Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud R44GM113545 og P20GM103434.

1. SCV vækstbetingelser og fysiologiskaktivering af Bjærgning Pathway
<ol><li>Påvisning af SCV.<ol>
<li>Stæs p. aeruginosastammerne PAO1, PAO1ΔpyrD, PAO581 og PAO581ΔpyrD på forvarmede Pseudomonas isolationagarplader (PIA) og vokser ved 37 °C i 48 timer. På vækstpladen identificere en enkelt koloni isolere, der har SCV fænotype (koloni størrelse på 1−3 mm i modsætning til den normale 3−5 mm koloni størrelse).</li>
		<li>Gentag trin 1.1.1 for at opnå et rent isoler...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

Både SCV og alginat er vigtige sygdommarkører involveret i flere kroniske infektioner. Derfor er evnen til at dyrke SCV samt studere regulering og produktion af alginat af P. aeruginosa er en integreret del af opdagelsen af nye behandlinger for disse kroniske sygdomme.
SCV stammer er notorisk vanskelige at vokse på grund af deres langsomme vækstrate4 i forhold til andre P. aeruginosa stammer, som hjælper i deres antimikrobielle resistens<sup class...

Kroniske lungeinfektioner med Pseudomonas aeruginosa er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed hos patienter med cystisk fibrose (CF). I den tidlige barndom, patienter er koloniseret af flere bakterielle patogener herunder nonmucoid isolater af P. aeruginosa1,2. Fremkomsten af den lille koloni variant (SCV) isolater samt mucoid isolater er en markør for debut til kroniske infektioner. SCV isolater er meget resistente3 på grund af deres langsomme vækstrater4, hvilket gør dem en alvorlig afskrækkende i behandlingen regimenter og andre kroniske infektioner5 af P. aeruginosa. Arbejde af Al Ahmar et al.6 viste en sammenhæng mellem SCV og slimhinde forbundet med de novo pyrimidin biosyntese. Pyrimidinsult, på grund af mutationer i gener involveret i pyrimidinproduktion, resulterede i SCV fænotype i nonmucoid referencestammen PAO1 og mucoid derivat, PAO581 (PAO1mucA25).
Selv om alginat overproduktion er en vigtig sygdommarkør for kroniske lungeinfektioner i CF, er det ikke klart, om der er en direkte sammenhæng mellem mængden af alginat og lungepatologi, og det er uklart, om alginat kan bruges som prognosemarkør til behandling7. Alginatproduktionen reguleres hovedsagelig af to operoner, en regulerende operon (algUmucABCD)8,9 og den biosyntetiske operon(algD operon)10,11. Alginatproduktionen reguleres stramt af sigmafaktoren AlgU9,12 (også kendt som AlgT) og nedbrydningen af antisigmafaktoren MucA13. Evnen til at overvåge produktionen af alginat in situ fra patienternes spytprøver kan hjælpe med udviklingen af nye terapeutiske muligheder.
Her beskriver vi en væksttilstand, der registrerer tilstedeværelsen af SCV forårsaget af mutanter, der ikke kan syntetisere pyrimidin de novo. Tilskud af uracil og/eller cytosin, den nitrogenholdige base af pyrimidin nukleotid, til mediet aktiverer bjærgning vej, og dermed genoprette den normale vækst i mutanter. Denne vækstmetode for disse specifikke SCV-mutanter kan anvendes som screeningsmetode til at identificere pyrimidinmutationer i patientprøver. Derudover diskuterer vi to metoder til påvisning og måling af alginat produceret og udskilles af P. aeruginosa. Den første er den traditionelle metode14,15,16 af nedværdigende polysaccharid ved hjælp af en høj koncentration af syre og derefter tilføje en kolorimetrisk indikator til at slukke koncentrationen i prøven. Den anden metode, der er udviklet i vores laboratorium, anvender Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ved hjælp af et antialginat monoklonalt antistof (mAb) udviklet af QED Biosciences. ELISA-metoden viser sig at være mere specifik og følsom end den uronsyreanalyse og giver mulighed for sikrere brug på grund af undgåelse af den stærkt koncentrerede svovlsyre. Med ELISA's evne til at blive brugt direkte på patientspytprøver til at måle alginat kan det udvikles som et overvågningsdiagnostisk værktøj til at følge mængden af alginat, der findes i lungerne i forskellige perioder af infektionen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk Gram-negativ bakteriel patogen, kan overproducere en exopolysaccharide alginat resulterer i en unik fænotype kaldet mucoidy. Alginat er forbundet med kroniske lungeinfektioner resulterer i dårlig prognose hos patienter med cystisk fibrose (CF). Forståelse af de veje, der regulerer produktionen af alginat kan støtte i udviklingen af nye terapeutiske strategier rettet mod alginat dannelse. En anden sygdomsrelateret fænotype er den lille kolonivariant (SCV). SCV skyldes den langsomme vækst af bakterier og ofte forbundet med øget resistens over for antimikrobielle stoffer. I dette papir viser vi først en metode til dyrkning af en genetisk defineret form for P. aeruginosa SCV på grund af pyrimidinbiosyntesemutationer. Tilskud af kvælstofholdige baser, uracil eller cytosin, returnerer den normale vækst til disse mutanter, der viser tilstedeværelsen af en bjærgningvej, der skyller fri baser fra miljøet. Dernæst diskuterer vi to metoder til måling af bakteriel alginat. Den første metode bygger på hydrolyse af polysaccharid til sin uronsyre monomer efterfulgt af fraivatisering med et kromogtisk reagens, carbazole, mens den anden metode anvender en ELISA baseret på en kommercielt tilgængelig, alginat-specifikke mAb. Begge metoder kræver en standardkurve for kvantificering. Vi viser også, at den immunologiske metode er specifik for alginatkvificering og kan anvendes til måling af alginat i de kliniske prøver.

Figur 1 viser plader af PAO1 og PAO581 med eller uden sletning i rammen i pyrdgenet (et gen i pyrimidinbiosyntesevejen), som resulterer i SCV6. PAO1 SCV mutanten blev genoprettet til normal vækst som reaktion på uracil tilskud (figur 1A,B). Desuden blev PAO581ΔpyrDSCV-mutanten returneret til slimhinde med samme uracilbehandling, fordi moderstammen PAO581 har en yderlig...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Her beskriver vi en vækst betingelse for at kultur den lille koloni variant af Pseudomonas aeruginosa. Vi beskriver også to separate metoder til påvisning og kvantificering af exopolysaccharid alginat produceret af P. aeruginosa ved hjælp af en traditionel uroonsyre carbazole assay og en alginat-specifik monoklonal antistof (mAb) baseret ELISA.

Kultur af små koloni variant af Pseudomonas aeruginosa og kvantificering af sin Alginat

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

Den lille kolonivariant eller SCV-teknik giver mulighed for udvælgelse og vækst af små kolonivarianter af Pseudomonas aeruginosa. Metoden er meget definitiv og giver mulighed for lettere udvælgelse end normale metoder. Denne protokol beskriver også en sikrere og mere følsom ELISA-metode til alginatsanktificering sammenlignet med standard uronsyre carbazolmetoden, hvilket muliggør direkte alginatkvantificering i prøver uden ætsning eller prøvemanipulation.Demonstration af proceduren vil være Brandon Kirby, en lab tekniker, og Roy Al Ahmar, en kandidat studerende fra mit laboratorium. For at detektere den lille kolonivariant eller SCV skal P.aeruginosa-stammen PAO1 delta PYRD på forvarmte PIA-plader registreres. Dyrk stammerne ved 37 grader Celsius i 48 timer.På vækstpladen skal du identificere en enkelt koloniisoler, der har SCV-fænotypen karakteriseret ved en kolonistørrelse på en til tre millimeter i modsætning til den normale kolonistørrelse på tre til fem millimeter. Re-streak de valgte kolonier for at opnå en ren isolat af SCV. For at udføre fysiologisk aktivering af bjærgningsvejen skal du bruge en steril vaccinationssløjfe til at vælge SCV-kolonien fra PIA-pladen.Streak den valgte koloni på en forvarmret PIA plade suppleret med 0,1 millimolar uracil. Dyrk pladen ved 37 grader Celsius i 24 til 48 timer. For at begynde uronic syre carbazole assay, identificere en enkelt koloni fra en ren kultur af den ønskede stamme, der skal testes og vælge kolonien ved hjælp af en steril tandstikker.Tandstikkeren anbringes i et kulturagensglas med fem milliliter PIB. Vokse i en shaker inkubator ved 37 grader Celsius i 24 timer. Efter inkubation, tilsæt en aliquot af den kultiverede PIB bouillon på en forvarmret PIA plade.Ved hjælp af en steril celle spreder, sprede bouillon over pladen og vokse ved 37 grader Celsius i 24 timer. Ved hjælp af en pipettestyring og en steril 50 milliliterpipette tilsættes 0,85 % natriumchlorid til den voksne plæne, og prøven opsammes ved at skrabe pladen ved hjælp af en cellespreder. Der skal aspirere prøven med en frisk pipette på 50 milliliter, og den overføres til et 50 milliliteropsamlingsrør.Vortex prøven på høj til at blande og placere prøverne på is. For at måle OD600 af prøverne skal spektrofotometeret først tømmes med en milliliter 0,85 % natriumchlorid. Derefter tilsættes en milliliter af prøven til en ny engangs cuvette og læse OD. Gentag dette trin to gange for at få en tre eksemplarer af læser for hver prøve.Tilsæt nu tre milliliter svovlsyrebomopløsning i kulturrør og lad sidde på is. Der tilsættes langsomt 350 mikroliter af den indsamlede prøve til syreblandingen i reagensglassene. Efter kort vortexing på lav, tilsættes 100 mikroliter af 0,1% carbazol og ethanol opløsning til syre prøve blandingen.Cap røret og vortex på medium indstilling i fem sekunder. Derefter sted i et tørt bad ved 55 grader Celsius i 30 minutter. Efter inkubation, vortex rørene kort på høj og lad det køle af i fem minutter.Brug røret med 0,85% natriumchlorid som en blind for spektrofotometeret. Derefter tilsættes en milliliter af blandingen til en ren kuvette og læse OD af prøverne på 530 nanometer på et spektrofotometer. Der forbered en standardkurve ved at måle OD530 af serielle fortyndinger af kendte koncentrationer af d-mannronsyre.Gentag to gange og udtrække en lineær ligning fra disse aflæsninger. Koncentrationen af alginatet i hver prøve beregnes ved hjælp af standardkurven, og alginatkoncentrationen divideres med den lineære ligning med OD600 for at opnå den samlede mængde alginat pr. OD600. Ved hjælp af en mikropipette tilsættes 50 mikroliter af den indsamlede prøve til en ubehandlet 96-brøndplade.Derefter tilsættes 50 mikroliter AF ELISA belægningsbuffer til brøndene. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i to timer. Brug en sprøjteflaske til at vaske pladens brønde to gange med PBS-T ved at fylde brøndene og derefter tømme dem ved at vende pladen over.Tilføj 200 mikroliter af blokerende buffer til brøndene med en mikropipette og inkuberes ved fire grader Celsius natten over. Den næste dag vaskes pladen to gange med PBS-T som før. Derefter tilsættes 100 mikroliter af fortyndet primært antistof til brøndene og inkuberes ved 37 grader Celsius i en til to timer.Efter inkubation vaskes pladens brønde tre gange med PBS-T som før. Dernæst tilsættes 100 mikroliter af fortyndet sekundært antistof til brøndene og inkuberes ved 37 grader Celsius i en til to timer. Efter vask af pladen igen tre gange, skal du bruge en mikropipette til at tilføje 100 mikroliter TMB ELISA opløsning.Pladen inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke ved at anbringe pladen i en skuffe eller pakke ind i folie. Derefter tilsættes 100 mikroliter stopopløsning. Brug en pladelæser til at måle OD ved 450 nanometer.Frembring en standardkurve ved at måle OD450 af serielle fortyndinger af kendte koncentrationer af d-mannronsyre. Gentag målingerne to gange, og udtræk en lineær ligning. Koncentrationen af alginatet i hver prøve beregnes ved hjælp af standardkurven, og alginatkoncentrationen divideres med den lineære ligning med OD600 for at opnå den samlede mængde alginat pr. OD600.Vist her er prøver af PAO581 og PAO581 med mutationer i gener, der regulerer pyrimidin de novo biosyntese dyrket på PIA og PIA suppleret med 0,1 millimolar uracil. Dataene viser, at tilstedeværelsen af uracil i medierne resulterer i omdannelsen af den mutante stamme tilbage til mucoidy som set af den restaurerede alginatproduktion. Her vises resultaterne for den antialalmonstriske antistofbaserede ELISA.Kolonier dyrkes på PIA plader med arabinose til induktion af PBAD promotor og pHERD-20T plasmid. Vist er PAO1, PAO1 bærer udtrykket plasmid pHERD-20T med de vigtigste alginat specifikke sigma faktor algU, og PAO1 med en in-frame sletning af algD genet i kodning af de vigtigste alginat biosyntetiske enzymet BNP-mannose dehydrogenase. Disse data sammenligner de ikke-mucoidniveauer af alginat, der måles for PAO1 og PAO1 delta algD, i forhold til de mucoidniveauer af alkonit, der måles for PAO1 med pHERD-20T algU.Antialginat ELISA blev også testet på patientens spytprøver uden forudgående vækst på plader. Tre CF spytprøver, der havde vækst af mucoid P.aeruginosa, viste påviseligt alginat sammenlignet med to patientsputumprøver, der indeholdt enten ikke-mucoid P.aeruginosa eller ingen P.aeruginosa vækst. Udarbejdelsen af standardkurverne til alginatkvantificeringen er meget afgørende, da dette vil give mulighed for en præcis og nøjagtig måling af alginat i prøven.Den syreopløsning, der anvendes i carbazolmetoden, er meget farlig, så der skal anvendes passende personlige værnemidler, og der skal anvendes forholdsregler for at garantere sikkerheden. Efter isolering af SUV'er kan der gøres yderligere genetisk profilering for bedre at forstå mutationer, der opstår, og den patogenicitet, der er forbundet med sådanne mutationer. ELISA-metoden kan tilpasses til overvågning af kronisk lungeinfektion hos patienter med cystisk fibrose.Desuden kan vores vækstmetode hjælpe med at diagnosticere infektioner forårsaget af specifikke SUV'er.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langtids kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftvejsinfektion i mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifikation af nye gener forbundet med Alginat Produktion i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Brug Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-medieret mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering af en High-throughput Opsætning til screening små molekyler, der modulerer c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Dyrkning af makrofag kolonistimulerende faktor differentierede humane monocytafledte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering af bestilt, Nonredundant bibliotek af Pseudomonas aeruginosa stamme PA14 Transposon indsættelse mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metoder til påvisning af cytotoksiske Amyloids følgende infektion af pulmonal endotelceller af Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...