Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
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Diese Arbeit wurde von den Nationalen Instituten für Gesundheit (NIH) Stipendien R44GM1113545 und P20GM103434 unterstützt.

1. SCV-Wachstumsbedingungen und physiologische Aktivierung des Bergungsweges
<ol><li>Erkennung von SCV.<ol>
<li>Streichen Sie die P. aeruginosa-Stämme PAO1,PAO1-PyrD, PAO581 und PAO581-pyrD auf vorgewärmten Pseudomonas-Isolationsagarplatten (PIA) und wachsen bei 37 °C für 48 h. Auf der Wachstumsplatte ein einzelnes Kolonieisolat mit dem SCV-Phänotyp (Koloniegröße von 1 x 3 mm im Gegensatz zur normalen Koloniegröße von 3 x 5 mm) zu identifizieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie S...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

Sowohl SCV als auch Alginat sind wichtige Krankheitsmarker, die an mehreren chronischen Infektionen beteiligt sind. Daher ist die Fähigkeit, SCV zu züchten sowie die Regulation und Produktion von Alginat durch P. aeruginosa zu untersuchen, ein wesentlicher Bestandteil der Entdeckung neuartiger Behandlungen für diese chronischen Krankheiten.
SCV-Stämme sind aufgrund ihrer langsamen Wachstumsrate4 im Vergleich zu anderen P. aeruginosa-Stämmen, die i...

Chronische Lungeninfektionen mit Pseudomonas aeruginosa sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit Mukoviszidose (CF). In der frühen Kindheit werden die Patienten von mehreren bakteriellen Krankheitserregern besiedelt, einschließlich nichtmucoiden Isolaten von P. aeruginosa1,2. Die Entstehung der kleinen Kolonievariante (SCV) Isolate sowie Schleimhautisolate ist ein Marker für den Beginn chronischer Infektionen. SCV-Isolate sind aufgrund ihrer langsamen Wachstumsratenhochresistent3 , was sie zu einer schweren Abschreckung in den Behandlungsregimentern und anderen chronischen Infektionen5 von P. aeruginosamacht. Arbeiten von Al Ahmar et al.6 zeigten einen Zusammenhang zwischen SCV und Schleimhaut, der durch de novo pyrimidin Biosynthese verbunden ist. Pyrimidin-Hunger aufgrund von Mutationen in Genen, die an der Pyrimidinproduktion beteiligt waren, führte zu Einem SCV-Phänotyp im Nichtmucoid-Referenzstamm PAO1 und dem Schleimhautderivat PAO581 (PAO1mucA25).
Obwohl Alginat-Überproduktion ein wichtiger Krankheitsmarker für chronische Lungeninfektionen bei CF ist, ist es nicht klar, ob es einen direkten Zusammenhang zwischen der Menge an Alginat und Lungenpathologie gibt, und es ist unklar, ob Alginat als Prognosemarker fürdieBehandlung 7 verwendet werden kann. Die Alginatproduktion wird hauptsächlich durch zwei Operonen reguliert, einen regulatorischen Operon (algUmucABCD)8,9 und den biosynthetischen Operon (algD operon)10,11. Die Alginatproduktion wird durch den Sigma-Faktor AlgU9,12 (auch bekannt als AlgT) und den Abbau des Anti-Sigma-Faktors MucA13streng reguliert. Die Fähigkeit, die Produktion von Alginat vor Ort aus den Sputumproben der Patienten zu überwachen, kann bei der Entwicklung neuer therapeutischer Optionen helfen.
Hier beschreiben wir einen Wachstumszustand, der das Vorhandensein von SCV erkennt, das durch Mutanten verursacht wird, die pyrimidin de novo nicht synthetisieren können. Die Ergänzung von Uracil und/oder Cytosin, der stickstoffhaltigen Basis von Pyrimidinnukleotid, zum Medium aktiviert den Bergungsweg und stellt so das normale Wachstum von Mutanten wieder her. Diese Wachstumsmethode für diese spezifischen SCV-Mutationen kann als Screening-Methode zur Identifizierung von Pyrimidin-Mutationen in Patientenproben verwendet werden. Darüber hinaus diskutieren wir zwei Methoden zum Nachweis und zur Messung von Alginat, das von P. aeruginosahergestellt und abgesondert wurde. Die erste ist die traditionelle Methode14,15,16 der Abbau des Polysaccharids mit einer hohen Konzentration von Säure und dann Hinzufügen eines kolorimetrischen Indikators, um die Konzentration in der Probe zu quantitieren. Die zweite Methode, die in unserem Labor entwickelt wurde, nutzt den Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) mit einem von QED Biosciences entwickelten monoklonalen Antialginat-Antikörper (mAb). Die ELISA-Methode erweist sich als spezifischer und empfindlicher als der Uronsäure-Assay und ermöglicht eine sicherere Anwendung durch die Vermeidung der hochkonzentrierten Schwefelsäure. Mit der Fähigkeit des ELISA, direkt auf Patientensputumproben verwendet zu werden, um Alginat zu messen, kann es als Überwachungs-Diagnose-Tool entwickelt werden, um die Menge an Alginat in der Lunge in verschiedenen Perioden der Infektion zu verfolgen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

Pseudomonas aeruginosa, ein opportunistischer gramnegativer bakterieller Erreger, kann ein Exopolysaccharidalginat überproduzieren, was zu einem einzigartigen Phänotyp namens Schleimhaut führt. Alginat ist mit chronischen Lungeninfektionen verbunden, was zu einer schlechten Prognose bei Patienten mit Mukoviszidose (CF) führt. Das Verständnis der Wege, die die Produktion von Alginat regulieren, kann bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien helfen, die auf die Alginatbildung abzielen. Ein weiterer krankheitsbedingter Phänotyp ist die kleine Kolonievariante (SCV). SCV ist auf das langsame Wachstum von Bakterien zurückzuführen und oft mit einer erhöhten Resistenz gegen antimikrobielle Mittel verbunden. In diesem Beitrag zeigen wir zunächst eine Methode zur Kultivierung einer genetisch definierten Form von P. aeruginosa SCV aufgrund von Pyrimidin-Biosynthesemutationen. Ergänzung der stickstoffhaltigen Basen, Uracil oder Cytosin, gibt das normale Wachstum zu diesen Mutanten, zeigt das Vorhandensein eines Bergungsweges, der freie Basen aus der Umwelt auffängt. Als nächstes diskutieren wir zwei Methoden zur Messung von bakteriellem Alginat. Das erste Verfahren beruht auf der Hydrolyse des Polysaccharids auf sein Uronsäuremonomer, gefolgt von der Derivatisierung mit einem chromogenen Reagenz, Carbazol, während das zweite Verfahren einen ELISA verwendet, der auf einem kommerziell erhältlichen, alginatspezifischen mAb basiert. Beide Methoden erfordern eine Standardkurve für die Quantifizierung. Wir zeigen auch, dass die immunologische Methode spezifisch für die Alginatquantifizierung ist und für die Messung von Alginat in den klinischen Proben verwendet werden kann.

Abbildung 1 zeigt Platten von PAO1 und PAO581 mit oder ohne Inframe-Deletion im PyrD-Gen (ein Gen im Pyrimidin-Biosyntheseweg), das zu SCV6führt. Die PAO1 SCV Mutante wurde auf normales Wachstum als Reaktion auf Uracil-Supplementierung wiederhergestellt (Abbildung 1A,B). Darüber hinaus wurde die PAO581-pyrD-SCV-Mutation mit der gleichen Uracil-Behandlung in die Schleimhaut zurü...

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Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Hier beschreiben wir einen Wachstumszustand, um die kleine Kolonievariante von Pseudomonas aeruginosazu kulturen. Wir beschreiben auch zwei separate Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung des von P. aeruginosa hergestellten Exopolysaccharidalginats mit einem traditionellen Uronsäure-Carbazol-Assay und einem alginatspezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) basierenden ELISA.

Kultur der kleinen Kolonie Variante von Pseudomonas aeruginosa und Quantitation seines Alginats

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

Die kleine Kolonievariante oder SCV-Technik ermöglicht die Auswahl und das Wachstum kleiner Kolonievarianten von Pseudomonas aeruginosa. Die Methode ist sehr definitiv und ermöglicht eine einfachere Auswahl als normale Methoden. Dieses Protokoll beschreibt auch eine sicherere, empfindlichere ELISA-Methode zur Alginatquantifizierung im Vergleich zur Standard-Uronsäure-Carbazol-Methode, die eine direkte Alginatquantifizierung in Proben ohne Kautery oder Probenmanipulation ermöglicht.Das Verfahren wird Brandon Kirby, ein Labortechniker, und Roy Al Ahmar, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Um die kleine Kolonievariante oder SCV zu erkennen, streift zuerst der P.aeruginosa-Stamm PAO1 Delta PYRD auf vorgewärmten PIA-Platten. Wachsen Sie die Stämme bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden.Identifizieren Sie auf der Wachstumsplatte ein einzelnes Kolonieisolat, das den SCV-Phänotyp hat, der sich durch eine Koloniegröße von ein bis drei Millimetern im Gegensatz zur normalen Koloniegröße von drei bis fünf Millimetern auszeichnet. Die ausgewählten Kolonien werden erneut entdeckt, um ein reines Isolat des SCV zu erhalten. Um die physiologische Aktivierung des Bergungswegs durchzuführen, verwenden Sie eine sterile Impfschleife, um die SCV-Kolonie aus der PIA-Platte zu wählen.Streichen Sie die ausgewählte Kolonie auf einer vorgewärmten PIA-Platte, ergänzt mit 0,1 Millimolar Uracil. Wachsen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden. Um den Uronsäure-Carbazol-Test zu beginnen, identifizieren Sie eine einzelne Kolonie aus einer reinen Kultur der gewünschten Sorte, die getestet werden soll, und wählen Sie die Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher.Legen Sie den Zahnstocher in ein Kultur-Reagenzglas mit fünf MilliliterPIB. Wachsen Sie in einem Shaker-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Nach der Inkubation ein Aliquot der kultivierten PIB-Brühe auf eine vorgewärmte PIA-Platte geben.Mit einem sterilen Zellstreuer, verteilen Sie die Brühe über den Teller und wachsen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Mit einem Pipettenregler und einer sterilen 50-Milliliter-Pipette 0,85% Natriumchlorid auf den erwachsenen Rasen geben und die Probe sammeln, indem sie die Platte mit einem Zellstreuer kratzen. Die Probe mit einer frischen 50-Milliliter-Pipette ansaugen und in ein 50-Milliliter-Sammelrohr geben.Wirbeln Sie die Probe auf hoch zu mischen und legen Sie die Proben auf Eis. Um die OD600 der Proben zu messen, leeren Sie zunächst das Spektralphotometer mit einem Milliliter 0,85% Natriumchlorid. Dann fügen Sie einen Milliliter der Probe zu einer neuen Einweg-Küvette und lesen Sie die OD. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um eine Dreifache der Lesevorgänge für jedes Beispiel zu erhalten.Nun drei Milliliter der Schwefelsäureboratlösung in Kulturröhren geben und auf Eis sitzen lassen. 350 Mikroliter der gesammelten Probe langsam in die Säuremischung in den Reagenzgläsern geben. Nach einem kurzen Wirbeln auf niedrigem Niveau 100 Mikroliter 0,1% Carbazol und Ethanollösung in das Säureprobengemisch geben.Kappen Sie das Rohr und den Wirbel für fünf Sekunden auf der Medium-Einstellung. Dann in einem trockenen Bad bei 55 Grad Celsius für 30 Minuten. Nach der Inkubation die Rohre kurz auf hoch wirbeln und fünf Minuten abkühlen lassen.Verwenden Sie das Rohr mit 0,85% Natriumchlorid als Rohling zum Spektralphotometer. Dann einen Milliliter der Mischung zu einer sauberen Küvette geben und die OD der Proben bei 530 Nanometern auf einem Spektralphotometer lesen. Bereiten Sie eine Standardkurve vor, indem Sie die OD530 der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von d-Mannuronsäure messen.Wiederholen Sie dies zweimal, und extrahieren Sie eine lineare Gleichung aus diesen Messwerten. Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe unter Verwendung der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD600 auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD600 zu erhalten. Mit einer Mikropipette 50 Mikroliter der gesammelten Probe zu einer unbehandelten 96-Well-Platte hinzufügen.Dann 50 Mikroliter ELISA-Beschichtungspuffer in die Brunnen geben. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Mit einer Spritzflasche die Plattenbrunnen zweimal mit PBS-T waschen, indem Sie die Brunnen füllen und dann entleeren, indem Sie die Platte umdrehen.200 Mikroliter Sperrpuffer mit einer Mikropipette in die Brunnen geben und über Nacht bei vier Grad Celsius brüten. Am nächsten Tag den Teller zweimal wie bisher mit PBS-T waschen. Dann 100 Mikroliter verdünnter Primärantikörper in die Brunnen geben und bei 37 Grad Celsius ein bis zwei Stunden brüten.Nach der Inkubation die Plattenbrunnen dreimal wie bisher mit PBS-T waschen. Als nächstes 100 Mikroliter verdünnter Sekundärantikörper in die Brunnen geben und bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden brüten. Nachdem Sie die Platte dreimal wieder gewaschen haben, verwenden Sie eine Mikropipette, um 100 Mikroliter TMB ELISA-Lösung hinzuzufügen.Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln, indem Sie die Platte in eine Schublade legen oder in Folie wickeln. Dann 100 Mikroliter Stop-Lösung hinzufügen. Verwenden Sie einen Plattenleser, um die OD bei 450 Nanometern zu messen.Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die OD450 der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von d-Mannuronsäure messen. Wiederholen Sie die Messungen zweimal, und extrahieren Sie eine lineare Gleichung. Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe mit der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD600 auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD600 zu erhalten.Gezeigt werden hier Proben von PAO581 und PAO581 mit Mutationen in Genen, die Pyrimidin de Novo Biosynthese regulieren, die auf PIA angebaut werden, und PIA, ergänzt mit 0,1 Millimolar Uracil. Die Daten zeigen, dass das Vorhandensein von Uracil in den Medien zur Umwandlung des mutierten Stammes zurück in die Schleimhaut führt, wie die wiederhergestellte Alginatproduktion zeigt. Hier werden Ergebnisse für den monoklonalen Antikörper-basierten Antikörper-basierten Antikörper-Basierten ELISA gezeigt.Kolonien werden auf PIA-Platten mit Arabinose zur Induktion des PBAD-Promotors und des pHERD-20T-Plasmids angebaut. Gezeigt werden PAO1, PAO1 mit dem Expressionplasmid pHERD-20T mit dem wichtigsten Alginat-spezifischen Sigma-Faktor AlgU und PAO1 mit einer In-Frame-Deletion des AlgD-Gens bei der Codierung des wichtigsten Alginat-Biosyntheseenzyms GDP-Mannose-Dehydrogenase. Diese Daten vergleichen die nicht-mukoiden Alginatspiegel, gemessen für PAO1 und PAO1 Delta algD, mit den für PAO1 gemessenen Alginat-Mukoid-Spiegeln mit pHERD-20T algU.Antialginat-ELISA wurde auch an Patienten-Sputum-Proben ohne vorheriges Wachstum auf Platten getestet. Drei CF-Sputumproben mit einem Wachstum von Mukoid P.aeruginosa zeigten nachweisbares Alginat im Vergleich zu zwei Patienten-Sputumproben, die entweder nicht-mukoid P.aeruginosa oder kein P.aeruginosa-Wachstum enthielten. Die Vorbereitung der Standardkurven für die Alginatquantifizierung ist sehr wichtig, da dies eine präzise und genaue Messung von Alginat innerhalb der Probe ermöglicht.Die säurehaltige Lösung, die in der Carbazol-Methode verwendet wird, ist sehr gefährlich, so dass die richtige persönliche Schutzausrüstung und Vorsichtsmaßnahmen verwendet werden müssen, um die Sicherheit zu gewährleisten. Nach der Isolierung von SCVs kann eine weitere genetische Profilierung durchgeführt werden, um auftretende Mutationen und die pathogene Ität, die mit solchen Mutationen verbunden ist, besser zu verstehen. Die ELISA-Methode kann angepasst werden, um chronische Lungeninfektionen bei Patienten mit Mukoviszidose zu überwachen.Darüber hinaus könnte unsere Wachstumsmethode helfen, Infektionen zu diagnostizieren, die durch bestimmte ScVs verursacht werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Mit Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...