Name: culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקים R44GM113545 ו P20GM103434.

1. תנאי צמיחה SCV והפעלה פיזיולוגית של מסלול ההצלה
<ol><li>זיהוי של SCV.<ol>
<li>פס הזנים P. aeruginosa PAO1, PAO1Δpyrd, PAO581, ו PAO581Δpyrd על מקדם התחממות דודימונס בידוד (PIA) צלחות לגדול ב 37 ° c עבור 48 h. על לוחית הצמיחה לזהות בודד מושבה אחת כי יש את SCV הפנוטיפ (גודל המושבה 1-3 מ"מ בניגוד לגודל הרגיל 3-5 מ"מ ?...

<ol>
	<li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis:+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia.">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li><li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li><li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis.">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li><li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection.">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance,+are+hyper-inflammatory,+and+persist+in+multiple+host+environments.">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).</li><li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition.">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li><li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis.">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li><li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+control+of+the+algT+(algU)-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+(AlgN).">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li><li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+AlgU,+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors,+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis.">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li><li>Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Production:+Precursor+Biosynthesis,+Polymerization+and+Secretion.">Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion.</a> Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).</li><li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+alginates:+from+biosynthesis+to+applications.">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li><li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li><li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li><li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine.">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li><li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples.">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li><li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+modification+of+the+carbazole+analysis:+application+to+heteropolysaccharides.">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li></ol>

שניהם scv ו קילוף פלסטיצידיות הם סמנים חשובים מחלות מעורבים זיהומים כרוניים מספר. לכן, את היכולת לגדל scv, כמו גם ללמוד את התקנה וייצור של קילוף פלסטיצידיות על ידי P. aeruginosa הוא אינטגרלי לגילוי של טיפולים חדשניים למחלות כרוניות אלה.
זנים SCV הם לשמצה קשה לגדול עקב שיעור הצמיחה...

דלקות ריאות כרוניות עם הפסאודומונס aeruginosa הם הגורם העיקרי של תחלואה ותמותה אצל חולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF). במהלך הילדות המוקדמת, חולים הם הכובש על ידי פתוגנים חיידקיים מרובים כולל מבודד nonmucoid של P. aeruginosa1,2. הופעתה של משתנה מושבה קטנה (SCV) מבודד, כמו גם mucoid מבודד הוא סמן עבור התחלתה של זיהומים כרוניים. מבודד SCV הם עמידים בפני סמים3 בשל שיעורי צמיחה איטית שלהם4, אשר מספקת להם הרתעה חמורה בחטיבות הטיפול וזיהומים כרוניים אחרים5 על ידי P. aeruginosa. העבודה על ידי Al אחמר ואח '6 הראה קשר בין scv ו-mucoidy מקושר על ידי הביוסינתזה דה נובו pyriine. פירימידין הרעב, בשל מוטציות בגנים המעורבים בייצור פירימידין, הביא את scv פניטיפ ב ההפניה nonmucoid התייחסות PAO1 ואת הנגזרת mucoid, PAO581 (PAO1mucA25).
אף-על-פי ייצור יתר של קילוף פלסטיצידיות הוא סמן מחלה חשובה עבור זיהומים ריאה כרונית ב-CF, לא ברור אם יש קורלציה ישירה בין כמות קילוף פלסטיצידיות פתולוגיה ריאות, וזה לא ברור אם קילוף פלסטיצידיות ניתן להשתמש כסמן פרוגנוזה לטיפול7. הייצור alginate מוסדר בעיקר על ידי שני operons, מעבד רגולציה (algumucabcd)8,9 ו הביו סינתטי המבצע (algd operons)10,11. הייצור alginate מוסדר בחוזקה על ידי פקטור סיגמא algu9,12 (הידוע גם בשם algt) והשפלה של הגורם האנטי סיגמא מוקה13. היכולת לפקח על ייצור קילוף פלסטיצידיות באתרו של המטופלים ' הרוק דגימות יכול לסייע בפיתוח של אפשרויות טיפוליות הרומן.
כאן, אנו מתארים מצב גדילה המזהה את נוכחותו של scv הנגרמת על ידי מוטציות שאינן יכולות לסנתז את פירימידין דה נובו. תוספת של אורציל ו/או ציטוסינוס, בסיס ניטרוגליצרין של פירימידין נוקלאוטיד, למדיום מפעיל את מסלול ההצלה, ובכך לשקם את הצמיחה הנורמלית של המוטציות. זו שיטת הצמיחה עבור אלה מוטציות scv ספציפיות ניתן להשתמש כשיטת הקרנה כדי לזהות מוטציות פירימידין בדגימות החולה. בנוסף, אנו דנים בשתי שיטות לאיתור ומדידה של קילוף פלסטיצידיות המיוצר ומופרש על ידי P. aeruginosa. הראשונה היא השיטה המסורתית14,15,16 משפילה את הפוליסכד באמצעות ריכוז גבוה של חומצה ולאחר מכן הוספת מחוון הצביעה כדי לכמת את הריכוז במדגם. השיטה השנייה, שפותחה במעבדה שלנו, מנצלת את היישום החיסוני הקשור לאנזימים (אליסה) באמצעות נוגדן חד-שבטיים אנטי-אלגיאט (mAb) שפותח על ידי QED ביולוגיה. השיטה אליסה מוכיחה להיות ספציפי יותר ורגיש יותר מאשר שיטת חומצה אוראונית ומאפשר שימוש בטוח יותר בשל הימנעות של חומצה גופרתית מרוכזת מאוד. עם היכולת של ה-אליסה לשמש ישירות על דגימות החולה רוק למדוד קילוף פלסטיצידיות, זה יכול להיות מפותח ככלי אבחון ניטור לעקוב אחר כמות קילוף פלסטיצידיות נוכח הריאות בתקופות שונות של הזיהום.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Bio-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plates 96-well</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>2021-12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette Polystyrene (1.5 ml)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>71-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannuronic Acid Sodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMB00280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMC Alginate</td>
			<td>FMC</td>
			<td>2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>For Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody</td>
			<td>QED Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lot # :15725/15726</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Toothpicks</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaweed alginate (Protanal CR 8133)</td>
			<td>FMC Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>232100</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>i3x</td>
			<td>or preferred vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A298-212</td>
			<td>Technical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>DY994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>66-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of small colony variant of pseudomonas aeruginosa and quantitation of its alginate

פסאודומונס aeruginosa, פתוגן שלילי גרם-שלילית, יכול לייצר יתר על כך התוצאה היא פנוטיפ ייחודי הנקרא מוסטיידי. Alginate מקושר זיהומים ריאה כרונית וכתוצאה מכך פרוגנוזה גרועה אצל חולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF). הבנת מסלולים כי לווסת את הייצור של קילוף פלסטיצידיות יכול לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות הרומן מיקוד היווצרות קילוף פלסטיצידיות. עוד פנוטיפ הקשורות למחלות הוא משתנה המושבה הקטנה (SCV). SCV הוא בשל הצמיחה האיטית של חיידקים, הקשורים לעתים קרובות עם עמידות מוגברת antimicrobials. במאמר זה, אנו הראשון להראות שיטה של culturing טופס מוגדר גנטית של P. aeruginosa scv בשל המוטציות הביוסינתזה של פיקנוmidine. תוספי בסיסים ניטרוני, אורציל או ציטוסין, מחזירה את הצמיחה הנורמלית למוטציות אלה, הפגנת נוכחות של מסלול הצלה הscavenges בסיסים חינם מהסביבה. לאחר מכן, אנו דנים בשתי שיטות למדידת האלגיאט חיידקי. השיטה הראשונה מסתמכת על ההידרוליזה של הפוליסכד לתוך החומצה האוריונית שלה ולאחריו בעקבות השפעת מגיב כרומוגניים, קרזולה, בעוד השיטה השנייה משתמשת ב-אליסה בהתבסס על מסחרית זמין, alginate ספציפי ספציפיים. שתי השיטות דורשות עקומה סטנדרטית לכימות. כמו כן, אנו מראים כי השיטה החיסונית היא ספציפית לכמת וניתן להשתמש בה למדידת האלגיאט בדגימות הקליניות.

איור 1 מציג צלחות של PAO1 ו PAO581 עם או בלי מחיקה מסגרת ב- pyrd גן (גן בשביל הביוסינתזה פירימידין) שתוצאתו scv6. המוטציה scv PAO1 שוחזר לצמיחה נורמלית בתגובה לתוספת אורציל (איור 1א, ב). יתר על כן, המוטציה scv PAO581Δpyrdהוחזרה מול?...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate at JoVE.com

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

כאן, אנו מתארים מצב גדילה לתרבות המשתנה המושבה הקטנה של הפסאודומונס aeruginosa. כמו כן, אנו מתארים שתי שיטות נפרדות לאיתור וכימות של הייצור המיוצר על ידי P. aeruginosa באמצעות חומצה אוראלה מסורתי בזולה ומעין נוגדן חד-שבטיים ספציפי קילוף פלסטיצידיות (mab) מבוסס אליסה.

תרבות של וריאציה של המושבה הקטנה של הפסאודומונס וככמת של האלגיאט

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

גרסה מושבה קטנה או טכניקת SCV מאפשר בחירה וצמיחה של גרסאות מושבה קטנות של פסאודומונס aeruginosa. השיטה היא מאוד סופית ומאפשרת בחירה קלה יותר מאשר שיטות רגילות. פרוטוקול זה מפרט גם שיטת ELISA בטוחה ורגישה יותר לכימות אלגינט בהשוואה לשיטה הסטנדרטית של חומצה אונית קרבזול, המאפשרת כימות אלגינט ישיר בדגימות ללא צרוב או מניפולציה לדוגמה.הדגימו את ההליך יהיו ברנדון קירבי, טכנאי מעבדה, ורוי אל אחמר, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לזהות את גרסה המושבה הקטנה או SCV, הראשון פס זן P.aeruginosa PAO1 דלתא PYRD על לוחות PIA מחומם מראש. לגדל את הזנים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.על לוחית הגדילה, זהה מבודד מושבה אחת שיש לו פנוטיפ SCV המאופיין בגודל מושבה של 1 עד 3 מילימטרים לעומת גודל המושבה הרגיל של שלושה עד חמישה מילימטרים. רצף מחדש של המושבות שנבחרו כדי להשיג בידוד טהור של ה- SCV. כדי לבצע הפעלה פיזיולוגית של מסלול ההצלה, השתמש בלולאת חיסון סטרילית כדי לבחור את מושבת SCV מצלחת ה- PIA.פס המושבה שנבחרה על צלחת PIA מחוממת מראש בתוספת 0.1 מילימולרס uracil. לגדל את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 עד 48 שעות. כדי להתחיל את מבחן החומצה האורית קרבזולה, לזהות מושבה אחת מתרבות טהורה של הזן הרצוי להיבדק ולבחור את המושבה באמצעות קיסם סטרילי.מניחים את הקיסם במבחנה תרבותית המכילה חמישה מיליליטר של PIB. לגדול באינקובטור שייקר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר הדגירה, הוסיפו אליקוט של מרק PIB מתורבת על צלחת PIA מחוממת מראש.באמצעות מפזר תאים סטרילי, להפיץ את המרק על הצלחת לגדול ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. באמצעות בקר פיפטה ופיפט סטרילי 50 מיליליטר, להוסיף 0.85% נתרן כלורי למדשאת המבוגרים ולאסוף את המדגם על ידי גירוד הצלחת באמצעות מפזר תאים. שאף את הדגימה באמצעות פיפטה טרייה של 50 מיליליטר והעבר לצינור איסוף של 50 מיליליטר.Vortex המדגם על גבוה לערבב ול למקם את הדגימות על קרח. כדי למדוד את OD600 של הדגימות, תחילה ריק ספקטרופוטומטר באמצעות מיליליטר אחד של 0.85% נתרן כלורי. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של המדגם כדי cuvette חד פעמי חדש ולקרוא את OD. חזור על שלב זה פעמיים כדי לקבל שלם של קריאות עבור כל מדגם.עכשיו להוסיף שלושה מיליליטר של חומצה גופרתית borate פתרון לתוך צינורות תרבות ולתת לשבת על קרח. מוסיפים 350 מיקרוליטרים של הדגימה שנאספה לאט לתערובת החומצה במבחנות. לאחר מערבולת קצרה על נמוך, להוסיף 100 microliters של 0.1% carbazole ותסכול אתנול לתערובת דגימת חומצה.מכסים את הצינור והמערבולת על ההגדרה הבינונית למשך חמש שניות. לאחר מכן מניחים באמבטיה יבשה ב 55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, מערבולת הצינורות לזמן קצר על גבוה ולאפשר להתקרר במשך חמש דקות.השתמש בצינור עם 0.85% נתרן כלורי כריק לספקטרופוטומטר. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של התערובת כדי cuvette נקי ולקרוא את OD של הדגימות ב 530 ננומטר על ספקטרופוטומטר. הכן עקומה סטנדרטית על ידי מדידת OD530 של דילול סדרתי של ריכוזים ידועים של חומצה d-mannuronic.חזור פעמיים וחלץ משוואה ליניארית מקריאות אלה. לחשב את הריכוז של alginate בכל מדגם באמצעות העקומה הסטנדרטית ולחלק את ריכוז alginate משוואה ליניארית על ידי OD600 כדי לקבל את הכמות הכוללת של alginate לכל OD600. בעזרת מיקרופיגט, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של הדגימה שנאספה לצלחת לא מטופלת של 96 בארות.לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מאגר ציפוי ELISA ל בארות. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. באמצעות בקבוק להשפריץ, לשטוף את בארות הצלחת פעמיים עם PBS-T על ידי מילוי בארות ולאחר מכן לנקז אותם על ידי היפוך הצלחת מעל.מוסיפים 200 מיקרוליטרים של חיץ חסימה ל בארות עם מיקרופיפט ודגירה בארבע מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, לשטוף את הצלחת פעמיים עם PBS-T כמו קודם. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני מדולל ל הבארות ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים.לאחר הדגירה, לשטוף את בארות הצלחת שלוש פעמים עם PBS-T כמו קודם. לאחר מכן, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של נוגדן משני מדולל ל הבארות ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים. לאחר שטיפת הצלחת שוב שלוש פעמים, השתמש micropipette להוסיף 100 microliters של פתרון TMB ELISA.הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך על ידי הנחת הצלחת לתוך מגירה או לעטוף בנייר כסף. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון עצירה. השתמש בקורא לוחות כדי למדוד את ה- OD ב- 450 ננומטר.לייצר עקומה סטנדרטית על ידי מדידת OD450 של דילול סדרתי של ריכוזים ידועים של חומצה d-mannuronic. חזור על המידות פעמיים וחלץ משוואה ליניארית. לחשב את הריכוז של alginate בכל מדגם באמצעות העקומה הסטנדרטית ולחלק את ריכוז alginate מהמשוואה ליניארית על ידי OD600 כדי לקבל את הכמות הכוללת של אלגינט לכל OD600.מוצגות כאן דגימות של PAO581 ו PAO581 עם מוטציות בגנים המסדירים פירמידין דה נובו biosynthesis גדל על PIA ו PIA בתוספת 0.1 מילימולר של uracil. הנתונים מראים כי נוכחות של uracil בתקשורת תוצאות ההמרה של זן המוטנטים בחזרה רירי כפי שניתן לראות על ידי ייצור אלגינט משוחזר. כאן, התוצאות מוצגות עבור ELISA נוגדן חד שבטי אנטי אלגינט מבוסס.מושבות גדלות על לוחות PIA עם arabinose עבור אינדוקציה של מקדם PBAD ואת פלסמיד pHERD-20T. מוצגים PAO1, PAO1 נושאת את הביטוי פלסמיד pHERD-20T עם alginate הראשי ספציפי גורם סיגמא algU, ו PAO1 עם מחיקה בתוך מסגרת של הגן algD בקידוד האנזים הביוסינתטי אלגינט מפתח GDP-mannose דהידרוגנאז. נתונים אלה משווים את רמות האלגינט הלא-ררית הנמדדות עבור PAO1 ו- PAO1 delta algD לעומת רמות הררית של אלגינט הנמדדות עבור PAO1 עם pHERD-20T algU.ELISA אנטי אלגינט נבדק גם על דגימות כיחום החולה ללא צמיחה מוקדמת על צלחות. שלוש דגימות כיח CF כי היה צמיחה של P.aeruginosa ריר הראה אלגינט לזיהוי לעומת שתי דגימות כיח החולה שהכילו גם P.aeruginosa שאינו ררית או לא צמיחה P.aeruginosa. הכנת העקומות הסטנדרטיות לכמיית האלגינט היא קריטית מאוד גם ותאפשר מדידה מדויקת ומדויקת של אלגינט בתוך המדגם.פתרון החומצה המשמש בשיטת קרבזולה מסוכן מאוד ולכן יש להשתמש בציוד מגן אישי ואמצעי זהירות נאותים כדי להבטיח בטיחות. לאחר בידוד SCVs, פרופיל גנטי נוסף יכול להיעשות כדי להבין טוב יותר מוטציות המתרחשות ואת הפתוגניות הקשורים מוטציות כאלה. ניתן להתאים את שיטת ELISA לניטור זיהום ריאות כרוני בחולים עם סיסטיק פיברוזיס.יתר על כן, שיטת הצמיחה שלנו יכולה לעזור לאבחן זיהומים הנגרמים על ידי SCVs ספציפיים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; שימוש מיני<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesis תיווך transposon מרינר

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...