Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les subventions R44GM113545 et P20GM103434 des National Institutes of Health (NIH).

1. Conditions de croissance du CVS et activation physiologique de la voie de sauvetage
<ol><li>Détection du VCS.<ol>
<li>Streak le P. aeruginosa souches PAO1, PAO1-pyrD, PAO581, et PAO581-pyrD sur préwarmed Pseudomonas isolation agar plaques (PIA) plaques et de croître à 37 oC pendant 48 h. Sur la plaque de croissance, identifier un seul isolat de colonie qui a le phénotype SCV (taille de la colonie de 1 à 3 mm par opposition à la taille normale de la colonie de 3 à 5 mm).</l...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

Le VCS et l’alginate sont des marqueurs de maladie importants impliqués dans plusieurs infections chroniques. Par conséquent, la capacité de cultiver le VHC ainsi que d’étudier la régulation et la production d’alginate par P. aeruginosa fait partie intégrante de la découverte de nouveaux traitements pour ces maladies chroniques.
Les souches de VCS sont notoirement difficiles à cultiver en raison de leur taux de croissance lent4 par rapport à d’...

Les infections pulmonaires chroniques avec Pseudomonas aeruginosa sont une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les patients atteints de fibrose kystique (FK). Pendant la petite enfance, les patients sont colonisés par de multiples agents pathogènes bactériens, y compris des isolats nonmucoïdes de P. aeruginosa1,2. L’émergence des isolats de la petite colonie (SCV) ainsi que des isolats mucoïdes est un marqueur pour l’apparition d’infections chroniques. Les isolats SCV sont très résistants aux médicaments3 en raison de leur faible taux de croissance4, ce qui les rend un moyen de dissuasion sévère dans les régiments de traitement et d’autres infections chroniques5 par P. aeruginosa. Les travaux d’Al Ahmar et coll.6 ont montré un lien entre le VHC et la mucoidy lié par la biosynthèse de novo pyrimidine. La famine de pyrimidine, due aux mutations dans les gènes impliqués dans la production de pyrimidine, a eu comme conséquence le phénotype de SCV dans la souche de référence nonmucoid PAO1 et le dérivé mucoid, PAO581 (PAO1mucA25).
Même si la surproduction d’alginate est un marqueur important de la maladie pour les infections pulmonaires chroniques dans les fc, il n’est pas clair s’il existe une corrélation directe entre la quantité d’alginate et la pathologie pulmonaire, et il n’est pas clair si l’alginate peut être utilisé comme marqueur de pronostic pour le traitement7. La production d’alginate est principalement réglementée par deux opopons, un opperon réglementaire (algUmucABCD)8,9 et l’opéron biosynthétique(algd opéron)10,11. La production d’alginate est étroitement réglementée par le facteur sigma AlgU9,12 (également connu sous le nom AlgT) et la dégradation du facteur anti-sigma MucA13. La capacité de surveiller la production d’alginate in situ à partir des échantillons d’écrachats des patients peut aider au développement de nouvelles options thérapeutiques.
Ici, nous décrivons une condition de croissance qui détecte la présence de VCS causée par des mutants qui ne peuvent pas synthétiser la pyrimidine de novo. La supplémentation de l’uracil et/ou de la cytosine, la base azotée du nucléotide de pyrimidine, au milieu active la voie de récupération, rétablissant ainsi la croissance normale chez les mutants. Cette méthode de croissance pour ces mutants spécifiques de SCV peut être employée comme méthode de criblage pour identifier des mutations de pyrimidine dans des échantillons patients. En outre, nous discutons deux méthodes pour la détection et la mesure de l’alginate produit et sécrété par P. aeruginosa. La première est la méthode traditionnelle14,15,16 de dégrader le polysaccharide en utilisant une forte concentration d’acide, puis en ajoutant un indicateur colorimétrique pour quantifier la concentration dans l’échantillon. La deuxième méthode, développée en laboratoire, utilise l’Analyse immunosorbent enzymatique (ELISA) à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-alginate (mAb) développé par QED Biosciences. La méthode ELISA s’avère plus spécifique et plus sensible que l’indice d’acide uronique et permet une utilisation plus sûre en raison de l’évitement de l’acide sulfurique très concentré. Avec la capacité de l’ELISA d’être utilisé directement sur les échantillons d’émoi du patient pour mesurer l’alginate, il peut être développé comme un outil de diagnostic de surveillance pour suivre la quantité d’alginate présente dans les poumons à différentes périodes de l’infection.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène bactérien gram-négatif opportuniste, peut surproduire un alginate exopolysaccharide résultant en un phénotype unique appelé mucoidy. L’alginate est lié aux infections pulmonaires chroniques ayant pour résultat le pronostic pauvre dans les patients présentant la mucoviscidose (CF). Comprendre les voies qui régulent la production d’alginate peut aider à l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la formation d’alginate. Un autre phénotype lié à la maladie est la variante de la petite colonie (CVC). Le VCS est dû à la croissance lente des bactéries et souvent associé à une résistance accrue aux antimicrobiens. Dans cet article, nous montrons d’abord une méthode de culture d’une forme génétiquement définie de P. aeruginosa SCV due aux mutations de biosynthèse de pyrimidine. La supplémentation des bases azotales, uracil ou cytosine, retourne la croissance normale à ces mutants, démontrant la présence d’une voie de récupération qui récupère les bases libres de l’environnement. Ensuite, nous discutons deux méthodes pour la mesure de l’alginate bactérien. La première méthode repose sur l’hydrolyse du polysaccharide à son monomère d’acide uronique suivie d’une dérivation avec un réactif chromogénique, le carbazole, tandis que la seconde méthode utilise un ELISA basé sur un mAb disponible dans le commerce, spécifique à l’alginate. Les deux méthodes nécessitent une courbe standard pour la quantitation. Nous montrons également que la méthode immunologique est spécifique pour la quantification d’alginate et peut être employée pour la mesure de l’alginate dans les spécimens cliniques.

La figure 1 montre des plaques de PAO1 et PAO581 avec ou sans suppression dans le cadre dans le gène pyrD (un gène dans la voie de biosynthèse de la pyrimidine) qui a comme conséquence SCV6. Le mutant PAO1 SCV a été rétabli à la croissance normale en réponse à la supplémentation d’uracil (figure 1A,B). En outre, le mutant PAO581pyrDSCV a été retourné à la...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Ici, nous décrivons une condition de croissance à la culture de la variante petite colonie de Pseudomonas aeruginosa. Nous décrivons également deux méthodes séparées pour la détection et la quantitation de l’alginate d’exopolysaccharide produit par P. aeruginosa utilisant un test traditionnel de carbazole d’acide uronique et un anticorps monoclonal alginate-spécifique (mAb) basé ELISA.

Culture de la petite colonie Variante de Pseudomonas aeruginosa et Quantitation de son Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

La variante de petite colonie ou technique SCV permet la sélection et la croissance de petites variantes de colonie de Pseudomonas aeruginosa. La méthode est très définitive et permet une sélection plus facile que les méthodes normales. Ce protocole détaille également une méthode ELISA plus sûre et plus sensible pour la quantification de l’alginate par rapport à la méthode standard de carbazole acide uronique, permettant la quantification directe de l’alginate dans les échantillons sans cautérisation ni manipulation d’échantillon.Brandon Kirby, technicien de laboratoire, et Roy Al Ahmar, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontreront la procédure. Pour détecter la variante de petite colonie ou SCV, première strie de la souche P.aeruginosa PAO1 delta PYRD sur des plaques PIA préchauffées. Faire pousser les souches à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.Sur la plaque de croissance, identifier un seul isolat de colonie qui a le phénotype de SCV caractérisé par une taille de colonie de un à trois millimètres par opposition à la taille normale de la colonie de trois à cinq millimètres. Resserrons les colonies sélectionnées pour obtenir un isolat pur du CVS. Pour effectuer l’activation physiologique de la voie de récupération, utilisez une boucle stérile d’inoculation pour choisir la colonie de SCV à partir de la plaque PIA.Strier la colonie sélectionnée sur une plaque PIA préchauffée complétée par un uracil millimolaire de 0,1 millimlaire. Faire pousser la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. Pour commencer l’analyse de carbazole à l’acide uronique, identifiez une seule colonie à partir d’une culture pure de la souche désirée à tester et choisissez la colonie à l’aide d’un cure-dent stérile.Placez le cure-dent dans un tube à essai de culture contenant cinq millilitres de PIB. Poussez dans un incubateur shaker à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, ajouter un aliquot du bouillon PIB cultivé sur une plaque PIA préchauffée.À l’aide d’un épandeur stérile de cellules, étendre le bouillon sur la plaque et croître à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. À l’aide d’un contrôleur de pipette et d’une pipette stérile de 50 millilitres, ajouter 0,85 % de chlorure de sodium à la pelouse adulte et recueillir l’échantillon en raclant la plaque à l’aide d’un épandeur cellulaire. Aspirer l’échantillon à l’aide d’une pipette fraîche de 50 millilitres et transférer dans un tube de collecte de 50 millilitres.Vortex l’échantillon à haute hauteur pour mélanger et placer les échantillons sur la glace. Pour mesurer l’OD600 des échantillons, videz d’abord le spectrophotomètre à l’aide d’un millilitre de chlorure de sodium à 0,85 %. Ajouter ensuite un millilitre de l’échantillon à une nouvelle cuvette jetable et lire l’OD. Répétez cette étape deux fois pour obtenir un triplicate de lecture pour chaque échantillon.Maintenant, ajoutez trois millilitres de la solution de borate acide sulfurique dans les tubes de culture et laissez reposer sur la glace. Ajouter lentement 350 microlitres de l’échantillon prélevé au mélange acide dans les tubes à essai. Après avoir brièvement vortexing sur faible, ajouter 100 microlitres de 0,1%carbazole et solution d’éthanol au mélange d’échantillons acides.Caper le tube et le vortex sur le réglage moyen pendant cinq secondes. Ensuite, placez-le dans un bain sec à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, vortex les tubes brièvement à haute hauteur et laisser refroidir pendant cinq minutes.Utilisez le tube avec du chlorure de sodium à 0,85 % comme blanc jusqu’au spectrophotomètre. Ajouter ensuite un millilitre du mélange à une cuvette propre et lire l’OD des échantillons à 530 nanomètres sur un spectrophotomètre. Préparez une courbe standard en mesurant l’OD530 des dilutions périodiques des concentrations connues d’acide d-mannuronique.Répétez deux fois et extrayez une équation linéaire de ces lectures. Calculer la concentration de l’alginate dans chaque échantillon à l’aide de la courbe standard et diviser la concentration d’alginate de l’équation linéaire par OD600 pour obtenir la quantité totale d’alginate par OD600. À l’aide d’une micropipette, ajouter 50 microlitres de l’échantillon prélevé à une plaque non traitée de 96 puits.Ajouter ensuite 50 microlitres de tampon de revêtement ELISA aux puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux heures. À l’aide d’une bouteille de gicler, laver les puits de la plaque deux fois avec du PBS-T en remplissant les puits, puis en les drainant en renversant la plaque.Ajouter 200 microlitres de tampon de blocage aux puits avec une micropipette et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lavez la plaque deux fois avec PBS-T comme avant. Ajouter ensuite 100 microlitres d’anticorps primaires dilués aux puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures.Après l’incubation, laver les puits de la plaque trois fois avec du PBS-T comme avant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’anticorps secondaires dilués aux puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures. Après avoir lavé la plaque à nouveau trois fois, utilisez une micropipette pour ajouter 100 microlitres de solution TMB ELISA.Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité en plaçant la plaque dans un tiroir ou en l’enveloppant dans du papier d’aluminium. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution stop. Utilisez un lecteur de plaque pour mesurer l’OD à 450 nanomètres.Produire une courbe standard en mesurant l’OD450 des dilutions périodiques des concentrations connues d’acide d-mannuronique. Répétez les mesures deux fois et extrayez une équation linéaire. Calculer la concentration de l’alginate dans chaque échantillon à l’aide de la courbe standard et diviser la concentration d’alginate de l’équation linéaire par OD600 pour obtenir la quantité totale d’alginate par OD600.On y voit des échantillons de PAO581 et de PAO581 avec des mutations dans les gènes régulant la pyrimidine de novo biosynthèse cultivée sur PIA et PIA complétées par 0,1 millimolaire d’uracil. Les données montrent que la présence d’uracil dans les médias entraîne la conversion de la souche mutante en mucoïde comme le montre la production restaurée d’alginate. Ici, les résultats sont montrés pour l’anti-alginate à base d’anticorps monocoque ELISA.Les colonies sont cultivées sur des plaques PIA avec arabinose pour l’induction du promoteur PBAD et du plasmide pHERD-20T. Sont montrés PAO1, PAO1 portant l’expression plasmide pHERD-20T avec l’alginate principal facteur sigma spécifique algU, et PAO1 avec une suppression dans le cadre du gène algD dans le codage de l’enzyme biosynthétique clé GDP-mannose dehydrogenase. Ces données comparent les niveaux non mucoïdes d’alginate mesurés pour l’algD du delta PAO1 et PAO1 par rapport aux niveaux mucoïdes d’alginate mesurés pour pao1 avec pHERD-20T algU.L’ELISA anti-alginate a également été testé sur des échantillons d’expectorations de patients sans croissance préalable sur les plaques. Trois échantillons d’expectoration de CF qui ont eu la croissance du mucoid P.aeruginosa ont montré l’alginate détectable comparé à deux échantillons d’expectoration patient qui ont contenu le P.aeruginosa non mucoïde ou aucune croissance de P.aeruginosa. La préparation des courbes standard pour la quantification de l’alginate est très cruciale car cela permettra une mesure précise et précise de l’alginate dans l’échantillon.La solution acide utilisée dans la méthode carbazole sont très dangereuses, de sorte que l’équipement de protection individuelle approprié et les précautions doivent être utilisés pour assurer la sécurité. Après l’isolement des VS, d’autres profils génétiques peuvent être effectués pour mieux comprendre les mutations qui se produisent et la pathogénie associée à de telles mutations. La méthode ELISA peut être adaptée pour surveiller l’infection pulmonaire chronique chez les patients atteints de fibrose kystique.En outre, notre méthode de croissance pourrait aider à diagnostiquer les infections causées par des VSS spécifiques.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture des modèles Pseudomonas aeruginosa Les biofilms Cultivé sur le Live cellules des voies respiratoires de l&#39;homme

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Recherche

Immunologie et infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa et le biofilm Saccharomyces cerevisiae en cellules à flux

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Isolement des ARN Pseudomonas aeruginosa La colonisation du tractus gastro-intestinal murin

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Chronique à long terme<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infection des voies respiratoires chez les souris

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification de nouveaux gènes associés à la production d&#39;alginate dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Utilisation de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenèse Mariner Transposon médiation

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Réplication de l’ordonné, bibliothèque non redondante de la souche Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon Mutants d’Insertion

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Méthodes pour détecter les cytotoxiques amyloïdes suivant Infection de pulmonaire cellules endothéliales par Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...