OD600 للحصول على المبلغ الإجمالي من alginate لكل OD600.يظهر هنا عينات PAO581 و PAO581 مع طفرات في الجينات التي تنظم البيريمدين دي نوفو البيولوجية نمت على PIA و PIA تكملها 0.1 ملليمولر من uracil. وتظهر البيانات أن وجود uracil في وسائل الإعلام يؤدي إلى تحويل سلالة متحولة مرة أخرى إلى mucoidy كما رأينا من قبل إنتاج alginate المستعادة. هنا، تظهر النتائج لمضادات alginate أحادية النسيلة المضادة للجسم القائم على ELISA.وتزرع المستعمرات على لوحات PIA مع arabinose لالتدرابينز للتحريض من المروج PBAD وpHERD-20T plasmid. هي PAO1، PAO1 تحمل التعبير pHERD-20T مع alginate عامل سيغما محددة الرئيسية algU، و PAO1 مع حذف في الإطار من الجين algD في ترميز مفتاح ALGINATE البيولوجية إنزيم الناتج المحلي الإجمالي الناتج المحلي الإجمالي-mannose dehydrogenase. وتقارن هذه البيانات بين مستويات اللا mucoid من alginate مقاسة لـ PAO1 و PAO1 delta algD مقابل مستويات mucoid من alginate مقاسة لـ PAO1 مع pHERD-20T algU.كما تم اختبار مضادات الجينات ELISA على عينات البلغم المريض دون نمو مسبق على لوحات. وأظهرت ثلاث عينات من البلغم CF التي كان نمو P.aeruginosa mucoid alginate يمكن الكشف عنها مقارنة مع اثنين من عينات البلغم المريض التي تحتوي إما غير موكود P.aeruginosa أو أي نمو P.aeruginosa. إعداد منحنيات القياسية للكمية alginate أمر بالغ الأهمية لأن هذا سيسمح لقياس دقيق ودقيق من alginate داخل العينة.إن محلول الحمض المستخدم في طريقة الكرباسول خطيرة جداً، لذا يجب استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة والاحتياطات لضمان السلامة. بعد عزل SCVs، يمكن القيام بمزيد من التنميط الجيني لفهم الطفرات التي تحدث والأمراض المرتبطة بهذه الطفرات بشكل أفضل. يمكن تكييف طريقة ELISA لمراقبة عدوى الرئة المزمنة في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي.وعلاوة على ذلك، يمكن أن تساعد طريقة النمو لدينا في تشخيص العدوى الناجمة عن حالات عدوى محددة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

على المدى الطويل المزمن<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; عدوى مجرى الهواء في الفئران

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

تحديد جينات جديدة ترتبط مع الجينات في الإنتاج<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; استخدام ميني<em&gt; himar1</em&gt; مارينر الطفرات ينقول بوساطة

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

الزائفة الزنجارية المستحثة الرئة الإصابات نموذج

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

النسخ المتماثل لمطلوب، "مكتبة نونريدوندانت" من سلالة الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 ينقول طفرات الإدراج

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...